Hiện tượng RNA can thiệp (RNA interference-RNAi) mà trước ựây ựã từng ựược gọi là hiện tượng ựồng ức chế (co-suppression), câm gen hậu phiên mã (post transcriptional gen silencing -PTGS), chế ngự (quelling) là một quá trình xảy ra trong các tế bào sống ựể ựiều khiển sự hoạt ựộng của các gen. Trải qua hơn 20 năm phát hiện, phát triển, RNAi ựã và ựang trở thành chủ ựề nóng bỏng trong các nghiên cứu ở mức ựộ cơ bản cho ựến ứng dụng. Ngày nay, RNAi vẫn là công cụ hàng ựầu trong các nghiên cứu về genomic, chức năng gen, ựiều hòa biểu hiện gen và rất nhiều ứng dụng trong y học cũng như trong nông nghiệp.
Lịch sử phát hiện hiện tượng RNAi:
Sự khám phá ựầu tiên về RNAi khi quan sát sự ức chế phiên mã bởi sợi RNA ựối nghĩa ựược biểu hiện trong cây trồng chuyển gen bởi Napoli và cs vào năm 1990. Tiếp theo, Romano và Macino (1992) cũng phát hiện một hiện tượng tương tự trong nấm Neurospora crassa khi nấm này ựược chuyển gen
albino-3 (al-3) và albino-1 (al-1) chịu trách nhiệm tổng hợp carotenoid, các gen al-3 và al-1 ựã không ựược biểu hiện. Các tác giả ựã ựặt tên cho hiện tượng này là hiện tượng chế ngự (quelling).
Không lâu sau ựó, khi các nhà virus học thực vật làm việc ựể nâng cao tắnh kháng của cây trồng ựối với các bệnh virus cũng ựã quan sát thấy một hiện tượng tương tự. Các tác giả ựã tin rằng có thể tạo ra cây trồng chuyển gen kháng virus bằng cách chuyển một ựoạn RNA của virus vào ựể ức chế sự sinh sản của virus (Covey và cs, 1997). Một thực nghiệm ngược lại trong ựó tác giả ựã gắn một ựoạn trình tự của một gen cây trồng vào virus rồi cho cây trồng lây nhiễm với virus ựó, kết quả cho thấy gen ựắch trong cây ựược lây nhiễm cũng bị ức chế. Hiện tượng này ựã ựược chú ý và gọi là Ộ câm gen gây ra bởi virusỢ (virus-induced gen silencing), và một loạt những hiện tượng tượng tự cùng ựược gọi tên là sự cân gen ở mức hậu phiên mã (post- transcriptional level).
Fire và cs (1998) ựã báo cáo về hiệu quả làm câm gen sau khi tiêm cấu trúc dsRNA vào giun tròn Caenorhabditis elegans. Các tác giả ựã phát hiện thấy khi tiêm cấu trúc sợi mRNA hoặc sợi ựối nghĩa ựều không tạo ra hiệu quả làm câm gen mong muốn, chỉ có cấu trúc dsRNA ựược tiêm vào mới tạo ra hiện tượng ỘcâmỢ. Các tác giả ựã gọi hiện tượng này là RNA tương tác (RNA interference). Phát hiện của Fire và cs rất ựược chú ý vì ựây là phát hiện ựầu tiên ựã xác ựịnh ựược tác nhân là nguyên nhân của các hiện tượng
trên, ựó là dsRNA. Fire và cs ựã ựược trao tặng giải thưởng Nobel về vật lý và y học cho phát hiện của họ vào năm 2006.
Cơ chế phân tử của hiện tượng RNAi:
Các nhà khoa học ựã phát hiện thấy các phân tử RNA nhỏ (sRNA) ựược tạo ra từ các phân tử RNA dài hơn qua trung gian là các phân tử dsRNA. Các sRNA ựược chia làm hai nhóm chắnh khác nhau dựa trên mô hình sinh tổng hợp của chúng là siRNA và miRNA.
