KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Chuyển vector pPS1-pre-amiR-P1 vào lúa bằng vi khuẩn A tumefaciens
tumefaciens
Vật liệu thực vật là yếu tố quan trọng ảnh hưởng hiệu quả xâm nhập của vi khuẩn A. tumefaciens, mô sẹo non có thành tế bào mỏng sẽ tạo ựiều kiện tốt cho vi khuẩn Agrobacterium xâm nhập vào tế bào. Sau ựó, mô sẹo non có khả năng phân chia rất lớn nên có khả năng thu ựược nhiều tế bào mang gen chuyển. Mặt khác, mô sẹo còn non có khả năng tái sinh tốt. Tuy nhiên, ựể thu ựược lượng lớn mô sẹo non cho chuyển gen thì cần khử trùng vào mẫu hạt với số lượng lớn và liên tục. Việc sử dụng vật liệu là mô sẹo thứ cấp có ưu ựiểm là sinh khối lớn, tuy mô sẹo thứ cấp có thành tế bào dày gây cản trở quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn vào tế bào nhưng do sinh khối lớn nên xác xuất vi khuẩn chuyển gen vào mô sẹo cũng cao, ựây cũng là một thuận lợi cho chuyển gen trong ựiều kiện thời gian nghiên cứu hạn chế.
Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi nhận thấy, giống lúa J02 có khả năng tạo lượng lớn mô sẹo thứ cấp sau 6 tuần trên môi trường N2. Mô sẹo thứ cấp của giống J02 kắch thước ựồng ựều, to, tròn, khô, màu vàng tươi có thể có tiềm năng tái sinh tốt. Vì vậy, dựa trên thực tế nghiên cứu, kết quả khảo sát tái sinh và các nguồn tài liệu tham khảo chúng tôi sử dụng mô sẹo sơ cấp 3 tuần tuổi của 2 giống (J02 và HC) và mô sẹo thứ cấp 6 tuần tuổi của giống J02 thu ựược trên môi trường tạo mô sẹo N2 làm vật liệu cho chuyển vector pPS1 mang miRNA-P1 nhân tạo ức chế gen MPG1 ở nấm ựạo ôn bằng vi khuẩn A. tumefaciens.
Ngưỡng chọn lọc 70mg/l kanamycin là kết quả thu ựược từ thắ nghiệm trước, khi nghiên cứu ảnh hưởng của kháng sinh ựến tỉ lệ chết của mô sẹo. Tuy nhiên, sau khi trải qua quá trình lây nhiễm, ựồng nuôi cấy với vi khuẩn mô sẹo còn yếu nên nồng ựộ kanamycin 50mg/l ựược sử dụng trong giai ựoạn ựầu chọn lọc ựể tránh loại bỏ cả những mô sẹo mang gen chuyển.
Bảng 3.4. Kết quả chuyển gen vào mô sẹo 3 tuần tuổi (3W) và 6 tuần tuổi (6W) của giống J02
Số lượng khối mô sẹo lây nhiễm với dịch
khuẩn Số mô sẹo sống sót sau chọn lọc Số dòng cây tái sinh
bị bạch tạng Số dòng cây tái sinh bình thường Số dòng cây có gen chuyển khi phân tắch PCR Hiệu quả chuyển gen (%) Chỉ tiêu Thời gian lây nhiễm (Phút) 3W 6W 3W 6W 3W 6W 3W 6W 3W 6W 3W 6W 10 400 - 154 - 15 - 13 - 13 - 3,25 - 20 400 200 113 125 7 13 2 4 2 4 0,50 2,0 30 400 200 54 106 5 9 1 2 1 2 0,25 1,0 Tổng số 1600 552 49 22 22
Bảng 3.5. Kết quả chuyển gen vào mô sẹo 3 tuần tuổi của giống HC Chỉ tiêu
Thời gian
lây nhiễm (Phút)
Số lượng khối mô sẹo lây
nhiễm với dịch khuẩn Số mô sẹo sống sót sau chọn lọc Số dòng cây tái sinh bị bạch tạng Số dòng cây tái sinh bình thường Số dòng cây có gen chuyển khi phân tắch PCR Hiệu quả chuyển gen (%) 10 400 129 23 0 0 20 400 85 14 0 0 30 400 24 6 0 0 Tổng số 1200 238 43 0 0
