Tạo cây lúa chuyển gen mang mirna nhân tạo ức chế đặc hiệu gen mục tiêu MPG1 của nấm đạo ôn magnaporthe grisea

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------ ------ PHAN THỊ HƯƠNG TẠO CÂY LÚA CHUYỂN GEN MANG MIRNA NHÂN TẠO ỨC CHẾ ðẶC HIỆU GEN MỤC TIÊU MPG1 CỦA NẤM ðẠO ÔN MAGNAPORTHE GRISEA LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------ ------ PHAN THỊ HƯƠNG TẠO CÂY LÚA CHUYỂN GEN MANG MIRNA NHÂN TẠO ỨC CHẾ ðẶC HIỆU GEN MỤC TIÊU MPG1 CỦA NẤM ðẠO ÔN MAGNAPORTHE GRISEA CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS. TS. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO HÀ NỘI - 2013 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ học vị nào. Tôi xin cam ñoan giúp ñỡ cho việc thực luận văn ñã ñược cảm ơn thông tin trích dẫn ñã ñược ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Phan Thị Hương Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Thị Phương Thảo, Trưởng khoa Công nghệ sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, người ñã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, tạo ñiều kiện cho ñược học tập, làm việc thực luận văn môn Công nghệ sinh học thực vật. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô cán công tác môn Công nghệ sinh học thực vật - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ, ñộng viên tạo ñiều kiện cho thực ñề tài phòng thí nghiệm. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy PGS. TS. Nguyễn Văn Viên, TS. Hà Viết Cường ñã tận tình giúp ñỡ suốt trình học tập nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh ñạo Trung tâm Khảo nghiệm Khuyến nông Khuyến ngư ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho hoàn thành luận văn này. Với tất lòng biết ơn, xin cảm ơn gia ñình bố mẹ anh chị, người ñã tin tưởng, ñộng viên, khích lệ nguồn ñộng lực giúp học tập làm việc. Cuối cùng, xin cảm ơn bạn bè ñã quan tâm, chia sẻ, giúp ñỡ suốt trình học tập sống. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày .tháng năm 2013 Tác giả Phan Thị Hương Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục kí hiệu, chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình ix MỞ ðẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát lúa 1.2 Biến ñổi khí hậu bệnh ñạo ôn lúa. 1.2.1 Biến ñổi khí hậu 1.2.2 Bệnh ñạo ôn lúa 1.3 Phân tích di truyền gen kháng bệnh ñạo ôn lúa 1.4 Phân tích genome nấm ñạo ôn công nghệ RNAi phòng chống bệnh ñạo ôn lúa 13 1.4.1 Phân loại nấm ñạo ôn 13 1.4.2 Phân tích genome nấm ñạo ôn 14 1.4.3 Công nghệ RNAi ứng dụng phòng chống bệnh ñạo ôn. 15 1.5 Ứng dụng trồng biến ñổi gen thực trạng nghiên cứu chuyển gen vào lúa 22 1.5.1 Ứng dụng trồng biến ñổi gen 22 1.5.2 Nghiên cứu chuyển gen vào lúa giới 23 1.5.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào lúa Việt Nam 26 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 29 iv 2.1 Vật liệu nghiên cứu 29 2.1.1 Vật liệu thực vật 29 2.1.2 Chủng vi khuẩn A.tumefaciens 29 2.1.3 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 30 2.2 ðịa ñiểm thời gian nghiên cứu 30 2.2.1 ðịa ñiểm nghiên cứu 30 2.2.2 Thời gian nghiên cứu 30 2.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Khảo sát khả tái sinh số giống lúa Indica Japonica Việt Nam 30 2.3.2 Xác ñịnh ảnh hưởng kháng sinh ñến sinh trưởng mô sẹo. 33 2.3.3 Chuyển vector mang pre-amiR-P1 nhân tạo ức chế gen MPG1 nấm ñạo ôn (M.grisea) vào lúa vi khuẩn A.tumefaciens. 34 2.3.4 Phân tích chuyển gen PCR 36 2.3.5 ðánh giá sinh trưởng, phát triển 22 dòng lúa chuyển gen trồng chậu vại nhà lưới 38 Phương pháp xử lý số liệu 38 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 2.4 3.1 Khảo sát khả tái sinh số giống lúa Indica Japonica trồng Việt Nam 39 3.1.1 Khảo sát khả cảm ứng tạo mô sẹo số giống lúa 40 3.1.2 Khảo sát khả tái sinh từ mô sẹo số giống lúa 44 3.2 Xác ñịnh ảnh hưởng kháng sinh ñến sinh trưởng mô sẹo. 49 3.3 Chuyển vector pPS1-pre-amiR-P1 vào lúa vi khuẩn 3.4 A.tumefaciens 50 Phân tích chuyển gen PCR 58 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 3.4.1 Kiểm tra có