Nghiên cứu chuyển gen vào giống bưởi Đỏ thông qua Agrobacterium tumefaciens.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÙI THỊ Ý Tên đề tài: NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO GIỐNG BƯỞI ĐỎ THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010 – 2014 Thái Nguyên - 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÙI THỊ Ý Tên đề tài: NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO GIỐNG BƯỞI ĐỎ THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn 1. PGS.TS. Ngô Xuân Bình (Khoa CNSH & CNTP – ĐH Nông Lâm Thái Nguyên) 2. Ths. Lương Thị Thu Hường (Khoa CNSH & CNTP – ĐH Nông lâm Thái Nguyên) Thái Nguyên - 2014 LỜI CẢM ƠN Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, em đã tiến hành thực tập tốt nghiệp tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm. Sau 6 tháng thực tập tại phòng thí nghiệm em nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa cùng các thầy cô giáo trong bộ môn đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngô Xuân Bình và Ths. Lương Thị Thu Hường đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt thời gian thực tập. Em xin bài tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới KS. Lã Văn Hiền đã tận tình hướng dẫn cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong quá trình thực tập và hoàn thành khóa luận. Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu. Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Thái nguyên, tháng 6 năm 2014 Sinh viên thực hiện Bùi Thị Ý DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của bưởi 6 Bảng 2.2: Diện tích, năng suất, sản lượng bưởi trên Thế giới giai đoạn 2006 – 2012 14 Bảng 2.3: Sản lượng sản xuất bưởi quả ở các châu lục trên thế giới năm 2012 14 Bảng 2.4: Diện tích, năng suất bưởi của một số nước qua các năm 2010 – 2012 15 Bảng 2.5: Diện tích, năng suất, sản lượng của Việt Nam (2006 – 2012) 16 Bảng 4.1: Ảnh hưởng của tuổi thân mầm đến hiệu quả biến nạp gen gus sau 14 ngày 36 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm đến hiệu quả biến nạp gen gus 38 Bảng 4.3: Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp gen 41 Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nồng độ PPT đến khả năng chọn lọc chồi chuyển gen. 43 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1: Cây bưởi 5 năm tuổi 4 Hình 2.2: Lá bưởi có eo 5 Hình 2.3: Hoa bưởi 5 Hình 2.4: Biểu đồ thể hiện giá trị xuất khẩu bưởi của một số nước trên thế giới 7 Hình 2.5: Một số hình ảnh của giống bưởi đỏ 9 Hình 2.6: Biểu đồ thể hiện giá trị nhập khẩu bưởi một số nước trên thế giới 15 Hình 2.6: Vi khuẩn A. tumefaciens gây bệnh khối u thực vật 21 Hình 2.7: Ti plasmid có trong các dòng Agrobacterium gây độc 22 Hình 2.8: Cơ chế phân tử của chuyển gen qua A. tumefaciens 22 Hình 2.9: Sơ đồ cấu trúc của vector pCamvia3301 23 Hình 2.10: Kết quả nhuộm X-gluc ở callus 24 Hình 3.1: T-DNA plasmid pCambia3301 (gen gus, bar, Ca MV35S, Promoter) 27 Hình 3.2: Quy trình chuyển gen gus vào bưởi thông qua A. tumefaciens 28 Hình 3.3: Sơ đồ quy trình phát hiện gen bar 30 Hình 4.1: Đoạn thân mầm bưởi đỏ ở các tuổi khác nhau sau khi biến nạp và nhuộm X-gluc 37 Hình 4.2: Đoạn thân mầm bưởi đỏ sau khi lây nhiễm với các phương thức khác nhau và nhuộm X-gluc 40 Hình 4.3: Đoạn thân mầm bưởi đỏ sau khi đồng nuôi cấy với thời gian khác nhau và nhuộm X-gluc 42 Hình 4.4: Chồi bưởi đỏ nuôi cấy trên môi trường chọn lọc ở các nồng độ PPT khác nhau 44 Hình 4.5: Kết quả điện di DNA tổng số 44 Hình 4.6: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu gen bar 45 DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT As : Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone) Bar : Phosphinothricin