Lây nhiễm dịch khuẩn với vật liệu là bước ựầu tiên trong quá trình ựồng nuôi cấy, tạo ựiều kiện thuận lợi cho vi khuẩn tiếp xúc và xâm nhiễm vào tế bào mô sẹo. Thời gian lây nhiễm có ảnh hưởng rất lớn ựến quá trình tiếp xúc, xâm nhiễm của vi khuẩn mặt khác cũng ảnh hưởng ựến quá trình chọn lọc mô sẹo sau chuyển gen. Nếu mô sẹo ngâm trong dịch khuẩn quá lâu thì mô sẹo bị trương nước, thành tế bào mô sẹo bị phá vỡ hoàn toàn, mô sẹo mất khả năng sống sót trước khi vi khuẩn xâm nhiễm; nhưng nếu thời gian lây nhiễm quá ngắn thì có ắt vi khuẩn tiếp xúc với mô sẹo hạn chế khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn trong giai ựoạn ựồng nuôi cấy. Mô sẹo ựược lây nhiễm với dịch khuẩn ở các thời gian khác nhau, sau quá trình chọn lọc thu ựược ựã thu ựược tổng số 71 cây tái sinh của giống J02, trong ựó có 49 dòng cây tái sinh bị bạch tạng và 22 dòng cây tái sinh có trạng thái sinh trưởng bình thường. 22 dòng tái sinh này cũng có khả năng ra rễ bình thường trên môi trường chọn lọc có chứa kháng sinh kanamycin (Bảng 3.4 và hình 3.10), giống HC chỉ thu ựược cây tái sinh bị bạch tạng (Bảng 3.5 và hình 3.11).
Sử dụng mô sẹo non 3 tuần tuổi và mô sẹo thứ cấp 6 tuần tuổi của J02 làm vật liệu chuyển gen cho hiệu suất chuyển gen khác nhau. Với nguồn vật liệu mô sẹo non, thời gian lây nhiễm càng lâu thì số lượng mô sẹo sống sót sau chọn lọc càng giảm. Hiệu suất chuyển gen khi sử dụng mô sẹo 3 tuần tuổi giống J02 cao nhất ựạt 3,25% ở thời gian lây nhiễm 10 phút cao hơn công thức thời gian lây nhiễm 20 và 30 phút, hiệu suất chuyển gen tương ứng 0,5 và 0,25%. Tuy nhiên, Rahman và cs (2010) công bố thời gian lây nhiễm dịch khuẩn với mô sẹo 3 tuần tuổi giống lúa MR219 thắch hợp nhất là 30 phút. Hiệu suất chuyển gen vào giống lúa J02 cũng thấp hơn so với hiệu suất chuyển gen vào giống lúa C71 của Nguyễn Hồng Châu và cs (2003), theo công bố này hiệu suất chuyển gen ựạt từ 5 Ờ 8%. Tuy nhiên kết quả này nằm
trong khoảng 1,78 - 13,33% theo công bố của Nguyễn Thị Cúc Hòa và cs (1999) khi chuyển gen vào một số giống lúa trồng của Việt Nam.
Trong quá trình theo dõi chúng tôi nhận thấy mô sẹo non ngâm lâu trong dịch khuẩn khi chuyển sang môi trường ựồng nuôi cấy thì mô sẹo non tái dần ựến ngày thứ 3 mô sẹo hóa nâu nhiều (Hình 3.8) nên số lượng mô sẹo chuyển sang giai ựoạn chọn lọc cũng giảm so với ban ựầu. Trên môi trường chọn lọc, chỉ những mô sẹo ựược chuyển gen mới có khả năng sống sót. Khi tái sinh những mô sẹo này có khả năng tái sinh kém hơn so với khi tiến hành khảo sát và ựặc biệt là bên cạnh những cây có hình dạng và ựặc ựiểm nông sinh học bình thường thì xuất hiện cả những cây tái sinh bị bạch tạng (Hình 3.11), nguyên nhân có thể do mô sẹo trải qua nhiều lần rửa khuẩn và cấy chuyển nhiều lần trong giai ựoạn chọn lọc làm mô sẹo bị già hóa.