mặt promoter 2x35S 22 dòng lúa J02 chuyển gen 3.3.2 3.5 58 PCR kiểm tra có mặt gen chuyển pre-amiR-P1 22 dòng lúa J02 chuyển gen 59 Sinh trưởng, phát triển 22 dòng lúa chuyển gen chậu vại 59 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 61 Kết luận 61 ðề nghị 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 69 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Kí hiệu, chữ viết tắt Từ viết tắt amiRNA Artificial microRNA - microRNA nhân tạo B5 Môi trường Gamborg (1963) BA 6-Benzyl Amino purine BðKH Biến ñổi khí hậu Bp Base pair- Cặp bazơ CIRAD French Agricultural Research Centre for International Development – Trung tâm nghiên cứu phát triển nông nghiệp Pháp Cs Cộng GMO Genetically Modified Organism - sinh vật biến ñổi gen Kb Kilo base 10 miRNA microRNA 11 MS Môi trường Murashige Skoog (1962) 12 N6 Môi trường Chu cộng (1975) 13 Nts Nucleotides 14 α-NAA α-Napthalene acetic acid 15 PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp 16 QTL Quantitative trait loci - Di truyền tính trạng số lượng 17 RISC RNA Inducing Silencing Complex - Phức hợp làm câm cảm ứng RNA 18 RNAi RNA interfering - RNA tương tác 19 sRNA Small RNA – RNA kích thước nhỏ 20 siRNA Small interfering RNA - RNA can thiệp kích thước nhỏ 21 shRNA Short hairpin RNA - RNA kẹp tóc 22 T-DNA Transfer DNA 23 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Danh sách giống lúa sử dụng nghiên cứu 29 2.2 Một số ñặc ñiểm trình tự miRNA ñã thiết kế 30 2.3 Công thức môi trường khảo sát khả tạo mô sẹo 32 2.4 Các công thức môi trường khảo sát khả tái sinh 33 2.5 Các công thức thời gian lây nhiễm dịch khuẩn với mô sẹo 35 2.6 Một số ñặc ñiểm cặp mồi nhân gen pre-amiR-P1 37 3.1 Tỷ lệ hình thành mô sẹo số giống lúa (%) 40 3.2 Ảnh hưởng môi trường ñến khả tái sinh mô sẹo sau tuần nuôi cấy 3.3 Ảnh hưởng kháng sinh chọn lọc kanamycin ñến sinh trưởng mô sẹo sau tuần nuôi cấy 3.4 45 49 Kết chuyển gen vào mô sẹo tuần tuổi (3W) tuần tuổi (6W) giống J02 51 Kết chuyển gen vào mô sẹo tuần tuổi giống HC 52 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii 3.5 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Triệu chứng bệnh ñạo ôn 3.1 Tỷ lệ hình thành mô sẹo số giống lúa 41 3.2 Hình thái mô sẹo sơ cấp tuần tuổi giống 43 3.3 Hình thái mô sẹo thứ cấp tuần tuổi giống J02 HC 43 3.4 Ảnh hưởng môi trường ñến khả tái sinh mô sẹo 47 3.5 Cây tái sinh giống BC15 môi trường RM1 47 3.6 Hình ảnh tái sinh giống lúa J02 HC giai ñoạn 48 3.7 Hình ảnh lây nhiễm dịch khuẩn với mô sẹo giống J02 (bên trái) HC (bên phải) 55 3.8 Hình ảnh mô sẹo giai ñoạn ñồng nuôi cấy 55 3.9 Một số hình ảnh mô sẹo giai ñoạn chọn lọc 56 3.10 Cây chuyển gen tái sinh giống J02 56 3.11 Cây tái sinh bị bạch tạng giống HC 56 3.12 Quy trình chuyển gen vào mô sẹo tuần tuổi giống J02 vi khuẩn Agrobacterium 3.13 Kết kiểm tra có mặt promoter 2x35S 22 dòng lúa J02 chuyển gen 3.14 3.15 57 58 Kết kiểm tra có mặt gen chuyển pre-amiR-P1 22 dòng lúa chuyển gen 59 Hình ảnh số dòng lúa chuyển gen trồng chậu vại 60 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix có khả sinh trưởng môi trường có chứa kanamycin. Tuy nhiên, ñể khẳng ñịnh có mặt gen chuyển cây, dòng tái sinh ñược kiểm tra có mặt promoter 2x35S gen chuyển pre-amiR-P1 sử dụng cặp mồi ñặc hiệu. 3.4. Phân tích chuyển gen PCR Mẫu 22 dòng lúa J02 chuyển gen ñược thu sau trồng 15 ngày ñể chiết tách DNA tổng số theo quy trình CTAB cải tiến Shahzadi cs (2010). Kết thu ñược DNA tổng số tinh sử dụng cho phản ứng PCR kiểm tra có mặt gen chuyển. 