KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.2. Khảo sát khả năng tái sinh cây từ mô sẹo của một số giống lúa
Mối tương quan giữa các phytohoocmon trong môi trường nuôi cấy có vai trò quyết ựịnh ựến chiều hướng phát triển của vật liệu nuôi cấy. Ở ựây, mô sẹo ựược nuôi cấy trên môi trường có hàm lượng 2,4-D cao nên khi tái sinh cần phải quan tâm ựến sự cân bằng phytohoocmon trong môi trường tái sinh và trong mô ựể mô sẹo có thể phân hóa, tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Khi tái sinh cây lúa thuộc loài phụ indica Datta và cs (2006) sử dụng môi trường tạo mô sẹo (bao gồm cả 2,4-D) bổ sung 2mg/l kinetin, 1mg/l α-NAA và 10g/l sorbitol. Năm 2010, Rahman và cs báo cáo sử dụng môi trường tái sinh cây lúa thuộc loài phụ indica là môi trường cảm ứng tạo mô sẹo (không gồm 2,4-D) bổ sung 2mg/l BA và 1mg/l α-NAA. Một số môi trường tái sinh khác ựối với mô sẹo giống lúa thuộc loài phụ japonica cũng bao gồm cả 2,4- D bổ sung kinetin với hàm lượng 2,5mg/l (Kenjirou , 2008) hay 3mg/l BA và 0,5mg/l α-NAA (CiRAD). Dựa trên một số kết quả nghiên cứu tái sinh mô sẹo, chúng tôi ựã tiến hành khảo sát tái sinh ựối với 3 giống nghiên cứu sử dụng môi trường nền là môi trường tạo mô sẹo thắch hợp cho từng giống
(có hoặc không bao gồm 2,4-D) bổ sung thêm chất ựiều tiết sinh trưởng BA hoặc kinetin, α-NAA, sorbitol. Kết quả trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của môi trường ựến khả năng tái sinh của mô sẹo sau 6 tuần nuôi cấy
Số chồi/cụm mô sẹo đặc ựiểm khối mô sẹo
Công thức J02 HC BC15 J02 HC BC15 RN1 16,33 13,67 - ++ ++ - RN2 9,00 5,67 - +++ +++ - RN3 11,67 4,33 - ++ ++ - RN4 5,33 2,67 - +++ +++ - RM1 - - 1,33 - - + RM2 - - 0,20 - - + RM3 - - 0,16 - - + RM4 - - 0,10 - - +
Ghi chú: -: Không thắ nghiệm; +: Rất nhỏ, thâm ựen nhiều; ++: Nhỏ, màu vàng hoặc xanh; +++: Lớn, màu vàng hoặc xanh.
Nhìn chung, ựối với cả 3 giống nghiên cứu, mô sẹo trên môi trường tái sinh không sử dụng 2,4-D cảm ứng phát sinh chồi nhanh hơn và số chồi tái sinh/cụm mô sẹo cao hơn so với môi trường tái sinh bao gồm 2,4-D. Và môi trường tái sinh bổ sung 3mg/l BAP + 1mg/l NAA là môi trường tái sinh tốt hơn môi trường bổ sung 2mg/l kinetin, 1mg/l NAA, 10g/l sorbitol.
đối với 2 giống J02 và HC, môi trường tái sinh RN1 sử dụng nền môi trường tạo mô sẹo N2 (không bao gồm 2,4-D) bổ sung 3mg/l BAP + 1mg/l NAA cho kết quả số chồi tái sinh cao nhất. Môi trường tái sinh RN3 và RN4 cùng bổ sung 2mg/l kinetin, 1mg/l NAA, 10g/l sorbitol cho kết quả số chồi tái sinh/ cụm mô sẹo thấp hơn hẳn so với môi trường tái sinh RN1 và RN2. Trên môi trường tái sinh RN1, số chồi/cụm mô sẹo trung bình là 16,33 chồi/cụm ựối với giống J02 và 13,67 chồi/cụm ựối với giống HC. Trên môi trường tái
tương ứng 9,00 chồi/cụm với J02 và 5,67 chồi/cụm với HC. Mô sẹo tái sinh cây chậm trên môi trường tái sinh RN3 và RN4, số cây tái sinh/cụm mô sẹo thu ựược tương ứng là 11,67% và 5,33% ựối với J02, ựối với HC là 4,33% và 2,67% thấp hơn hẳn so với trên môi trường RN1 và RN2. Trong quá trình theo dõi chúng tôi cũng nhận thấy, ở giai ựoạn ựầu tái sinh (bao gồm giai ựoạn 10 ngày trong tối và khoảng 5 ngày ựầu ở ựiều kiện sáng), sinh khối mô sẹo trên môi trường tái sinh có 2,4-D tăng nhanh hơn trên môi trường tái sinh không có 2,4-D; mô sẹo trên môi trường tái sinh không có 2,4-D ựã cảm ứng màu xanh sau 5 ngày ở ựiều kiện sáng và bắt ựầu hình thành chồi. Trong khi ựó, sau 10 ngày ở ựiều kiện sáng, mô sẹo trên môi trường tái sinh có 2,4-D mới bắt ựầu cảm ứng màu xanh (Số liệu quan sát). Như vậy, môi trường tái sinh RN1 không có 2,4-D cho kết quả số chồi tái sinh/ cụm mô sẹo cao hơn môi trường tái sinh RN2 có 2,4D và các môi trường còn lại; sự phân hóa chồi của cả 2 giống J02 và HC trên môi trường tái sinh RN1 không có 2,4-D nhanh hơn RN2 có 2,4-D.