SiRNAs là các phân tử RNA sợi kép nhỏ, kắch thước khoảng 21-25 nts, ựược tạo ra bởi Dicer (một RNA endonuclease nhóm III) là thành phần quan trọng của phức hợp RISC gọi là siRISC có chức năng phân hủy mRNA mục tiêu của nó. Phần lớn siRNA có nguồn gốc từ mRNAs, các yếu tố di ựộng (transposons), virus hoặc DNA dị nhiễm sắc thể (heterochromatic DNA). Như vậy siRNA có cùng nguồn gốc với gen mục tiêu. Các siRNA bình thường có thể ựược hình thành từ các RNA mạch kép (dsRNA), sợi dài nội sinh cũng như ngoại sinh (vắ dụ thông qua chuyển gen) thông qua sự phân cắt bởi Dicer RNase, giải phóng một vài phân tử trung gian dạng mạch kép, có kắch thước khoảng 21 nts, với 2 nts nhô ra ở ựầu 3Ỗ (Elbashir và cs, 2001). Các siRNA sau ựó tham gia vào thành phần của phức hợp RISC gọi là siRISC, ựưa nó ựi phân cắt các mRNA mục tiêu.
MiRNA là các trình tự RNA ựiều hòa nhỏ, nội sinh, không mã hóa, có kắch thước 21-24 (nts). Chúng ựóng vai trò quan trọng trong ựiều hòa âm tắnh sự biểu hiện của gen ở hầu hết các sinh vật nhân chuẩn (Bartel và cs, 2003). Không giống như siRNA, thường có nguồn gốc ngoại sinh, miRNA ựược hình thành bởi các gen trong genome gọi là các MIR gen. Ngoại trừ một phần nhỏ các MIR gen (chẳng hạn khoảng Ử số lượng miRNA của bộ gen người) nằm ở vùng intron của gen mục tiêu thì phần lớn các gen miRNA nằm ở các vị trắ cách xa gen mục tiêu. Chúng có thể biệt lập hoặc phân bố thành cụm và
ựược phiên mã thành các ựơn vị phiên mã riêng biệt. Như vậy miRNA có nguồn gốc khác với gen mục tiêu.
Quá trình tạo ra các phân tử miRNA có thể ựược tóm tắt qua các bước sau: Hình thành phân tử phiên mã sơ cấp pri-miRNA (primary transcripts): đầu tiên, gen mã hóa miRNA ựược phiên mã nhờ RNA endonuclepolymerase II (pol II) ở trong nhân thành các phân tử phiên mã (transcript) có kắch thước từ vài trăm tới hàng ngàn nts. Các transcript này ựược gọi là các phân tử phiên mã sơ cấp pri-miRNA (primary transcripts) chứa môt mũ (cap) ựầu 5Ỗ và một chuỗi poly-A ựầu 3Ỗ. Pri-miRNA của thực vật thường dài hơn và phức tạp hơn (chứa nhiều cấu trúc thân Ờ thòng lọng hơn).
Hình thành các phân tử tiền chất pre-miRNA (precusor miRNA): Tiếp theo, các phân tử pri-miRNA ựược cắt bởi một RNA endonuclease nhóm III là Dicer (ở ựộng vật là Drosa) thành các phân tử RNA có kắch thước khoảng 70 nts gọi là các phân tử tiền chất pre-miRNA (precusor miRNA).
Hình thành miRNA thành thục ở thực vật: Các phân tử pre-miRNA ở trong nhân sẽ ựược Dicer cắt thành các phân tử RNA nhỏ sợi kép có kắch thước khoảng 22 nts. Do bị cắt bởi Dicer, các phân tử này có ựầu so le với gốc phosphat ở ựầu 5Ỗ và 2-3 phân tử nts ựầu 3Ỗ (overhang). Tiếp theo, phân tử RNA nhỏ sợi kép này ựược vận chuyển từ nhân ra tế bào chất. Tại tế bào chất, chúng ựược tách bởi helicase thành 2 phân tử sợi ựơn: một sợi là phân tử miRNA thành thục (gọi là sợi hướng dẫn) sẽ tham gia hình thành phức hợp RISC; còn sợi kia sẽ bị phân hủy (Parker và Song, 2004).