3.4.1. Kiểm tra có mặt promoter 2x35S 22 dòng lúa J02 chuyển gen Phản ứng PCR ñược tiến hành ñể phát có mặt promoter 2x35S ñược thiết kế nằm cấu trúc vector chuyển vào cặp mồi ñặc hiệu nhằm nhân ñoạn sản phẩm có kích thước 490bp 162bp. Sự có mặt promotor 2x35S ñồng nghĩa với việc có mặt gen chuyển cây. Kết kiểm tra PCR dòng chuyển gen ñều nhân ñược hai vạch sản phẩm mục tiêu ñúng kích thước 490 162Nts (Hình 3.13). Như kết luận 22 dòng ñều mang promoter 2x35S. Hình 3.13. Kết kiểm tra có mặt promoter 2x35S 22 dòng lúa J02 chuyển gen Ghi chú: ðC+: ðối chứng (+) vector pPS1-pre-amiR-P1, ðC-1: H2O, ðC2: DNA lúa J02 không chuyển gen, 1-22: kí hiệu dòng chuyển gen Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 58 3.3.2. PCR kiểm tra có mặt gen chuyển pre-amiR-P1 22 dòng lúa J02 chuyển gen Phản ứng PCR ñược tiến hành sử dụng cặp mồi ñặc hiệu nhằm nhân ñoạn gen mục tiêu kích thước 174bp. Kết thu ñược sản phẩm mục tiêu có kích thước 174bp 22 dòng lúa J02 chuyển gen (Hình 3.14). Như khẳng ñịnh chắn dòng lúa ñều mang gen mục tiêu ñược chuyển vào. Hình 3.14. Kết kiểm tra có mặt gen chuyển pre-amiR-P1 22 dòng lúa chuyển gen Ghi chú: ðC+: ðối chứng (+) vector pPS1-pre-amiR-P1, ðC-1: H2O, ðC2: DNA lúa J02 không chuyển gen, 1-22: kí hiệu dòng chuyển gen 3.5. Sinh trưởng, phát triển 22 dòng lúa chuyển gen chậu vại Kết kiểm tra phương pháp PCR cho thấy 22 dòng lúa J02 ñều mang gen chuyển. Các dòng lúa chuyển gen ñều có hình thái, ñặc ñiểm nông sinh học bình thường ñiều kiện in vitro. Tuy nhiên, ñể ñánh giá khả sinh trưởng, phát triển 22 dòng lúa chuyển gen ñiều kiện in vivo ñã tiến hành trồng chuyển gen chậu ñặt nhà lưới từ ngày 13/06. Do ảnh hưởng nhiệt ñộ cao giai ñoạn ñầu nên số dòng chuyển gen ñối chứng không chuyển gen bị chết. Các dòng chuyển gen lại sinh trưởng, phát triển bình thường (Hình 3.15). Các chuyển gen có chiều cao trung bình từ 95 – 105 cm, dạng hình gọn, ñẻ nhánh khá, góc hẹp, cứng cây, bắt ñầu trỗ ngày 03/09, kết thúc trỗ ngày 08/09. Dự kiến thu hoạch ngày 05/10/2013. Thời gian sinh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 59 trưởng dòng chuyển gen dự kiến khoảng 110 – 115 ngày. ðây thời gian sinh trưởng lúa J02 bình thường ñồng ruộng ñiều kiện vụ mùa theo kết khảo nghiệm Trung tâm Chuyển giao công nghệ & khuyến nông (Viện Khoa học Nông nghiệp VN). Như vậy, kết luận dòng chuyển gen sinh trưởng, phát triển bình thường ñiều kiện trồng trọt nhà lưới. Hình 3.15. Hình ảnh số dòng lúa chuyển gen trồng chậu vại Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 60 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ Kết luận Dựa kết thu ñược trình nghiên cứu rút số kết luận sau: - Yếu tố giống có ảnh hưởng lớn ñến khả cảm ứng tạo mô sẹo tái sinh cây. Trong giống nghiên cứu, giống J02 có khả tạo mô sẹo tái sinh tốt nhất. Tỷ lệ mô sẹo ñạt 98% môi trường N2. - Môi trường tạo mô sẹo tốt cho giống japonica nghiên cứu giống Hương cốm môi trường N2 gồm N6 + vitamin B5, 100mg/l Myoinositol, 500mg/l L-proline, 500mg/l L-glutamin, 300mg/l casein hydrolysate, 30g/l ñường, 8g/l agar, 3mg/l 2,4-D, pH= 5.8. - Môi trường tái sinh tốt ñối với giống Hương cốm J02 môi trường RN1 gồm N6 + vitamin B5, 100mg/l Myo-inositol, 500mg/l Lproline, 500mg/l L-glutamin, 300mg/l casein hydrolysate, 3mg/l BAP, 1mg/l NAA, 30g/l ñường, 8g/l agar, pH= 5.8. Giống J02 tái sinh tốt giống nghiên cứu, số chồi tái sinh/cụm mô sẹo trung bình ñạt 16,33 chồi. - ðã xây dựng ñược quy trình chuyển gen vào mô sẹo tuần tuổi giống lúa J02 thông qua vi khuẩn Agrobacterium. Hiệu suất chuyển gen ñạt 3,25% thời gian lây nhiễm 10 phút. ðã thu ñược 22 dòng lúa J02 mang gen chuyển ñược kiểm tra PCR với hình thái ñặc ñiểm nông sinh học bình thường ñiều kiện in vitro trồng chậu vại. ðề nghị Do thời gian thực ñề tài hạn chế nên việc phân tích chuyển gen chưa kịp thực hiện. ðể ñánh giá hiệu ức chế gen MPG1 nấm M. grisea mang cấu trúc miRNA ñã thiết kế, ñề nghị tiếp tục tiến hành công việc sau: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 61 - Thu hạt dòng lúa chuyển gen tiến hành lây nhiễm nhân tạo với chủng nấm ñạo ôn cho mọc từ hạt ñể ñánh giá khả kháng bệnh 22 dòng lúa chuyển gen. - Nếu thu ñược dòng có biểu mức ñộ kháng bệnh khác nhau, tiến hành phân tích phân tử ñối với dòng này, bao gồm: + Phân tích Southern blot xác ñịnh tổ hợp ổn ñịnh gen chuyển mang trình tự pre-amiRNA-P1 genome cây. + Phân tích biểu gen pre-amiRNA-P1 dòng lúa chuyển gen kỹ thuật Northern blot realtime PCR. - Tiến hành test kiểm tra hấp thu miRNA từ nguồn chuyển gen kháng bệnh tổng hợp in vitro nấm ñạo ôn ñể xác ñịnh thay ñổi mặt hình thái chức nấm mức ñộ biểu gen gây bệnh mục tiêu MPG1 nấm. Các phương pháp phân tích thực theo Van de Caraen, 2006 2010. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1.“Báo cáo kết thực kế hoạch 12 tháng năm 2012 ngành Nông nghiệp phát triển nông thôn”, Trung tâm Tin học Thống kê – Bộ Nông nghiệp PTNT. 2.Bùi Chí Bửu, Nghiên cứu tình lúa (Oryza sativa L.), tr1 – 14 https://www.iasvn.org/upload/files/3L1Q08SSFKCNSH-BVTV.pdf 3.Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn Tú, Phạm Xuân Hội (2009), Phân lập chuyển GEN ñiều khiển chịu hạn MTOSDREB2A vào giống lúa chành trụi thông qua Agrobacterium, Tạp chí Sinh học 31(2): 79-88 4.ðoàn Thu Thủy, Trương Quốc Cần, N Baiskh, O Normal, SW Datta (2008), Kết chuyển gen gus vào lúa với ñiều khiển promoter khác nhau, Tạp chí Công nghệ sinh học 6(3):321-326. 5.Nguyễn Thị Lang, Bùi chí Bửu (2003), Áp dụng thị phân tử chọn giống lúa kháng bệnh ñạo ôn. Hội thảo quốc gia: Bệnh Sinh học phân tử, HAU, 2325/10/2003, Hà Nội. Tr 55-60 6.Nguyễn Hữu Tề cộng sự, (1997), Cây lúa. Giáo trình lương thực. Tập 1, Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội. 7.Nguyễn Thị Hồng Châu (2003), Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens vào giống lúa C71 , Tạp chí Công nghệ sinh học (2):219-216. 8.Nguyễn Thị Lang, Bùi chí Bửu (2002), “Chọn giống lúa có gen kháng bệnh ñạo ôn nhờ marker phân tử”, Cơ sở di truyền tính kháng sâu bệnh hại trồng. Nhà XB Nông nghiệp. Tr 183-195. 9.Nguyễn Thị Thanh Nga, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thị Vân, Nguyễn Tường Vân2, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2012), Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào Dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.), Tạp chí sinh học 34(3): 389-396 10. Nguyễn Văn Hoan (2006), Cẩm nang lúa, NXB Lao ñộng, 385tr 11. Phan Hữu Tôn (2004), Khả chống bệnh ñạo ôn (Pyricularia oryzae) Bắc Việt Nam ñặc ñiểm nông sinh học số dòng lúa chứa gen chống bệnh, Tạp chí KHKT ông nghiệp. Tập số 1/2004 12. Phan Thị Thu Hiền (2012), Khả tạo callus tái sinh tập ñoàn 31 giống lúa nương miền Bắc Việt Nam phục vụ công tác chuyển gen, Tạp chí Khoa học Phát triển 2012. Tập 10, số 4: 567-575 13. Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình Bệnh chuyên khoa, Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 14. Ballini E., J.B. Morel, G. Droc, A. Price, B. Courtois, J.L. Notteghem, D. Tharreau (2008), A genome-wide meta-analysis of rice blast resistance genes and quantitative trait loci provides new insights into partial and complete resistance, Mol. Plant Microbe Interact 21, 859–868. 15. Bartel B. and Bartel D. (2003), MicroRNAs: at the root of plant development?, Plant Physiol. ,132(2), 709–717. 16. Prasad Bishun Deo , Sanjay Jha, Bharat Bhushan Chattoo (2008), Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 63 Transgenic indica rice expressing Mirabilis jalapa antimicrobial protein (Mj-AMP2) shows enhanced resistance to the rice blast fungus Magnaporthe grisea, Plant Science, 175(3), 364–371. 17. 18. 19. 20. Bui Chi Buu, Nguyen Thi Lang (2003), Application of molecular markers in rice breeding in the Mekong Delta of Vietnam, In Advances in Rice Genetics, IRRIPhilippines, 216-220. CiRAD, Agrobacterium – mediated production of transgenic Japonica rice plants, French Agricultural Research Centre for International Development. Couch BC. and Kohn LM. (2002), A multilocus gene genealogy concordant with host preference indicates segregation of a new species, Magnaporthe oryzae, from M. grisea, Mycologia 94, 683–693. Covey S., Al-Kaff N., Lángara A., Turner D. (1997), Plants combat infection by gene silencing, Nature, 385(6619), 781–782. 21. Dean RA., NJ. Talbot, DJ. Ebbole, ML. Farman, TK. Mitchell, MJ. Orbach, M. Thon, R. Kulkarni, JR. Xu, H. Pan, ND. Read, YI. Lee, I. Carbone, D. Brown, YO. Yeon, N. Dofobrio, SJ. Jun, DN. Soanes, S. Djonovic, E. Kolomiets, C. Rehmeyer, W. Li, M Harding, S. Kim, MH. Lebrun, H. Bohnert, S. Coughlan, J. Butler, S. Calvo, LJ. Ma, R. Nicol, S. Purcell, C. Nusbaum, JE. Galagan, BW. Birren (2005), The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea, Nature 434, 980986. 