Giống BC15 tuy chưa tìm ựược môi trường tái sinh phù hợp nhưng trong 4 môi trường khảo sát thì môi trường tái sinh RM1 sử dụng nền môi trường tạo mô sẹo M2 (không bao gồm 2,4-D) bổ sung 3mg/l BAP + 1mg/l NAA là môi trường cho số chồi tái sinh cao hơn cả, trung bình là 1,33 chồi/ cụm mô sẹo. Số cây tái sinh trên các môi trường tái sinh còn lại RM2, RM3 và RM4 trung bình chỉ từ 0,1 ựến 0,2 cây/cụm mô sẹo. Giống BC15 tái sinh kém hơn giống HC thuộc cùng loài phụ indica. Khả năng tái sinh kém của giống BC15 có thể do nguyên nhân mô sẹo rắn, không có hình dạng nhất ựịnh và bị thâm ựen nhiều nên khi sau một thời gian chuyển mô sẹo sang môi trường tái sinh, mô sẹo thường có màu vàng ựậm và dần hóa nâu, chỉ có những mô sẹo có dạng tròn hoặc gần tròn, khô, màu vàng tươi mới có khả năng tái sinh cây.
Hình 3.4. Ảnh hưởng của môi trường ựến khả năng tái sinh của mô sẹo
Hình 3.5. Cây tái sinh giống BC15 trên môi trường RM1
Trong nuôi cấy in vitro, hiện tượng bạch tạng là ựột biến thường gặp không mong muốn. Tỷ lệ cây bạch tạng chịu ảnh hưởng của yếu tố giống, môi trường và ựiều kiện nuôi cấy. Nguyên nhân của hiện tượng này là do tác ựộng trực tiếp của các chất hóa học lên tế bào và hoạt ựộng mạnh mẽ của các Ộgen nhảyỢ. Tuy nhiên, chúng tôi chưa quan sát thấy hiện tượng bạch tạng khi tiến hành khảo sát tái sinh cây từ mô sẹo 3 giống nghiên cứu trên 4 môi trường tái sinh trên.
Dựa trên kết quả khảo sát tái sinh của 3 giống nghiên cứu chúng tôi thấy giống BC15 chưa xác ựịnh ựược môi trường tái sinh phù hợp, giống J02
dụng hai giống này làm nguồn vật liệu cho chuyển gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium.
Hình 3.6. Hình ảnh tái sinh của giống lúa J02 và HC các giai ựoạn
10 ngày, 280C, ánh sáng 2000 lux
Phân hóa chồi, 20 ngày, 280C, ánh sáng 2000 lux Mô sẹo 3 tuần tuổi, 10 ngày, 280C, ựiều kiện tối
3.2. Xác ựịnh ảnh hưởng của kháng sinh ựến sự sinh trưởng của mô sẹo.
Nghiên cứu xác ựịnh ảnh hưởng của các nồng ựộ kanamycin ựến sinh trưởng của mô sẹo nhằm phục vụ cho việc xác ựịnh ngưỡng chọn lọc mô sẹo khi chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium chứa vector pPS1 mang gen chọn lọc nptII kháng kháng sinh kanamycin. Kết quả trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kháng sinh chọn lọc kanamycin ựến sinh trưởng của mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy
Tỉ lệ sống sót (%) Công thức Số lượng mô sẹo thắ nghiệm Nồng ựộ kháng sinh (mg/ml) J02 HC 1 100 0 100 100 2 100 30 89 76 3 100 50 65 59 4 100 70 35 28 5 100 90 18 12
Kết quả bảng 3.3 cho thấy, kanamycin có ảnh hưởng rõ rệt ựến tỉ lệ sống sót của mô sẹo. Khi tăng nồng ựộ kháng sinh kanamycin từ 0 ựến 90mg/l thì tỉ lệ sống của mô sẹo giảm từ 100 Ờ 18% ựối với giống J02, từ 100 - 12 % ựối với giống HC. Trên môi trường không bổ sung kháng sinh kanamycin mô sẹo của cả 2 giống có tỉ lệ sống 100% và tiếp tục tăng sinh khối. Ngay ở nồng ựộ 30 mg/l tỉ lệ mô sẹo sống sót ựã giảm còn 89% ựối với J02 và 76% ựối với HC sau 3 tuần nuôi cấy. Ngưỡng kháng sinh 90mg/l kanamycin làm sức sống mô sẹo giảm mạnh, tỉ lệ mô sẹo sống của J02 chỉ còn 18% và HC còn 12%. Theo Brukhin và cộng sự (2000), nồng ựộ chất chọn lọc phù hợp là khi nó loại bỏ ựược khoảng 90% các mẫu không chuyển gen (Nguyễn Thị Thanh Nga và cs, 2012). Như vậy, kanamycin 70 mg/l là thắch hợp cho chọn lọc mô