acetyltransferase BAP : 6- Benzyl Amino Purine CCM : Co-Cultivation Medium Cs : Cộng sự CaMV35S : Cauliflower Mosaic Virus CT : Công thức CV : Coeficient of Variation DNA : Deoxyribonucleic Acid Đ/c : Đối chứng FAO : Food and Agriculture Organization FMV : Figwort mosaic virus GA 3 : Gibberellic Acid GM : Germination Medium Gus : β-1,4-Glucuronidase IAA : Indole-3-Acetic Acid IBA : β – Indol Butyric Acid LSD : Least Singnificant Diference Test MS : Murashige & Skoog (1962) MUG : 4-methylumbelliferyl β-D-Glucuronide NAA : α -Napthalene Acetic Acid RM : Rooting Medium RNAi : Ribonucleic Acid interference SEM : Shoot Elongation Medium SIM : Shoot Induction Medium Ti -plasmid : Tumor Including Plasmid USDA : United States Department of Agriculture X-gluc : 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Glucuronidase Acid PCR : Polymerase Chain Reaction PEG : polyethylene glycol PPT : phosphinothricine MỤC LỤC Trang PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích nghiên cứu 2 1.3. Yêu cầu của đề tài 2 1.4. Ý nghĩa đề tài 2 1.4.1. Ý nghĩa trong khoa học 2 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Giới thiệu chung về cây bưởi 3 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại 3 2.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây bưởi 4 2.1.2.1. Bộ rễ 4 2.1.2.2. Thân và Cành 4 2.1.1.3. Lá 5 2.1.2.4. Hoa và quả 5 2.2. Giá trị của cây bưởi 6 2.2.1. Giá trị dinh dưỡng 6 2.2.2. Giá trị kinh tế 7 2.2.3. Giá trị sử dụng 8 2.3. Đặc điểm của giống bưởi đỏ 9 2.4. Vùng sản xuất cây bưởi ở Việt nam 10 2.5. Phương pháp nhân giống bưởi 10 2.5.1. Phương pháp nhân giống truyền thống 10 2.5.2. Phương pháp nhân giống bằng công nghệ sinh học 11 2.6. Tình hình sản xuất, tiêu thụ bưởi trên thế giới và Việt Nam 13 2.6.1. Tình hình sản xuất, tiêu thụ bưởi trên thế giới 13 2.6.2. Tình hình sản suất, tiêu thụ bưởi ở Việt Nam 16 2.7. Nghiên cứu chuyển gen cây bưởi trên thế giới và Việt Nam 17 2.7.1. Tình hình nghiên cứu chuyển gen cây bưởi trên thế giới 17 2.7.2. Tình hình nghiên c ứu chuyển gen cây bưởi ở Việt Nam 18 2.8. Các phương pháp chuyển gen vào tế bào thực vật 18 2.8.1. Biến nạp trực tiếp 19 2.8.2. Biến nạp gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 20 2.9. Cơ sở khoa học của kỹ thuật chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterimum Tumefaciens 20 2.9.1. Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 20 2.9.2. Vi khuẩn Agrobacterium. tumefaciens 20 2.9.3. Cơ chế chuyển gen vào tế bào thực vật thông qua A. tumefaciens 22 2.9.4. Hệ thống vector pCambia 3301 22 2.9.5. Gen chỉ thị sàng lọc gus 23 2.9.6. Gen chỉ thị chọn lọc bar 25 PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1. Vật liệu nghiên cứu 27 3.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng 27 3.2.1. Hóa chất sử dụng 27 3.2.2. Thiết bị sử dụng 27 3.3. Địa điểm, thời gian nghiên cứu 27 3.4. Nội dung nghiên cứu 28 3.5. Phương pháp nghiên cứu 28 3.5.1. Chuẩn bị mẫu thực vật 29 3.5.2. Chuẩn bị khuẩn biến nạp 29 3.5.3. Lây nhiễm và đồng nuôi cấy 29 3.5.4. Tái sinh và chọn lọc 29 3.5.5. Đánh giá sự biểu hiện gen gus 30 3.5.6. Đánh giá cây chuyển gen 30 3.6. Phương pháp bố trí thí nghiệm, theo dõi, đánh giá và xử lý kết quả 32 3.6.