22. Elbashir S.M., Harborth J., Lendeckel W., Yalcin A., Weber K., and Tuschl T. (2001), Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature 411, 494-498. Fire A., Xu S., Montgomery M., Kostas S., Driver S., Mello C. (1998), Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans, Nature 391 (6669), 806–811. Fukuoka S., K. Okun (2000), QTL analysis and mapping of pi21, a recessive gene for field resistance to rice blast in Japanese upland rice, Theor Appl Genet 103, 185–190. Gavilano L., Coleman N., Burnley L., Bowman M., Kalengamaliro N., Hayes A., Bush L., Siminszky B. (2006), Genetic engineering of Nicotiana tabacum for reduced nornicotine content. J Agric Food Chem 54 (24), 9071–9078. Gowda M., S. Roy-Barman, B. B. Chattoo (2006), Molecular mapping of a novel blast resistance gene Pi38 in rice using SSLP and AFLP markers. Plant Breeding, 125 (6), pp. 596–599. 23. 24. 25. 26. 27. Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T. (1994), Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA, Plant J., 6(2), 271-82. 28. Hiei Y, Komari T (2006), Improved protocols for transformation of indica rice mediated by Agrobacterium tumefaciens, Plant Cell Tiss Org Cult 85, 271–283. Hiroshi, Chang-Jie J. and Shoji S. (2010), Salicylic Acid Signaling Pathway in Rice and the Potential Applications of Its Regulators, JARQ 44 (3), 217−223. Jeon J., J. Goh, J.Yoo, S. Chi, M.H. Choi, J. Rho, H.S. Park, J. Han, S.S. Kim, B.R. Park, S.Y. Kim, S. Lee (2004), A Fungal Metallothionein Is Required for Pathogenicity of Magnaporthe grisea, The Plant Cell 16, 1575–1588. Jeon J., Jaeduk Goh, Sungyong Yoo, Myoung-Hwan Chi, Jaehyuk Choi, Hee-Sool 29. 30. 31. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 64 Rho, Jongsun Park, Seong-Sook Han, Byeong Ryun Kim, Sook-Young Park, Soonok Kim, and Yong-Hwan Lee (2008), A Putative MAP Kinase Kinase Kinase, MCK1, Is Required for Cell Wall Integrity and Pathogenicity of the Rice Blast Fungus, Magnaporthe oryzae, The American Phytopathological Society 21 (5), pp. 525–534. 32. Jeung JU., Kim BR., Cho YC., Han SS., Moon HP., Lee YT., Jena KK. (2007), A novel gene, Pi40(t), linked to the DNA markers derived from NBS-LRR motifs confers broad spectrum of blast resistance in rice, Theor Appl Genet. 115(8):1163-77. 33. Kadotani Naoki, Hitoshi Nakayashiki, Yukio Tosa, and Shigeyuki Mayama, (2003), RNA Silencing in the Phytopathogenic Fungus Magnaporthe oryzae, MPMI, 16(9), 769–776. Datta Karabi, Swapan Kumar Datta (2006), Indica Rice (Oryza sativa, BR29 and IR64), Book Title: Agrobacterium Protocols. Series: Methods in Molecular Biology 343, 201-212. Ozawa Kenjirou (2008), Establishment of a high efficiency Agrobacterium mediated transformations y s t e m o f r i c e ( Oryza sativa L.), Plant Science, 176 (4), 522-527. Liu Xiao-Hong, Jian-Ping Lu, Lei Zhang, Bo Dong, Hang Min, and Fu-Cheng Lin (2007), Involvement of a Magnaporthe grisea Serine/Threonine Kinase Gene, MgATG1, in Appressorium Turgor and Pathogenesis, Eukaryotic cell, (6) 997– 1005. Liu Shaohua and Ralph A. Dean (1997), G Protein a Subunit Genes Control Growth, Development, and Pathogenicity of Magnaporthe grisea, MPMI 10, pp. 1075–1086. Napoli C., Lemieux C., Jorgensen R. (1990), Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans, Plant Cell, (4), 279–289. Nguyen Thi Lang and Bui Chi Buu (2003), Genetic and physical maps of gene Bph10 controling brown plant hopper resistance in rice (Oryza sativa L.), OMonRice 11, 35- 41. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. Park G, Xue C, Zheng L, Lam S, Xu JR. (2002), MST12 regulates infectious growth but not appressorium formation in the rice blast fungus Magnaporthe grisea, Mol Plant Microbe Interact, 15(3), 183-92. Park G., Bruno K.S., Staiger C.J., Talbot N.J. and J.R. (2004), Independent genetic mechanisms mediate turgor generation and penetration peg formation during plant infection in the rice blast fungus, Mol Microbiol, 53(6), 1695-707. Parker, R. and Song, H. (2004), The enzymes and control of eukaryotic mRNA turnover, Nat. Struc. Mol. Biol., 11 (2), 121-127. Clergeot Pierre-Henri (2001), PLS1, a gene encoding a tetraspanin-like protein, is required for penetration of rice leaf by the fungal pathogen Magnaporthe grisea, PNAS, 98 12), 6963–6968. Ramkumar G., Biswal A.K., Mohan K.M, Sakthivel K., Sivaranjani A.K.P., Neeraja C.N., Ram T., Balachandran S.M., Sundaram R.M., Prasad M.S., Viraktamath B.C., and Madhav M.S. (2010), Identifying novel alleles of rice blast resistance genes Pikh and Pita through allele mining, International Rice Research Notes (0117-4185). Rice Genetics II: Proceedings of the Second International Rice . IRRI-1990 Tr 564566. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 65 46. 47. 48. 49. 50. 51. Romano N., Macino G. (1992), Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences, Mol Microbiol (22): 3343–3353. Sahoo RK., Tuteja N. (2012), Development of Agrobacterium-mediated transformation technology for mature seed-derived callus tissues of indica rice cultivar IR-64, GM Crops Food 3, 1–6. Scardaci S.C. (2003), A New Diseases in California. University of California-Davis: Agronomy Fact Sheet. Schwab R., Ossowski S., Riester M., Warthmann N., and Weigel D. (2006), Highly specific gene silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis, Plant Cel. 18, 1121– 1133. Shahzadi, R. Ahmed, A. Hassan and M.M. Shah (2010), Optimization of DNA extraction from seeds and fresh leaf tissues of wild marigold (Tagetes minuta) for polymerase chain reaction analysis, Genetics and Molecular Research (1): 386393. Talbot, N.J., Y.P. Salch, M. Ma, and J.E. Hamer (1993). Karyotype variation within clonal lineages of the rice blast fungus, Magnaporthe grisea. Appl. Environ. Microbiol. 59: 585-593. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. Tie W., Zhou F., Wang L., Xie W., Chen H., Li W., Lin Y. (2012), Reasons for lower transformation efficiency in indica rice using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation: lessons from transformation assays and genome-wide expression profiling, Plant Mol Biol 78, 1–18. Tran Thi Cuc Hoa, Amirhusin Bahagiawati, Thomas K Hodges (1999), Agrobacterium – mediated transfomation of Indica rice cultivars grown in Vietnam, OMONRICE 7, 1-6. Tran Thi Cuc Hoa and Bui Ba Bong (2002), Agrobacterium-mediated transformation of rice embryogenic suspension cells using phosphomannose isomerease gene, pmi, as a selectable marker, Omonrice 10, 1-5. Van De Craen Mare, Phuey-Yee Goh, Mare Georges Logghe, Yee-Ling Khu, Kather, Mortier, Thierry, Andre Olivier Eddy Bogaaert (2010), Method for down-regulating gene expression in fungi, United States Patent Application 20100311819. Veeraraghavan J. (1975), A new method of classification and nonmenclature of physiologic races of Pyricularia oryzae Cav., Int. Rice Comm. Newsl. 24, 128-138. Xu J-R., and Hamer J.E. (1996), MAP kinase and cAMP singnaling regulate infection structure formation and pathogenic growth in the rice blast fungus Magnaporthe grisea, Genes Dev 1, 10(21), 2696-706. Xu J.-R., Staiger C.J. and Hamer J.E. (1998), Inactivation of the mitogen- activated protein kinase Mps1 from the rice blast fungus prevents pene-tration of host cells but allows activation of plant defense responses, Proc. Natl Acad. Sci. USA 95, 12713– 12718. Xu J.R. (2000), MAP kinases in fungal pathogens, Fungal Genet. Biol. 31, 137–152. Xu Jin-Rong, ChaoYang Xue (2002), Time for a blast: genomics of Magnaporthe grisea, Molecular plant pathology, 3(3), 173–176. Zeng Y., Wagner E.J. and Cullen B.R. (2002), Both natural and designed micro RNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 66 62. 