Mô sẹo 6 tuần tuổi của giống J02 lây nhiễm với dịch khuẩn ở các thời gian 20 và 30 phút có kết quả hiệu suất chuyển gen tương ứng là 2% và 1% (Bảng 3.4). Kết quả này tuy thấp hơn sử dụng mô sẹo non 3 tuần với thời gian lây nhiễm dịch khuẩn 10 phút nhưng do tiềm năng sinh khối lớn nên việc sử dụng mô sẹo 6 tuần tuổi với thời gian lây nhiễm dịch khuẩn 20 phút sẽ ựem lại nhiều thuận lợi cho quá trình chuyển gen vào lúa J02 thông qua vi khuẩn
Agrobacterium.
đối với giống lúa HC, chúng tôi ựã sử dụng vật liệu là mô sẹo non 3 tuần tuổi lây nhiễm với dịch khuẩn ở 3 mốc thời gian 10, 20 và 30 phút. Kết quả chuyển gen ựược trình bày ở bảng 3.5. Kết quả cho thấy, các dòng cây HC tái sinh trên môi trường có kháng sinh chọn lọc kanamycin ựều bị bạch tạng (Hình 3.9). Hiện tượng bạch tạng trên cây tái sinh không quan sát ựược ở các thắ nghiệm khảo sát tái sinh trước ựó nhưng khi tái sinh những mô sẹo sống sót sau chọn lọc trên môi trường tái sinh có kháng sinh chọn lọc thì hiện tượng này là phổ biến. Như vậy, có thể kháng sinh chọn lọc và các yếu tố tác
ựộng khác (như rửa khuẩn, cấy chuyển, kháng sinh diệt khuẩn,...) trong các giai ựoạn của quá trình chuyển gen có ảnh hưởng ựến khả năng tái sinh cây và hình thái, ựặc ựiểm cây tái sinh.
Hình 3.7. Hình ảnh lây nhiễm dịch khuẩn với mô sẹo giống J02 (bên trái) và HC (bên phải)
A B
Hình 3.8. Hình ảnh mô sẹo trong giai ựoạn ựồng nuôi cấy
A B
C D
Hình 3.9. Một số hình ảnh mô sẹo trong giai ựoạn chọn lọc
Ghi chú: A, B: mô sẹo giống J02; C,D: Mô sẹo giống HC
Hình 3.10. Cây chuyển gen tái sinh của giống J02
Sau quá trình chuyển gen thu ựược tổng số 22 dòng lúa J02 tái sinh trên môi trường có kháng sinh chọn lọc có hình thái, ựặc ựiểm nông sinh học bình thường sau 2-3 tháng kể từ khi bắt ựầu tạo mô sẹo từ phôi hạt trưởng thành; Nishimura và cs (2006) thu ựược cây chuyển gen sau 2-3 tháng; trong khi ựó, quy trình chuyển gen của Hiei và cs (1994) kéo dài 4 tháng mới thu ựược cây tái sinh.
Dựa trên những kết quả nghiên cứu thu ựược, chúng tôi xây dựng quy trình chuyển gen vào mô sẹo 3 tuần tuổi giống lúa J02 bằng vi khuẩn A. tumefaciens. Quy trình ựược trình bày ở hình 3.12.
Hình 3.12. Quy trình chuyển gen vào mô sẹo 3 tuần tuổi của giống J02 bằng vi khuẩn Agrobacterium
Việc ra rễ và sinh trưởng bình thường trên môi trường chọn lọc bước ựầu ựã có thể khẳng ựịnh 22 dòng J02 tái sinh là cây chuyển gen vì chỉ có
có khả năng sinh trưởng trên môi trường có chứa kanamycin. Tuy nhiên, ựể khẳng ựịnh sự có mặt của các gen chuyển trong cây, các dòng tái sinh ựược kiểm tra sự có mặt của promoter 2x35S và gen chuyển là pre-amiR-P1 sử dụng các cặp mồi ựặc hiệu.