Ứng dụng công nghệ RNAi:
Dựa trên các cấu trúc miRNA tự nhiên, các nhà khoa học ựã thiết kế thành công các vector miRNA nhân tạo (amiRNA) bằng cách thay thế các trình tự miRNA/miRNA* bằng trình tự amiRNA/amiRNA* tương ứng. đặc ựiểm thiết kế này cho phép các amiRNA ựược sinh tổng hợp và hoạt ựộng tương tự
như các miRNA tự nhiên. Các vector amiRNA ựã ựược chứng mình là ựem lại hiệu quả tương tự như các miRNA tự nhiên trên nhiều ựối tượng khác nhau (Zeng và cs, 2002), ở trên Arabidopsis (Parizotto và cs, 2004) và các loài thực vật khác (Schwab và cs, 2006). Hiện nay công nghệ amiRNA ựang ựược ứng dụng rất rộng rãi cho các mục ựắch nghiên cứu làm bất hoạt gen (gen knockdown). Trong lĩnh vực nông nghiệp, amiRNA ựang trở thành công cụ có hiệu quả trong việc tạo ra các cây trồng chuyển gen chống lại một số loại tác nhân gây hại trên thực vật bao gồm nấm, côn trùng,... Gavilano và cs (2006).
Ứng dụng công nghệ RNAi trong phòng chống bệnh ựạo ôn trên lúa:
Hiện tượng RNAi trên nấm M. grisea ựược quan sát lần ựầu tiên vào năm 2003 bởi Kadotani và cs. Trong nghiên cứu này, các tác giả ựã chuyển một cấu trúc gồm nhiều bản copy của gen GFP vào nấm M. grisea ựể làm mô hình cho gen ựắch. Sau ựó các dòng nấm chuyển gen GFP cũng ựược chuyển với một vector mang cấu trúc DNA mã hóa cho các phân tử RNA sợi ựơn, sợi ựôi ở dạng sense-sense, antisense-antisense, sense-antisense và cấu trúc RNA kẹp tóc. Kết quả các tác giả ựã xác ựịnh ựược cấu trúc cho hiệu quả làm câm gen cao nhất trong nấm M. grisea là cấu trúc mã hóa cho phân tử RNA kẹp tóc. Các siRNA ựược cho là các phân tử chìa khóa của quá trình làm câm gen thông qua RNA. Khi cho lai với mẫu dò là trình tự ựối nghĩa của gen GFP, các tác giả ựã xác ựịnh ựược những phân tử siRNA với kắch thước biến ựộng 19-23 nts (Kadotani và cs, 2003). Trong khi các ựoạn siRNA kắch thước 25 nts ựã ựược báo cáo trên nấm Neurospora crassa (Catalanottovà cs, 2002), chứng tỏ những ựoạn siRNA ựược sinh ra trong các loài nấm khác nhau thậm chắ ngay trong chắnh một loài cũng biến ựộng ở các kắch thước khác nhau. Nghiên cứu này ựã xác ựịnh ựược cấu trúc có hiệu quả gây ra sự câm gen rõ nhất ở mức phân tử. Tuy nhiên, RNAi mới chỉ thu ựược khi sự phiên mã các dsRNA diễn ra bên trong tế bào nấm khi một gen chuyển ựược chuyển vào trong tế bào nấm. Công
nghệ RNAi cần thiết sự chuyển vào trong tế bào nấm một cấu trúc DNA có thể phiên mã ựể tao ra các dsRNA bên trong tế bào nấm chỉ hữu ắch với những nghiên cứu thực nghiệm trong phòng thắ nghiệm. Nó gần như không phù hợp cho những những ứng dụng thực tiễn mà ựòi hỏi dsRNA phải ựược tạo ra trong nhiều tế bào nấm trên một phạm vi rộng hoặc trên ựồng ruộng.