63. Mol. Cel. 9, 1327-1333. Rahman Zuraida Ab. (2010), Production of transgenic Indica rice (Oryza sativa L.) Cv. MR 81 via particle bombardment system, Emirates Journal of Food and Agriculture, 22(5). Rahman Zuraida Ab., Zulkifli Ahmad Seman, Naziah Basirun, Advina Lizah Julkifle, Zamri Zainal and Sreeramanan Subramaniam (2011), Preliminary investigations of Agrobacterium-mediated transformation in indica rice MR219 embryogenic callus using gusA gene, African Journal of Biotechnology, 10(40), pp. 7805-7813. TÀI LIỆU WEBSITE http://vaas.vn/news_details.asp?newsID=NEW_132912082703) http://www.agroviet.gov.vn/Pages/news_detail.aspx?NewsId=10586) http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/2/2/95544/lua-japonica-do-bo-mien-nui-phiabac.aspx Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 67 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1. Bản ñồ cấu trúc pPS1 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 68 PHỤ LỤC 2. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG MS Thành phần 1. ða lượng Lượng pha cho lít môi trường (g) NH4NO3 33 KNO3 38 MgSO4.7H2O 10 KH2PO4 3,4 2. Vi lượng (mg) H3BO3 620 MnSO4.4H2O 2230 ZnSO4.4H2O 860 KI 83 MoO4Na2.2 H2O 25 CoCl2.6H2O 2,5 CuSO4.5H2O 2,5 3. Sắt (g) FeSO4.7H2O 5,56 Na2EDTA 7,46 4. Vitamin (mg) Glycine 400 Axit Nicotinic (B5) 100 Pyridoxin (B6) 100 Thiamin HCl (B1) 20 5. CaCl2.2H2O 6. Inositol 6,6 (g) 100 (mg) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 69 PHỤ LỤC 3. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG N6 ða lượng (mg/l) KNO3 2830 (NH4)2SO4 463 MgSO4.7H2O 185 KH2PO4 400 CaCl2.2H2O 166 Vi lượng (mg/l) KI 0.8 H3BO3 1.6 MnSO4 4H2O 4.4 ZnSO4.7H2O 1.5 Na2MoO4.2H2O 0.250 Na2EDTA.2H2O 37.25 FeSO4.7H2O 27.85 Vitamin (mg/l) Nicotinic acid 0.5 Pyridoxin-Hcl 0.5 Thimine-Hcl 1.0 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 70 PHỤ LỤC 4. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG LB Thành phần Khối lượng g/l Yeast extract NaCl Tryptone 10 Agar 15 (môi trường ñặc) pH 7,0 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 71 PHỤ LỤC 5. Quy trình chiết tách DNA tổng số lúa Thành phần ñệm chiết gồm có: CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) : 0,0225 g/ml EDTA (Ethylenediamine tetraacetate : 25mM Tris HCl pH : 20mM NaCl : 250mM SDS : 1% Tris HCl pH : 20mM EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) : 10mM H2O Thành phần ñệm TE hòa tan DNA: Các hóa chất khác: Cồn tuyệt ñối Iso-propanol lạnh Cồn 70% rửa tủa DNA Cloroform:Isoamylalcohol (24:1) Phenol:Cloroform:Isopropanol (25:24:1) Các bước tiến hành chiết tách DNA lúa: - Nghiền 0,1-0,2g lúa 400µl ñệm chiết sau ñó bổ sung thêm 400 µl ñệm chiết, ñổ dịch chiết vào ống ependoff 2ml. - ðặt ống dịch chiết ñá lạnh phút. - Ly tâm 13.000 vòng/ phút, 40C phút. - Hút 600µl dịch phía sang ống bổ sung 600µl dung dịch 25:24:1. ðảo trộn ñều theo chiều dưới. - Ly tâm 13.000 vòng/ phút, 40C 10 phút. - Hút 500µl dịch phía sang ống bổ sung 600µl dung dịch 24:1. ðảo trộn ñều theo chiều dưới. - Ly tâm 13.000 vòng/ phút, 40C 10 phút. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 72 - Hút 300µl dịch phía sang ống bổ sung 300µl dung dịch Isopropanol lạnh. ðảo trộn ñều theo chiều dưới. ðặt ñá lạnh 30 phút. - Ly tâm 13.000 vòng/ phút, 40C 10 phút. ðổ dịch phía thu tủa DNA. - Rửa tủa DNA với 200µl Ethanol 70%. Ly tâm 13.000 vòng/ phút, 40C phút. - ðổ dịch phía trên, thu tủa DNA, làm khô tủa. - Hòa tan kết tủa DNA 50µl dung dịch TE. Bảo quản DNA ñiều kiện -200C. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 73 [...]