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm 33 3.6.2. Theo dõi, đánh giá, xử lý số liệu 35 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mẫu thân mầm đến hiệu quả biến nạp gen gus. 36 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm đến biến nạp gen gus vào bưởi đỏ 38 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến biến nạp gen gus vào bưởi đỏ 40 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ PPT đến khả năng chọn lọc chồi chuyển gen 43 4.5. Kết quả đánh giá cây chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ (bar) vào bưởi đỏ thông qua Agrobacterium tumefaciens 44 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1. Kết Luận 46 5.2. Đề nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Tài liệu tiếng Việt 47 Tài liệu tiếng Anh 49 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cây bưởi (Citrus grandis (L.) Osbeck) là một trong những loại cây ăn quả có múi có giá trị dinh dưỡng cao và được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau. Trong 100g thịt quả bưởi tươi có: Đường 6-12%, lipit 0,1g, protein 0,9g, xenluloza 0,2g, vitamin B1, B2, caroten 0,2mg…và một số khoáng chất ở dạng vi lượng cần thiết cho cơ thể con người (Vũ Công Hậu, 1998)[11]. Ngoài dùng để ăn tươi thì bưởi còn được dùng chế biến thành rất nhiều sản phẩm có giá trị khác nhau như: Nước hoa quả, mứt, nước ngọt, tinh dầu, hương liệu. Trong công nghiệp chế biến vỏ, hạt để lấy tinh dầu, bã tép để sản xuất pectin có tác dụng bồi bổ cơ thể, đặc biệt bưởi có tác dụng rất tốt để chữa các bệnh đường ruột, tim mạch (Nguyễn Hữu Đống, 2003)[9]. Ở Việt Nam, điều kiện khí hậu và đất đai thích hợp cho trồng cây ăn quả, trong đó bưởi là cây ăn quả đặc sản được trồng phổ biến trên khắp ba miền với hơn 100 giống trong đó có nhiều giống bưởi quý: Bưởi Năm Roi, bưởi Phúc Trạch, bưởi Đoan Hùng, bưởi Diễn, bưởi Đỏ Mê Linh…(Trần Thế Tục và cs, 1998)[28]. Một số giống bưởi ở Việt Nam được coi là loại tốt trên thế giới như Năm Roi, Da xanh, là hai giống bưởi không hạt, chất lượng cao. Những năm gần đây, sản lượng bưởi của nước ta còn thấp do ảnh hưởng của sâu bệnh là chủ yếu; đặc biệt là bệnh vàng lá (Greening) và bệnh tàn lụi (Tristeza) đã ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất quả bưởi (Ngô Hồng Bình, 2006)[7]. Trong khi đó phương pháp nhân giống truyền thống như: Gieo hạt, chiết, ghép cành vẫn còn nhiều hạn chế. Gieo hạt: Thời gian cây ra hoa kết trái lâu và thường không sai quả; chiết ghép cành tuổi thọ của cây giống rút ngắn, dễ bị nhiễm bệnh từ cây gốc và sẽ nhanh chóng bị chặt bỏ sau vài năm trồng. Phương pháp ghép chồi đỉnh, nuôi cấy mô tế bào và chuyển gen thực vật là phương pháp đem lại hiệu quả cao trong nhân giống và tạo cây sạch bệnh ở các loài thực vật thân gỗ, trong đó bao gồm cây có múi và cung cấp những đặc tính mới thông qua những biến đổi trong quá trình nuôi cấy (Yan- Xin Duan và cs, 2007)[53]. Ở nước ta việc ứng dụng công nghệ sinh học trong công tác chọn tạo cây có múi sạch bệnh, có năng suất cao còn [...]... quy trình chuyển gen vào giống bưởi đỏ - Cung cấp tài liệu học tập nghiên cứu cho sinh viên 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu chuyển gus, bar vào giống bưởi đỏ nhằm xem khả năng tiếp nhận gen để từ đó có các nghiên cứu để chuyển các gen mang đặc tính mong muốn vào cây bưởi góp phần làm tăng giá trị cũng như năng suất của giống bưởi đỏ 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây bưởi 2.1.1... tạo được giống cây có múi với năng suất cao, phẩm chất tốt, sạch bệnh và khả năng kháng bệnh tốt Xuất phát từ thực tiễn trên tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu chuyển gen vào giống bưởi Đỏ thông qua Agrobacterium tumefaciens” sẽ là cơ sở cho những nghiên cứu thử nghiệm chuyển gen hữu ích vào cây bưởi nói riêng và cây ăn quả nói chung 1.