Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam

Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam Sơ bộ đánh giá ngưu tất được sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn theo tiêu chuẩn dược điển việt nam

BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI Trần Thị Bích Hợp Sơ Bộ ĐÁNH GIÁ NGUU TẤT Đưực SẢN XUẤT ■ ■ THEO PHITONG PHÁP SẢN XUẤT Dược LIỆU AN TOÀN ■ ■ THEO TIÊU CHUẨN Dược ĐIỂN VIỆT NAM ■ ■ (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHÓA 1999 - 2004) Người hướng dẫn: TS v ũ VĂN ĐIỂN ThS NGUYỄN HOÀNG TUÂN Nơi thực : BỘ MÔN D ợ c HỌC c ổ TRUYỂN BỘ MÔN DƯỢC LIỆU Thời gian thực hiện: T3/2004 - T5/2004 HÀ NỘI 05/2004 /v9i t - % r v LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc thầy giáo: TS Vũ Văn Điền- Bộ môn Dược học cổ truyền ThS Nguyễn Hồng Tuấn - Bộ mơn Dược Liệu Đã giao đề tài hướng dẫn tận tình, chu đáo, bảo mặt khoa học suốt q trình thực khố luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy, cô mơn Dược học cổ truyền, mơn Phân tích, mơn Dược Liệu, gia đình, người thân tồn thể bạn bè giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khố luận tốt nghiệp Hà Nội, tháng 5/2004 Sinh viên Trần Thị Bích Hợp QUY ƯỚC CHỮ VIẾT TẮT Ml : Mẫu xông sinh M2 : Mẫu sấy khô (không xông sinh) M3 : Mẫu thị trường STT : Số thứ tự TT : Thuốc thử NXB: Nhà xuất MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN - TỔNG QUAN 1.1 Tóm tắt đặc điểm vị thuốc Ngưu tấ t 1.1.1 Đặc điểm thực vật- phân bố 1.1.2 Bộ phận dùng, chế biến, bào chế cổ truyền 1.1.3 Công dụng .5 1.1.4 Thành phần hoá học 1.1.5 Tác dụng dược lý : 1.2 Vài nét sản xuất dược liệu an toàn PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT q u ả .12 2.1 Nguyên liệu phương pháp thưc nghiệm: 12 2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất phương tiện: 12 2.1.2 Phương pháp thực nghiệm .12 2.2 Kết thực nghiệm nhận xét 13 2.2.1 Mơ tả đặc điểm bên ngồi rễ Ngưu tất 13 2.2.2 Đặc điểm vi học rễ Ngưu tấ t 14 2.2.3 Xác định độ ẩm rễ Ngưu tất 16 2.2.4 Xác định tro toàn phần rễ Ngưu tất 17 2.2.7 Định tính số nhóm chất rễ Ngưu tất 22 2.2.8 Định tính Saponin 32 PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ x u ấ t 38 3.1 Kết luận 38 3.2 Đề xuất 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 ĐẶT VÂN ĐỂ Cây thuốc sản phẩm chúng (Dược liệu) sản phẩm nông nghiệp cao cấp, chúng sử dụng rộng rãi làm thuốc làm nguyên liệu cho công nghiệp dược Ngày nhu cầu lương thực, thực phẩm nói chung dược liệu nói riêng ngày tăng Trên thực tế sản phẩm nông nghiệp nước ta chưa dồi đủ cho yêu cầu hàng ngày ngưòi Người ta buộc phải dùng nhiều loại phân bón, nhiều loại thuốc trừ sâu để nâng cao suất, đảm bảo cho mùa màng không bị giảm sút phải dùng số chất hố học q trình sơ chế để cất giữ bảo quản nông sản Hiện nay, sản phẩm nông nghiệp nước ta (nhất rau, quả) báo động nhiễm chất độc hại cho sức khoẻ như: Dư lượng thuốc trừ sâu, diệt cỏ, thuốc kích thích tăng trưởng, hàm lượng nitrat, kim loại nặng, chất bảo quản chống mốc, mọt chất chống côn trùng khác, chất bảo quản giữ cho hoa tươi đẹp, chất dùng trình chế biến làm mềm, dai, chất màu vượt mức quy