... thích h p cho m t s gi ng lúa ph c v chuy n gen - Ch n ñư c gi ng lúa có kh năng tái sinh t t ph c v cho chuy n gen - Chuy n c u trúc miRNA nhân t o vào lúa thông qua vi khu n A tumefaciens và tái sinh cây lúa chuy n gen 4 Ý nghĩa khoa h c và ý nghĩa th c ti n c a ñ tài 4.1 Ý nghĩa khoa h c Vi c t o ñư c cây lúa chuy n gen mang c u trúc miRNA nhân t o có kh năng c ch ñ c hi u gen MPG1 có liên quan t i... ph n k nư c trên b m t lá lúa và ho t ñ ng như m t th th ñ kích thích s hình thành vòi áp (Talbot và c ng s , 1996) Như v y, MPG1 ñóng vai trò quan tr ng trong s hình thành và phát tri n b nh ñ o ôn lúa Vi c c ch s bi u hi n c a MPG1 có th khi n n m ñ o ôn không gây ñư c b nh Nghiên c u “T o cây lúa chuy n gen mang miRNA nhân t o c ch ñ c hi u gen MPG1 n m ñ o ôn Magnaporthe grisea ph c v chi n lư c... gi ng lúa có kh năng kháng ñư c nhi u ch ng n m ñ o ôn Vi t Nam 2 M c ñích nghiên c u T o thành công cây lúa chuy n gen mang miRNA nhân t o ñư c thi t k c ch ñ c hi u gen MPG1 n m ñ o ôn thông qua vi khu n A tumefaciens Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 3 3 Yêu c u - Xác ñ nh môi trư ng c m ng mô s o thích h p cho m t s gi ng lúa ph c v chuy n gen -... ra cây lúa chuy n gen mang c u trúc mã hóa cho dsRNA tương ng v i m t hay nhi u gen ñích trong n m M grisea có th kháng l i v i b nh ñ o ôn lúa do n m này gây ra Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 21 1.5 ng d ng cây tr ng bi n ñ i gen và th c tr ng nghiên c u chuy n gen vào lúa 1.5.1 ng d ng cây tr ng bi n ñ i gen Trong kho ng th i gian 1996 - 2005 cây. .. âm tính s bi u hi n c a gen h u h t các sinh v t nhân chu n (Bartel và cs, 2003) Không gi ng như siRNA, thư ng có ngu n g c ngo i sinh, miRNA ñư c hình thành b i các gen trong genome g i là các MIR gen Ngo i tr m t ph n nh các MIR gen (ch ng h n kho ng ¼ s lư ng miRNA c a b gen ngư i) n m vùng intron c a gen m c tiêu thì ph n l n các gen miRNA n m các v trí cách xa gen m c tiêu Chúng có th bi t l p... cho các m c ñích nghiên c u làm b t ho t gen (gen knockdown) Trong lĩnh v c nông nghi p, amiRNA ñang tr thành công c có hi u qu trong vi c t o ra các cây tr ng chuy n gen ch ng l i m t s lo i tác nhân gây h i trên th c v t bao g m n m, côn trùng, Gavilano và cs (2006) ng d ng công ngh RNAi trong phòng ch ng b nh ñ o ôn trên lúa: Hi n tư ng RNAi trên n m M grisea ñư c quan sát l n ñ u tiên vào năm... nh ñ o ôn trên cây lúa khu v c ðông Nam Á S ti n hóa di truy n qu n th c a M grisea ñư c nghiên c u trên gen Pi-33 và dòng hóa c a nó, gen Pi-33 + Pi-1 + Pi-2 cho th y m t ph i h p t t cho tính kháng b n v ng, trong ñó gen Pi-33 bi u hi n ph kháng b nh ñ o ôn r t r ng S tương tác c a 30 gen thu c h th ng t v c a cây lúa cũng ñư c ghi nh n (Bùi Chí B u - Vi n KHKTNN Mi n Nam) Trư ng ð i h c Nông nghi... chuy n gen Protein này làm gi m tăng trư ng c a n m ñ o ôn ñ n 63% so v i cây bình thư ng, và không có nh hư ng gì ñ n ki u hình c a cây S th hi n c a gen chuy n không liên quan ñ n hình th c th hi n theo cơ ch PR (pathogenesis-related), các nhà khoa h c k t lu n r ng Mj-AMP2 tr c ti p tác ñ ng ñ n tác nhân gây b nh (pathogen) (Prasad và cs, 2008) 1.5.3 Tình hình nghiên c u chuy n gen vào cây lúa Vi... o ôn, vi c tìm ra các gene kháng nh m t o ra các gi ng lúa kháng b nh ñ o ôn v n ñư c coi là phương pháp có hi u qu và b n v ng Kho ng 85 gen và 350 QTL ñi u khi n tính kháng b nh ñ o ôn ñã ñư c phát hi n, nhưng nhi u gen ñư c tìm th y trên cùng loci (Ramkumar và cs, 2010), t o cơ s cho vi c ch n t o gi ng mang gene kháng b nh Vi t Nam, vi c ñánh giá ña d ng ngu n gen kháng và t o ra các gi ng lúa mang. .. s i là phân t miRNA thành th c (g i là s i hư ng d n) s tham gia hình thành ph c h p RISC; còn s i kia s b phân h y (Parker và Song, 2004) ng d ng công ngh RNAi: D a trên các c u trúc miRNA t nhiên, các nhà khoa h c ñã thi t k thành công các vector miRNA nhân t o (amiRNA) b ng cách thay th các trình t miRNA/ miRNA* b ng trình t amiRNA/amiRNA* tương ng ð c ñi m thi t k này cho phép các amiRNA ñư c sinh . Việc ức chế sự biểu hiện của MPG1 có thể khiến nấm ñạo ôn không gây ñược bệnh. Nghiên cứu Tạo cây lúa chuyển gen mang miRNA nhân tạo ức chế ñặc hiệu gen MPG1 ở nấm ñạo ôn Magnaporthe grisea . ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI          PHAN THỊ HƯƠNG TẠO CÂY LÚA CHUYỂN GEN MANG MIRNA NHÂN TẠO ỨC CHẾ ðẶC HIỆU GEN MỤC TIÊU MPG1 CỦA NẤM ðẠO ÔN MAGNAPORTHE. chọn tạo giống lúa có khả năng kháng ñược nhiều chủng nấm ñạo ôn ở Việt Nam. 2. Mục ñích nghiên cứu Tạo thành công cây lúa chuyển gen mang miRNA nhân tạo ñược thiết kế ức chế ñặc hiệu gen MPG1