Một nghiên cứu mới ựây nhất về hiện tượng RNAi trên nấm M. grisea bởi Van De Craen và cs ựược báo cáo năm 2010. Nhóm nghiên cứu ựã quan sát thấy hiện tượng RNAi không phải trên những gen mô hình ựược chuyển vào tế bào nấm nữa mà trực tiếp trên những gen của nấm M. grisea bằng các thực nghiệm
in vitro. Trong thực nghiệm hình thành vòi áp trên bề mặt kị nước, cáctác giả sử dụng bào tử nấm ựạo ôn ở nồng ựộ 104 bào tử/ml và nuôi cấy trên bề mặt kị nước của màng nhân tạo (gelbondRflim); 20ộl dsRNA ựược bổ sung lên trên bề mặt nuôi cấy ở các nồng ựộ 0.1-1 mg/ml. đối chứng âm sử dụng ựược chuẩn bị theo quy trình tương tự dsRNA cần kiểm tra, là một phần trình tự gene GFP (hoặc có thể sử dụng cấu trúc pre-miRNA tự nhiên). Sau 16-24 giờ nuôi cấy ở 280C, các bào tử bắt ựầu này mầm ựược nhuộm với acid Fucshin ựể quan sát sự nảy mầm của bào tử. Sự hình thành vòi áp trên bề mặt màng nhân tạo ựược quan sát dưới kắnh hiển vi. Sự ức chế hình thành vòi áp là dấu hiệu trực tiếp của việc ức chế sự biểu hiện của gene ựắch bởi RNAi do sự hấp thu dsRNA. Phần trăm hình thành vòi áp ựược tắnh toán bởi số vòi áp hình thành trên tổng số bào tử quan sát trên 3 quang trường. Thực nghiệm về sự phát triển của hệ sợi trên bề mặt ưa nước: Bào tử vô tắnh ựược thu và hòa loãng trong môi trường PDB ựể ựảm bảo có 1250 bào tử trong 90ộl dịch ựược ựưa vào mỗi giếng của tấm 96- wells(Falcon 3072). Sau 0-2 giờ, bổ sung thêm 10ộl dsRNA ở các nồng ựộ 0,1- 0,5 mg/ml. đối chứng âm sử dụng là ựoạn dsRNA của gene GFP, GST hoặc Seastar (sử dụng ắt nhất 2 ựối chứng âm). Sau 16-24 giờ nuôi cấy ở 280C trong ựiều kiện tối. Sự sinh trưởng của hệ sợi trong mỗi giếng ựược ựịnh lượng bằng
cách ựo mật ựộ quang của các giếng nuôi cấy ở bước song 595nm, sử dụng máy ựọc GENios Tecan, Australia. Tắnh phần trăm mẫu bị ức chế và so sánh với mẫu ựối chứng. Thực nghiệm sự hình thành bào tử bố trắ tương tự nhưng trong ựiều kiện sáng ựể kắch thắch sự sinh bào tử. Sự hình thành bào tử ựược quan sát liên tục sau 4-6 ngày nuôi cấy. Các thực nghiệm này ựã chứng minh việc tạo ra hiệu quả làm câm gen mà không cần phải chuyển trực tiếp cấu trúc DNA có khả năng mã hóa dsRNA vào trong tế bào nấm. điều này có ý nghĩa rất lớn vì nó mở ra một tiềm năng có thể áp dụng hiện tượng RNAi ựể tạo ra những cây trồng biến ựổi gen (GMO) có thể trực tiếp mã hóa ra cấu trúc dsRNA tương ứng với một trong số những gen ựắch trong bản thân tác nhân gây bệnh trên cây trồng ựó. Quan trọng hơn nữa là các tác giả ựã thành công trong việc tạo ra hiệu quả làm câm gen mà không cần phải chuyển trực tiếp cấu trúc DNA có khả năng mã hóa dsRNA vào trong tế bào nấm trong những thực nghiệm in vitro. điều này có ý nghĩa rất lớn vì nó mở ra một tiềm năng có thể áp dụng hiện tượng RNAi ựể tạo ra những cây trồng GMO có thể trực tiếp mã hóa ra cấu trúc dsRNA tương ứng với một trong số những gen ựắch trong bản thân tác nhân gây bệnh trên cây trồng ựó. Trong trường hợp này, các ựoạn dsRNA ựược tạo ra bên ngoài thành tế bào của nấm M. grisea có thể ựược hấp thu qua thành tế bào ựể tạo ra hiệu quả làm câm các mRNA mục tiêu tương ứng bên trong tế bào nấm. Tác ựộng của RNAi ựã ựược chứng minh trong những thực nghiệm in vitro với hiệu quả làm câm cao nhất lên tới 90% so với ựối chứng. Bên cạnh ựó những thực nghiệm in vivo cũng ựã ựược thực hiện với hiệu quả làm câm ựem lại cũng rất khả quan (Van De Craen và cs, 2010). Những kết quả thực nghiệm in vitro và in vivo ựã khẳng ựịnh có thể tạo ra cây lúa chuyển gen mang cấu trúc mã hóa cho dsRNA tương ứng với một hay nhiều gen ựắch trong nấm M. grisea có thể kháng lại với bệnh ựạo ôn lúa do nấm này gây ra.