định cho phép Ngoài ra, phải kể đến tác động yếu tố gây biến đổi gen, tạo giống nguy gây tổn hại sức khoẻ người Cây thuốc trồng trọt mọc hoang dại môi trường nông nghiệp sản phẩm từ thuốc khơng thể tránh khỏi nguy có tồn dư chất độc hại Để khắc phục tình trạng đó, ngành Nơng nghiệp nước ta bước phát triển nông nghiệp sạch, bền vững để đảm bảo an toàn cho người dùng, hoà nhập với nước khu vực giới Để có nguồn dược liệu an tồn cho người sử dụng hồ nhập với khu vực giới ngành dược liệu có sách phát triển Dược liệu an tồn bền vững Sản phẩm làm đạt suất cao mà cịn phải có chất lượng tốt, an toàn Để tạo dược liệu an toàn bao gồm nhiều khâu như: trồng trọt, chế biến, bào chế, bảo quản sạch.v.v Viện Dược liệu bắt đầu nghiên cứu quy trình trồng chế biến dược liệu an tồn Mộtsố thuốc, có Ngưu tất, chọn làm đối tượng nghiên cứu đề tài Trong khn khổ khố luận này, chúng tơi sơ nghiên cứu đánh giá dược liệu Ngưu tất sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn Trung tâm nghiên cứu trồng chế biến thuốc Hà Nội cung cấp theo tiêu chuẩn Ngưu tất Dược điển Việt Nam in với số nội dung sau: - Đánh giá số tiêu chuẩn mặt cảm quan - Đặc điểm vi học - Phản ứng định tính hóa học Có so sánh với Ngưu tất thị trường để góp phần vào chiến lược phát triển nguồn dược liệu an toàn nước ta PHẦN - TỔNG QUAN 1.1 Tóm tắt đặc điểm vị thuốc Ngưu tất 1.1.1 Đặc điểm thực yật- phân bố a Đặc điểm thực vật Cây Ngưu Tất có tên khoa học: Achyranthes bidentata Blume, họ Rau giền: Amaranthaceae [1,4,9] Ngồi cịn có tên khác như: Hoài Ngưu Tất, Ngưu tịch [3] Người Trung Quốc gọi là: Niu-xi Rễ Ngưu Tất có tên tiếng Anh Two-toothed chaff-flower [25] Rễ Ngưu Tất khô gọi là: Mao Ngưu Tất Là thảo sống hàng năm, cao từ 60-80cm Thân mọc thẳng đứng, hình vng, có nhiều đốt, màu lục màu nâu tím, có nhiều cành mọc đối [21] Lá mọc đối, hình bầu dục, gốc thuôn hẹp, mép uốn lượn Phiến dài 5-10cm, rộng l-4cm, có lơng khơng có lơng gân phụ 5-7 cặp, cuống ngắn l-3cm [21] Hoa lưỡng tính, cụm hoa bơng đầu cành hay kẽ lá, màu trắng xanh [4,9,15] Hoa mọc hướng lên biến thành mọc quặp xuống [4,21] Quả nang, chứa hạt hình trụ dài, bắc cịn lại nhọn thành gai mắc vào quần áo [4] Rễ phình thành củ hình trụ, dài 30-50cm, màu trắng màu hồng nhạt [3,9,21] Ra hoa tháng 5-9 Quả tháng 10-11 [4,9] b Phân bố: Cây Ngưu Tất dễ thích nghi với điều kiện khí hậu khác Cây trồng chủ yếu số nước Châu Á như: Trung Quốc, Ấn Độ, Lào, Malaixia, Campuchia, Thái Lan [29] Ở Việt Nam, Ngưu Tất di thực vào từ năm 1960 trồng thử Sa Pa, Tam Đảo, Văn Điển Gần đây, thích nghi với khí hậu Việt Nam trồng khắp nơi đồng lẫn miền núi, nhiều khu vực đồng Bắc Bộ [29] 1.1.2 Bộ phận dùng, chế biến, bào chế cổ truyền: Rễ (Radix Achyranthis bidentatae) chế biến phơi sấy khô Ngưu tất (Achyranthes bidentata Blume, họ Rau giền Amaranthaceae) [1,2,4,6,9,16] Chế biến Ngưu tất: Rễ Ngưu tất thu hái vào mùa thu,có nhiều cách chế biến khác tuỳ theo vùng, địa phương: - Ngưu tất sau thu hoạch đem rửa bùn đất phơi sấy khô [23] - Ngưu tất sau thu hoạch cắt bỏ rễ rửa xông sinh đêm, phơi sấy khô nhiệt độ 40 - 50°c đến độ thuỷ phần 15 - 18% phân loại bó thành bó để bảo quản [22] - Ngưu tất sau thu hoạch cắt bỏ rễ rũ đất, phoi héo đem xông sinh cho mềm, rửa phơi khô nhăn vỏ, xông sinh để bảo quản Độ ẩm nhỏ 13% [3, 6] - Ngưu tất sau thu hoạch rũ đất, để bó thành bó, ngày phơi đêm cất vào, phơi - ngày, sau ủ ngày, dùng chiếu phủ lên Ngưu tất, cắt bỏ Phân loại bó thành bó khoảng 0,5kg để bảo quản tỷ lệ tươi/khơ 3/1 [3] Chế biến cổ truyền Có nhiều cách chế biến khác tuỳ mục đích điều trị mà chọn cách chế biến thích hợp - Ngưu tất thái phiến cắt đoạn (dùng sống) [20, 23, 24] - Ngưu tất cám [20, 24] - Ngưu tất trích rượu [6, 7,20,24] - Ngưu tất thán [20, 24] - Ngưu tất đen [20, 24] - Ngưu tất trích muối [7, 20,24] Bảo quản: Dược liệu để nơi khô mát, tránh ẩm mốc mọt [9] 1.1.3 Công dụng Theo Hải Thượng Y tông tâm lĩnh-Lê Hữu Trác: Rễ Ngưu Tất có vị đắng, chua, tính bình, không độc, chủ yếu vào kinh: Can, Thận [2, 6, 8, 9, 11,14, 21] * Công năng- chủ trị: - Hoạt huyết thông kinh hoạt lạc: Dùng trường hợp kinh nguyệt bế, kinh nguyệt không [6,8,9] - Bổ can thận, thư gân, mạnh gân cốt: Dùng cho bệnh đau khớp đau lưng, đau xương sống, liệt chân, co gân không duỗi được, đặc biệt khớp gối chân Nếu thấp mà nặng (thiên) hàn phối hợp với Quế chi, cẩu tích, Tục đoạn; Nếu thấp mà nặng (thiên) nhiệt phối hợp với Hồng bá [3,6,8,9] - Chỉ huyết: Thường dùng trường hợp hoả độc bốc lên gây nơn máu, chảy máu cam, phối hợp với thuốc tâm giáng hoả thuốc huyết khác chảy máu huyết ứ gây thoát quản [6] - Lợi niệu, trừ sỏi: Dùng trường hợp tiểu tiện đau buốt, tiểu tiện sỏi đục [6,8] - Giáng áp: Dùng cho bệnh nhân cao huyết áp, khả làm giảm Cholesterol máu [6] - Giải độc, chống viêm: Dùng phịng bệnh Bạch hầu; lợi bị sưng thũng [6] Tóm lai: Ngưu Tất dùng để chữa chứng bệnh sau: thấp khớp, đau lưng, bế kinh, thông kinh, huyết áp cao, bệnh tăng Cholesterol máu, đái buốt máu, đẻ khó thai khơng ra, sau đẻ ứ huyết, chấn thương tụ máu, viêm họng Liều dùng, cấm kỵ - Liều: 6-12g, dạng thuốc sắc [6] - Cấm kị [6]: Người có thai Người bị mộng hoạt tinh Người rong kinh có chảy máu nhiều - Nếu dùng với tính chất để khí vị xuống hạ tiêu, chữa phận phía dùng khơng qua chế biến [6] - Khi rượu trích muối tẩm rượu chưng có tác dụng bổ [6] I.1.4 Thành phần hố học Saponin: thuỷ phân cho Sapogenin Acid oleanolic (C3 H48O3), Galactose, Rhamnose, Glucose [2, 4, II,2 ,2 ,2 ,2 ] Hàm lượng acid oleanolic xác định 0,91 %-1,14% với Ngưu tất trồng, 0,78%-1,42% Ngưu tất tự nhiên [2, 29] Ngồi ra, cịn có Ecdysteron, inokosterol [2, 4, 15, 21, 29] Chất dính, muối kali [23] Lượng ecdysteron khoảng 0,037% [2,9] peptide-polysaccharide với tác dụng chống miễn dịch có chứa 24,1% peptide gồm: Glycine, Serine, Glutamic Aspartic acid [2, 29] Betaine chiếm, khoảng 0,93%-1,029% rễ chất bền vững trình biến thuốc [2] 2.2.1.6 Định tính Anthranoid: * Phản ứng Bc&traeger: Cho lOg bột dược liệu vào bình nón dung tích 250ml, thêm lOOml acid H2S04 10% Đun cách thuỷ 15 phút, lọc, chuyển dịch lọc vào bình gạn, lắc với 10ml CHC13 để phân thành lớp Gạn lấy dịch chiết CHCI3, cho vào dịch chiết CHCI3 2ml NaOH 10%, lắc đều, thấy lớp nước khơng có màu đỏ sim Phản ứng âm tính Thí nghiệm tiến hành song song với mẫu thử lặp lại lần cho kết * Vi hăng hoa: Đặt bột dược liệu nắp nhôm Hơ nhẹ đèn cồn bay hợi dược liệu Đặt lên miệng nắp nhơm phiến kính, phiến kính có để miếng bơng tẩm nước lạnh Để nắp nhôm trực tiếp nguồn nhiệt Sau 5- 10 phút lấy phiến kính ra, để nguội Quan sát kính hiển vi khơng thấy có tinh thể hinh kim Phản ứng âm tính Thí nghiệm tiến hành song song với mẫu thử lặp lại lần cho kết Sơ kết luận: Trong dịch chiết rễ Ngưu tất khơng có Anthranoid 22.1.1 Định tính Acid hữu đường khử tự Chuẩn bị dịch chiết Cho vào ống nghiệm to: 2g bột dược liệu, thêm 10ml nước cất đun sơi phút, lọc nóng, dịch lọc thu để làm phản ứng định tính sau: a Định tính Acid hữu Lấy 3ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài tinh thể Na2C03, thấy có bọt khí bay lên Phản ứng dương tính Thí nghiệm tiến hành song song với mẫu thử lặp lại lần cho kết Sơ kết luận: Trong dịch chiết rễ Ngưu tất có Acid hữu 28 b Định tính đường khử tự Cho vào ống nghiệm khoảng ml dịch chiết nước dược liệu, thêm 0,5ml thuốc thử Fehling A 0,5ml thuốc thử Fehling B Đun sôi cách thuỷ vài phút, thấy xuất màu đỏ gạch Phản ứng dương tính Thí nghiệm tiến hành song song với mẫu thử lặp lại lần cho kết Sơ kết luận: Trong dịch chiết rễ Ngưu tất có đường khử tự 2.2.7.8 Định tính Saponin: Cho khoảng lOg bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thêm 20ml ethanol 90° Ngâm lạnh qua đêm, lọc Dịch chiết dùng để làm phản ứng định tính Saponin: * Phản ứng tao bot: Trong ống nghiệm to chứa sẵn 10ml nước cất, thêm ml dịch chiết cồn Lắc mạnh dọc theo thành ống nghiệm phút Quan sát thấy cột bột cao 2cm bền sau 15 phút Phản ứng dương tính Bảng 5: Kết phản ứng tạo bọt Số mẫu Độ cao cột bọt (ml) Trung bình (mi) MI 2,2 2,4 2,1 2,2 M2 2,4 2,5 2,2 2,4 M3 2,1 2,3 2,4 2,3 Thí nghiệm tiến hành song song với mẫu thử lặp lại lần cho kết * Phản ứng phân biẽt Saponin steroid Sa ponin triterpenoid: Cho vào ông nghiệm to: lg dược liệu,thêm 5ml nước, đun sôi cách thuỷ 15 phút, lọc Lấy ống nghiệm: Ống 1: 5ml HC1 0,1N (pH = 1) Ông 2: 5ml NaOH 0,1N (pH = 13) 29 Cho thêm vào ống nghiệm giọt dịch chiết, lắc mạnh ống nghiệm phút, để yên.Thấy cột bột ống nghiệm cao bền Thí nghiệm tiến hành song song với mẫu thử lặp lại lần cho kết Sơ kết luận dịch chiết có Saponin triterpenoid * Phản ứng Liebermann - Burchard: Lấy ml dịch chiết cồn cho vào ống nghiệm, bốc đến cạn.Hoà tan cắn lml cloroform, thêm lml anhydrid acetic, cho từ từ lml acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm.Thấy xuất vòng màu tím đỏ lớp phân cách Phản ứng dương tính Thí nghiệm tiến hành song song với mẫu thử lặp lại lần cho kết * Phản ứng Salkowski: Lấy lml dịch chiết cồn cho vào ống nghiệm, bốc đến cạn Hoà tan cắn lml cloroform, cho từ từ lml acid sulfuric đậm đặc (d = 1,76) theo thành ống nghiệm.Thấy xuất vòng nâu đỏ lớp phân cách Phản ứng dương tính Thí nghiệm tiến hành song song với mẫu thử lặp lại lần đểu cho kết Sơ kết luận: Trong dịch chiết rễ Ngưu tất có Saponin triterpenoid Phương pháp kết định tính số nhóm chất rễ Ngưu tất tóm tắt bảng 30 Bảng 6: Kết định tính số nhóm chất rễ Ngưu tất STT 1 ! Nhóm chất Phương pháp định tính Alkaloid - Với TT Mayer - Với TT Bouchardat - Với TT Dragendorff - Với TT Ninhydrin.0,2% - Phản ứng Liebermann - Phản ứng Legal - Phản ứng Baljet - Phản ứng Keller- Kiliani Acid amin Glycosid tim Coumarin Flavonoid Tanin Anthranoid 10 Acid hữu Đường khử tự Saponin - Với TT Ninhydrin - Phản ứng mở đóng vịng lacton - Vi thăng hoa - Phản ứng Cyanidin - Phản ứng với NaOH 10% -Phản ứng với amoniac đặc - Phản ứng với FeCl3 5% - Với FeCl3 5% - Với dung dịch gelatin 1% - Phản ứng Bomtraeger - Vi thăng hoa - Phản ứng với bột Na2CO^ - Với TT Fehling A, B Kết Kết SBKL — _ Không — ++ — Có _ Khơng — — Khơng _ — Khơng — — — Khơng Khơng — ++ +++ Có Có - Phản ứng tạo bọt +++ Có - Phân biệt loại Saponin + + + Saponi- Phản ứng liebermannn ++ Burchard triterpe -Phản ứng Salfawski -noid ++ Chất béo - Vết mờ giấy lọc + Có 11 Chú thích: (-): Phản ứng âm tính; (+): Phản ứng dương tính; (++): Phản ứng dương tính rõ; (+ + +): Phản ứng dương tính rõ *Kết luân: Trong rễ Ngưu tất có acid amin, acid hữu cơ, đường khử tự do, saponin chất béo 31 2.2.8 Định tính Saponin Qua kết định tính cho thấy, Saponin nhóm chất có rễ Ngưu tất, phần định tính sơ Phần chúng tơi định tính Saponin sắc ký lớp mỏng; số tạo bọt số phá huyết để đánh giá đầy đủ Ngưu tất sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn a Định tính Saponin sắc kí lớp mỏng: * Chuẩn bi dich chấm sắc kv: Cân 2g bột dược liệu, thêm 20ml ethanol (TT), đun nóng cách thuỷ hồi lưu vòng 40 phút, để yên Lấy 10ml dung dịch phía trên, thêm lml dung dịch HC1 đậm đặc (TT), đun cách thuỷ hồi lưu vòng lh, dịch chiết cịn khoảng 5ml, thêm 10ml nước, chiết với ether dầu hoả (độ sôi 60 90°C) Bốc dịch chiết ether dầu hoả đến cắn, hoà cắn vào 2ml ethanol 80° làm dung dịch chấm sắc kí * Triển khai sắc kí: - Dùng mỏng Silicagel tráng sẵn, dày 0,25mm, hoạt hoá 110°c/lh - Khai triển số hệ dung môi: + n- Buthanol bão hoà nước[13] + n- Buthanol - acid acetic - nước (4:1: 1) [ 13] + Cloroform - methanol - nước (65: 35: 10) [3,13] + Cloroform - methanol (19: 1) [3,9,13] + n- Buthanol - ethanol - amoniac 25% ( 7: 2: 5) [19,21] + Cloroform - aceton (4: 1); ( 9: 1) [13] + Cloroform - ethyl acetat (4: 1); (9: 1) [13] - Thuốc thử màu: Dung dịch 1% Vanilin/cồn tuyệt đối, thêm 2ml H2S04 đậm đặc Trong đó, hệ dung mơi n- Buthanol - ethanol - amoniac 25% (7:2:5) tách vết rõ Chúng chọn hệ để ghi lại kết bảng 32 Bảng 7: Kêít định tính Saponỉn rễ Ngưu tất sắc ký lốp mỏng SỐTT vết MI Rf M2 M3 Màu vết sau phun TT màu 0,37 0,35 0,36 Xanh 0,48 0,47 0,46 Nâu 0,58 0,57 0,56 Xanh đen 0,66 0,64 0,63 Tím Ảnh 3: Sắc kí đồ định tính Saponin M2 M3 MI Nhận xét: Trên sắc ký đồ thể vết loại mẫu, vết thứ (màu xanh đen) to đậm 33 b Xác định số tạo bọt [4] Chỉ số bọt số ml nước để hoà tan Saponin lg nguyên liệu cho cột bọt cao lcm sau lắc đọc * Tiến hành: Cân lg bột rễ Ngưu tất (rây qua rây 32) Cho vào bình nón 500ml chứa sẵn lOOml nước sôi, giữ cho sôi nhẹ 30 phút, lọc nguội thêm nước vừa đủ 100ml Lấy 50ml dịch lọc cho vào bình định mức 100ml, thêm nước vừa đủ 100ml Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm, đường kính 16mm, cho vào ống nghiệm 1,2,3,— ml dịch chiết Thêm nước ,10 cất cho đủ ống 10ml Bịt miệng ống nghiệm, lắc theo chiều dọc 15 giây, lần/ giây Để yên 15 phút, đo chiều cao cột bọt Thí nghiệm tiến hành song song với mẫu thử lặp lại lần cho kết bảng 8: Bảng 8: Kết xác định số tạo bọt rễ Ngưu tất Mẫu Số gam tương ứng 0,25 Chỉ số tạo bọt MI Ơng nghiệm có cột bọt cao lcm ống M2 ống 0,03 333,33 M3 ống 0,02 250 400 Nhân xét: mẫu có số tạo bọt >250 Mẫu Ml có số tạo bọt cao (400), mẫu M3 thấp (250) Điều cho thấy lượng Saponin mẫu Ml lớn nhất, mẫu M3 thấp mẫu c Xác định số phá huyết: [4] Chỉ số phá huyết số ml dung dịch đệm cần thiết để hoà tan lg dược liệu chứa Saponin gây tượng phá huyết hoàn toàn loại máu chọn (tiến hành điều kiện qui định) 34 * Tiến hành: - Chuẩn bị dung dịch cần thiết: + Pha dung dịch đệm: Dung dịch NaCl 0,9% + Pha dung treo máu: Loại fibrin máu bị: Lấy 300ml máu bị cho vào bình lít có miệng rộng, dùng đũa thuỷ tinh khuấy trịn khoảng 10 phút, lọc qua gạc để loại fibrin, để tủ lạnh + Pha dung treo máu 2%: Cho 40ml NaCl 0,9% vào bình định mức dung tích 100ml, thêm xác 2,0ml dung dịch máu bị loại fibrin Lắc nhẹ Thêm dung dịch NaCl 0,9% vừa đủ 100ml + Chuẩn bị dịch chiết rễ Ngưu tất 2,5%: Cân xác 2,5g bột rễ Ngưu tất tán nhỏ cho vào bình nón dung tích 100ml Cho thêm 100ml dung dịch NaCl 0,9% vừa đun sôi Lắc đặt nồi cách thuỷ sôi, đun sôi 30 phút Lọc nóng qua bơng vào cốc có mỏ Để nguội Chuyển dung dịch vào bình định mức 100ml Tráng bình nón dung dịch 0,9% lọc qua lớp sử dụng Thêm dung dịch NaCl 0,9% đến vừa đủ 100ml, lắc Lấy 20 ống nghiệm nhỏ (5m l), đánh số thứ tự từ lđến 20 cho vào ống dung dịch theo bảng Trộn dung dịch cách bịt miệng ống nghiệm ngón tay dốc ngược dung dịch cách nhẹ nhàng (làm tất với 20 ống nghiệm) Sau 15 phút trộn lại lần Để yên 24 giờ, đọc kết 35 Bảng 9: Xác định số phá huyết STT Dung dịch NaCl 0,9% ( ml ) Dịch chiết rễ Ngưu tất 2,5% (ml) 0,95 0,90 0,85 0,80 0,75 0,70 0,65 0,60 0,55 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95 1,00 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dung dịch máu bò 2% loai fibrin (mi) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Thí nghiệm tiến hành song song với mẫu thử lặp lại lần cho kết sau: - Mẫu M l: Tụ huyết 20 ống - Mẫu M2: ống số phá huyết hoàn toàn - Mẫu M3: Tụ huyết 20 ống * Kết luân: + MI M3 khơng có tượng phá huyết mà xảy tượng tụ huyết, nồng độ dịch chiết cao tụ huyết nhiều Mẫu MIvàM3là mẫu có xơng sinh lượng S02 mẫu caonên xảy tượng tụ huyết 36 + M2 số phá huyết tính theo cơng thức: c sph = c7 x Trong đó: c : nồng độ dịch chiết rễ Ngưu tất (2,5%) X : số ml dịch chiết rễ Ngưu tất cho vào ống nghiệm mà ống có phá huyết hồn tồn Chỉ số phá huyết dịch chiết rễ Ngưu tất mẫu sấy là: c s ™ = ) 100 = 200 Vậy số phá huyết mẫu sấy 200 37 PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 3.1 Kết luận Sau thời gian tháng nghiên cứu chúng tơi sơ có số kết luận sau: - Đã khảo sát loại mẫu rễ Ngưu tất (mẫu xông sinh, mẫu sấy mẫu mua phố Lãn Ông) Kết cho thấy: + Ngưu tất xơng sinh có hình thức bên ngồi đẹp Ngưu tất sấy khơ Ngưu tất mua phố Lãn Ông + Ngưu tất mua phố Lãn Ơng (M3) có số trương nở thấp hơn, độ ẩm cao nhiều so với tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam III (44,82%), độ tro toàn phần cao hon so với mẫu M l, M2 + Lượng chất chiết nước cao lượng chất chiết ethanol 80°, lượng chất chiết mẫu M3 thấp mẫu hai phương pháp chiết nước chiết ethanol 80° + Tiến hành định tính nhóm chất có dược liệu phản ứng hố học, định tính Saponin sắc ký lớp mỏng nhận thấy: (+) Các phản ứng hố học lên màu (+) Trên sắc ký đồ lên vết tất loại mẫu rễ Ngưu tất Vậy dựa vào định tinh phản ứng hoá học sắc ký lớp mỏng khơng thể phân biệt mẫu Ngưu tất chế biến theo phương pháp khác (mẵu xông sinh không xông sinh) (+) Chỉ số tạo bọt: Mẫu Ml có số tạo bọt lớn (400); mẫu M3 thấp nhất, lượng Saponin mẫu M3 nhỏ nhất, mẫu Ml lớn (+) Chỉ số phá huyết: mẫu MI M3 xảy tượng tụ huyết, lượng lưu huỳnh mẫu cao mà cản trở phá huyết gây 38 tượng tụ huyết trước phá huyết Ở mẫu sấy (M2), số phá huyết 200 Vì vậy, dùng rễ Ngưu tất với mục đích hoạt huyết nên dùng rễ Ngưu tất sấy (khơng xơng sinh) - Đối chiếu với tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam Ngưu tất sản xuất theo phương pháp sản xuất thuốc an tồn loại khơng xơng sinh đạt u cầu Ngưu tất xông sinh Ngưu tất mua thị trường chế đạt yêu cầu Ngưu tất mua thị trường có độ ẩm cao quy định gây tụ huyết, Ngưu tất xông sinh gây tụ huyết 3.2 Đề xuất *Với thời gian có hạn, số kết nghiên cứu sơ bộ, độ lặp lại thấp, để có đánh giá đầy đủ, chặt chẽ vị thuốc Ngưu tất sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn cần: - Nghiên cứu xác định giới hạn cho phép hàm lượng S02 tồn dư Ngưu tất xông sinh để Ngưu tất xơng sinh phá huyết bình thường Ngưu tất không xông sinh, vừa đảm bảo tác dụng Ngưu tất, vừa bảo quản tốt - Định lượng nguyên tố vi lượng (Cu, Zn, Mn, Pb, As ) rễ Ngưu tất - Định lượng dư lượng thuốc bảo vệ thực vật rễ Ngưu tất - Cần nghiên cứu kỹ số phá huyết nhiều mẫu Ngưu tất xông sinh để khẳng định mẫu xông sinh không phá huyết mà tụ huyết, từ bổ sung tiêu chuẩn vào Dược điển Việt Nam giúp cho phân biệt Ngưu tất xông sinh Ngưu tất không xông sinh 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Đỗ Huy Bích (1995), Thuốc từ cỏ động vật, NXB Khoa học kỹ thuật Hà nội, Tr 312 [2] Đỗ Huy Bích cộng (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc ỏ Việt Nam (tập 2), NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, Tr.430 - 435 [3] Ban huấn luyện đào tạo cán dược liệu Trung Quốc (1979), Kỹ thuật nuôi trồng chế biến dược liệu NXB Nông nghiệp,Tr 285 (bản dịch) [4] Bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược- HN (1998) Bài giảng Dược liệu (Tập 1), Trung tâm thông tin thư viện trường Đại học Dược HN.Tr 137 140 ,157-159 [5] Bộ môn Dược liệu trường Đại học dược- HN (1999), Thực tập Dược liệu Trung tâm thông tin thư viện trường Đại học Dược- HN [6] Bộ môn Dược học cổ truyền trường Đại học Dược- HN (2000), Bài giảng Dược học cổ truyền , NXB Y học Tr 292-293 [7] Bộ môn Dược học cổ truyền trường Đại học Dược- HN (1997), Thực tập Dược học cổ truyền, Trung tâm thông tin trường Đại học Dược HN.Tr 13 [8] Bộ môn Y học cổ truyền trường Đại học Y- HN (1993), Bài giảng Y học cổ truyền NXB Yhọc.Tr 197 [9] Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, NXB Yhọc.Tr 430 [10] Bộ Y tế(T3/2003), Tài liệu Hội nghị dược liệu toàn quốc lần thứ nhất"Phát triển dược liệu bền vững kỷ 21 [11] Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học HN Tr 856 [12] Vũ Văn Chuyên (1991), Bài giảng thực vật học, NXB Y học [13] Đỗ Trung Đàm (1994), Tác dụng Ngưu tất hàm lượng Serotonin ỏ não chuột cống trắng, Thông báo dược liệu, số 4, Tr 97 - 99 [14] Kiểm nghiệm dược liệu phương pháp hiển vi, (2003), NXB Khoa học kỹ thuật Tr 181 [15] Phạm Hoàng Hộ, (1999), Cây cỏ Việt Nam (Quyển 1), NXB trẻ Tr.730 [16] Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học.Tr.48-49 [17] Nguyễn Thuần, Stefan Nikolop, Nguyễn Thượng Dong, (1995), Nghiên cứu hoá học phần mặt đất Ngưu Tất (Tạp chí dược học số 6) Tr.17,18,21 [18] Nguyễn Viết Thân (1999), ASLAS giải phẫu thuốc, NXB Khoa học & Kỹ thuật [19] Ngô Văn Thu (1990), Hố học Saponin, NXB thành phố Hồ Chí Minh.Tr 125,160 [20] Phạm Xuân Sinh (1999), Phương pháp chế biến thuốc cổ truyền, NXB Y học.Tr.206, 207 [21] Trung tâm biên soạn từ điển bách khoa (1999), Từ điển Bách khoa Dược học, NXB Từ điển Bách khoa Hà Nội Tr 436, 437 [22] Viện Dược liệu (1976), Kỹ thuật trồng thuốc, NXB Y học Tr 116 [23] Viện Đông Y Hà nội (1986), Phương pháp bào chế Đông dược Trung ương hội Y học cổ truyền Việt Nam.Tr 218, 219 [24] Viện Dược liệu (1991), Tiêu chuẩn sở bột Bidentin Tr 4, 5, Tài liệu nước [25] Pharmacopoeia of the republic of China Chemical industry press English edution (1997), page 133 [26] Anne - Claire Mitaine - offer, adderrazak Manroufetcal (2001): Two Tritepene Saponins from Achyranthes bidentata Chem.pharm.bull 49(11) Page 1492 - 1494 [27] Li-X, Hu- s (1995) "Determimation of oleanolic acid in the root of Achyranthes bidentata Bị from diffirent places of production by TLCscanning", Chung Kuo Chung Yao Tsa Chih, page 511 [28] National institute of material mcdica, Selected medicinal plants in Vietnam, Science and technology publishing house, vol 1, page 21 - 25 [29] Wei S., Liang H., Zhao Y, Zhang R (1997): Seperation and ldentipication of the Compoumds from Achyranthes bidentata Bl [30] World health organization Geneva (1998): Quality control methods for medicinal plant materials [31].World health organization Geneva (1999): WHO monographs on selected medicinal plants Volume [32] Yu - s, Zhang - Y (1995 Jun),” Effect of Achyranthes bidentata polysaccharides (ABP) on antitumor activity and immune function of SI 80 bering mice", Chung Hua Chung Liu Tsa Chih, page 275 - 278 ... thuốc, có Ngưu tất, chọn làm đối tượng nghiên cứu đề tài Trong khn khổ khố luận này, chúng tơi sơ nghiên cứu đánh giá dược liệu Ngưu tất sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn Trung... huyết để đánh giá đầy đủ Ngưu tất sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn a Định tính Saponin sắc kí lớp mỏng: * Chuẩn bi dich chấm sắc kv: Cân 2g bột dược liệu, thêm 20ml ethanol (TT),... vậy, dùng rễ Ngưu tất với mục đích hoạt huyết nên dùng rễ Ngưu tất sấy (không xông sinh) - Đối chiếu với tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam Ngưu tất sản xuất theo phương pháp sản xuất thuốc an tồn loại