VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu
2.3.3. Chuyển vector mang pre-amiR-P1 nhân tạo ức chế gen MPG1 ở nấm ựạo ôn (M grisea) vào lúa bằng vi khuẩn A tumefaciens.
ựạo ôn (M. grisea) vào lúa bằng vi khuẩn A. tumefaciens.
Sơ ựồ quy trình chuyển gen vào mô sẹo lúa thông qua vi khuẩn A. tumefaciens:
Phương pháp chuyển gen:
Chuẩn bị mô sẹo theo quy trình trên. Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens:
Ngày thứ nhất: Lấy vi khuẩn A. tumefaciens chứa vector pPS1 mang gen kháng kanamycine và cấu trúc pre-amiR-P1 bảo quản trong ựiều kiện -
Cây chuyển gen
điều kiện: 16h chiếu sáng/8h tối, 280C Chọn lọc mô sẹo Lây nhiễm Chuẩn bị dịch khuẩn Mô sẹo đồng nuôi cấy Tái sinh
800C cấy vạch 3 chiều sang môi trường LB ựặc bổ sung 50mg/l kanamycin khoảng 3 ngày ở 280C.
Ngày thứ 4: Thu 1 khuẩn lạc ựơn mọc riêng rẽ cấy vào môi trường LB lỏng thể tắch 10ml bổ sung 50mg/l kanamycin, nuôi lắc 200 vòng/phút, khoảng 12 -16 h, ở 280C.
Ngày thứ 5: Hút 100ộl dịch khuẩn chuyển sang môi trường LB lỏng thể tắch 50ml bổ sung 50mg/l kanamycin, nuôi lắc 200 vòng/phút, khoảng 12 -16 giờ, ở 280C.
Ngày thứ 6: Ly tâm thu sinh khối khuẩn 4000 vòng/ phút, 7 phút, 200C. Chuẩn bị dịch khuẩn lây nhiễm với mô sẹo bằng cách pha loãng sinh khối khuẩn với 50ml môi trường ựồng nuôi cấy lỏng, OD600nm= 0,5. Bổ sung 200ộM Acetocyringone vào dịch khuẩn ựể lây nhiễm.
Chuyển gen: - Ngày thứ nhất:
Lây nhiễm mô sẹo với dịch khuẩn ựã chuẩn bị ở khoảng thời gian theo bảng 2.5.
Bảng 2.5. Các công thức thời gian lây nhiễm dịch khuẩn với mô sẹo
STT Mô sẹo Số lượng mô
sẹo
Thời gian lây nhiễm (phút)
1 400 10
2 400 20
3
Mô sẹo non 3 tuần tuổi
400 30
4 200 20
5
Mô sẹo thứ cấp 6 tuần tuổi
200 30
Thấm bớt dịch khuẩn trên mô sẹo bằng giấy thấm vô trùng. Cấy chuyển mô sẹo sang môi trường ựồng nuôi cấy ựặc, bọc parafilm nuôi ở 280C trong
Thành phần môi trường ựồng nuôi cấy: Môi trường N2 + 200ộM Acetocyringone.
- Ngày thứ 4:
Rửa khuẩn bằng dung dịch môi trường N2 lỏng bổ sung 500mg/l kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime.
Thấm khô mô sẹo bằng giấy thấm vô trùng sau ựó cấy chuyển mô sẹo sang môi trường chọn lọc, ựặt trong ựiều kiện tối, ở 280C. 7 ngày cấy chuyển mô sẹo sống sót sang môi trường chọn lọc mới ựể loại bỏ vi khuẩn bám trên bề mặt mô sẹo. Những mô sẹo sạch khuẩn, sống sót trên môi trường chọn lọc ựược cấy chuyển sang môi trường tái sinh RN2 có bổ sung kháng sinh, ựặt trong ựiều kiện chiếu sáng 2000lux, 16 giờ sáng/ 8 giờ tối ở nhiệt ựộ 280C.
Thành phần môi trường chọn lọc: Môi trường N2 + 500mg/l cefotaxime + kanamycine.
Thành phần môi trường tái sinh: Môi trường RN1 + 200mg/l cefotaxime + kanamycine.
Cây tái sinh hoàn chỉnh có hình thái, ựặc ựiểm nông sinh học bình thường chiều cao khoảng 10-15 cm ựược chuyển ra trồng trong chậu vại ở nhà lưới ựể ựánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và thu hạt. Lấy mẫu lá của các dòng cây tái sinh ựể xác ựịnh gen chuyển bằng phương pháp PCR.