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu được khả năng chuyển gen gus,... chuyển gen gus, bar vào giống bưởi đỏ thông qua Agrobacterium tumefaciens 1.3 Yêu cầu của đề tài - Xác định được tuổi mẫu thân mầm đến hiệu quả biến nạp gen gus vào bưởi đỏ - Xác định được phương pháp lây nhiễm đến hiệu quả biến nạp gen gus vào bưởi đỏ - Xác định được thời gian đồng nuôi cấy đến biến nạp gen gus vào bưởi đỏ - Xác định được nồng độ PPT đến khả năng chọn lọc chồi chuyển gen 1.4 Ý nghĩa đề... chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterimum Tumefaciens 2.9.1 Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Chuyển nạp gen là kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vào bộ gen sinh vật đang nghiên cứu Với những thành tựu của kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã mở ra triển vọng mới với chuyển gen ở thực vật bậc cao, tạo ra cây trông với tính trạng mong muốn Việc chuyển gen. .. hiện gen gna bằng kỹ thuật phân tích Western blot Diane Luth và Gloria Moore (1999)[35] đã mô tả thành công đầu tiên trong việc biến nạp gen và tạo cây bưởi chuyển gen từ đoạn trụ trên lá mầm của hạt sử dụng vi khuẩn A tumefaciens thông qua DNA vận chuyển và thực hiện quy trình ra rễ đơn giản nhờ kỹ thuật ghép 2.7.2 Tình hình nghiên cứu chuyển gen cây bưởi ở Việt Nam Ở Việt Nam, các nghiên cứu chuyển gen. .. chứng tỏ rằng các sai dị M1V4 quan sát thấy là những đột biến bền vững Chuyển gen Chuyển gen là đưa một đoạn DNA ngoại lai vào genome của một cơ thể đa bào, sau đó đoạn DNA ngoại lai này sẽ có mặt ở hết tất cả các tế bào được truyền lại cho thế hệ sau Thực vật chuyển gen là thực vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào DNA genome của nó (Trần quốc Dung và cs, 2006)[8] Chuyển gen còn được gọi là phương... hút chân không góp phần tăng hiệu quả biến nạp gen vào cây cam ngọt Pineapple lên 8,4% và cây bưởi đơn Swingle lên 11,2% so với kỹ thuật biến nạp thông thường chỉ sử dụng vi khuẩn A tumefaciens Z N Yang và cs (2000) [56] thực hiện thành công nghiên cứu chuyển gen vào giống bưởi Rio Red (Citrus paradisi Macf.) thông qua vi khuẩn A tumefaciens Trong nghiên cứu, nhóm tác giả đã thiết kế thành công vector... sử dụng cho nghiên cứu biến nạp Kiểm tra sự có mặt của gen bar bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho thấy tất cả 15 dòng cây chuyển gen có biểu hiện dương tính đều mang gen chuyển, hiệu quả chuyển gen đạt 5 % Mới đây nhất Phan Hữu Tôn và cs (2013)[22] đã thành công trong việc chuyển gen mẫn cảm Auxin hoạt động đặc thù bầu nhụy đã mở ra hướng mới trong tạo giống cam, quýt không hạt Trong nghiên cứu này, vector... lượng bưởi Năm Roi của cả nước: trong đó tập trung ở huyện Bình Minh: 3,4 ngàn ha đạt sản lượng gần 30 ngàn tấn Tiếp theo là tỉnh Hậu Giang (1,3 ngàn ha) Giống bưởi Da xanh mới chọn lọc cách đây khoảng chục năm nhưng diện tích trồng bưởi này ở Bến Tre đã là 1 544 ha (Lương Thị Kim Oanh, 2011)[18] 2.7 Nghiên cứu chuyển gen cây bưởi trên thế giới và Việt Nam 2.7.1 Tình hình nghiên cứu chuyển gen cây bưởi. .. trình tổng hợp của các gen thông qua sự biểu hiện của gen gus Sự biểu hiện tạm thời của gen gus ở phôi non lúa sau khi bắn gen không phụ tuộc vào promoter được chuyển Trong khi đó sự biểu hiện bền vững của gen gus chỉ quan sát được ở cây lúa chuyển gen có promoter RCg2 và kết quả phân tích bằng PCR và lai Southern blot ở những cây T0 cho thấy sự có mặt của gen gus tại 1,1 kb và gen hph tại 0,76kb (Đoàn . trình chuyển gen vào giống bưởi đỏ. - Cung cấp tài liệu học tập nghiên cứu cho sinh viên. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu chuyển gus, bar vào giống bưởi đỏ nhằm xem khả năng tiếp nhận gen. khả năng chuyển gen gus, bar vào giống bưởi đỏ thông qua Agrobacterium tumefaciens. 1.3. Yêu cầu của đề tài - Xác định được tuổi mẫu thân mầm đến hiệu quả biến nạp gen gus vào bưởi đỏ. - Xác. thông qua Agrobacterium tumefaciens sẽ là cơ sở cho những nghiên cứu thử nghiệm chuyển gen hữu ích vào cây bưởi nói riêng và cây ăn quả nói chung. 1.2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu được