Qua kết quả định tính trên đây cho thấy, Saponin là nhóm chất chính có trong rễ Ngưu tất, ở phần trên mới định tính sơ bộ. Phần này chúng tôi định tính Saponin trên sắc ký lớp mỏng; chỉ số tạo bọt và chỉ số phá huyết để đánh giá đầy đủ hơn về Ngưu tất sản xuất theo phương pháp sản xuất dược liệu an toàn.
ạ Định tính Saponin bằng sắc kí lớp mỏng:
* Chuẩn bi dich chấm sắc kv:
Cân 2g bột dược liệu, thêm 20ml ethanol (TT), đun nóng cách thuỷ hồi lưu trong vòng 40 phút, rồi để yên. Lấy 10ml dung dịch ở phía trên, thêm lml dung dịch HC1 đậm đặc (TT), đun cách thuỷ hồi lưu trong vòng lh, cô dịch chiết còn khoảng 5ml, thêm 10ml nước, chiết với ether dầu hoả (độ sôi ở 60 - 90°C). Bốc hơi dịch chiết ether dầu hoả đến cắn, hoà cắn vào 2ml ethanol 80° làm dung dịch chấm sắc kí.
* Triển khai sắc kí:
- Dùng bản mỏng Silicagel tráng sẵn, dày 0,25mm, đã được hoạt hoá ở 110°c/lh. - Khai triển trên 1 số hệ dung môi:
+ n- Buthanol bão hoà nước[13].
+ n- Buthanol - acid acetic - nước (4:1: 1) [ 13]. + Cloroform - methanol - nước (65: 35: 10) [3,13]. + Cloroform - methanol (19: 1) [3,9,13].
+ n- Buthanol - ethanol - amoniac 25% ( 7: 2: 5) [19,21]. + Cloroform - aceton. (4: 1); ( 9: 1) [13].
+ Cloroform - ethyl acetat. (4: 1); (9: 1) [13]. - Thuốc thử hiện màu:
Dung dịch 1% Vanilin/cồn tuyệt đối, thêm 2ml H2S04 đậm đặc.
Trong đó, hệ dung môi n- Buthanol - ethanol - amoniac 25% (7:2:5) tách vết rõ hơn cả. Chúng tôi chọn hệ này để ghi lại kết quả ở bảng 7.
Bảng 7: Kêít quả định tính Saponỉn trong rễ Ngưu tất bằng sắc ký lốp mỏng SỐTT
vết
Rf Màu các vết sau khi phun TT hiện màu MI M2 M3 1 0,37 0,35 0,36 Xanh 2 0,48 0,47 0,46 Nâu 3 0,58 0,57 0,56 Xanh đen 4 0,66 0,64 0,63 Tím Ảnh 3: Sắc kí đồ định tính Saponin M2 M3 MI
Nhận xét: Trên sắc ký đồ đều thể hiện 4 vết chính ở cả 3 loại mẫu, trong đó vết thứ 3 (màu xanh đen) to và đậm hơn cả.
b. Xác định chỉ số tạo bọt [4].
Chỉ số bọt là số ml nước để hoà tan Saponin trong lg nguyên liệu cho cột bọt cao lcm sau khi lắc và đọc.
* Tiến hành:
Cân lg bột rễ Ngưu tất (rây qua rây 32). Cho vào bình nón 500ml đã chứa sẵn lOOml nước sôi, giữ cho sôi nhẹ trong 30 phút, lọc nguội và thêm nước vừa đủ 100ml. Lấy 50ml dịch lọc cho vào bình định mức 100ml, thêm nước vừa đủ 100ml. Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm, đường kính 16mm, cho vào các ống nghiệm lần lượt 1,2,3,—,10 ml dịch chiết. Thêm nước cất cho đủ mỗi ống 10ml. Bịt miệng các ống nghiệm, lắc theo chiều dọc trong
15 giây, 2 lần/ giâỵ Để yên 15 phút, đo chiều cao của các cột bọt.
Thí nghiệm được tiến hành song song với 3 mẫu thử và lặp lại 3 lần cho kết quả ở bảng 8:
Bảng 8: Kết quả xác định chỉ số tạo bọt của rễ Ngưu tất Mẫu Ông nghiệm có cột
bọt cao lcm Số gam tương ứng Chỉ số tạo bọt MI ống 5 0,25 400 M2 ống 6 0,03 333,33 M3 ống 4 0,02 250
Nhân xét: cả 3 mẫu đều có chỉ số tạo bọt >250. Mẫu Ml có chỉ số tạo bọt cao nhất (400), mẫu M3 thấp nhất (250). Điều đó cho thấy lượng Saponin trong mẫu Ml là lớn nhất, mẫu M3 là thấp nhất trong 3 mẫụ
c. Xác định chỉ số phá huyết: [4]
Chỉ số phá huyết là số ml dung dịch đệm cần thiết để hoà tan lg dược liệu chứa Saponin gây ra hiện tượng phá huyết đầu tiên và hoàn toàn đối với một loại máu đã chọn (tiến hành trong điều kiện qui định).
* Tiến hành:
- Chuẩn bị các dung dịch cần thiết:
+ Pha dung dịch đệm: Dung dịch NaCl 0,9%. + Pha dung treo máu:
Loại fibrin trong máu bò: Lấy 300ml máu bò cho vào bình 1 lít có
miệng rộng, dùng đũa thuỷ tinh khuấy tròn đều khoảng 10 phút, lọc qua gạc
để loại fibrin, để trong tủ lạnh.
+ Pha dung treo máu 2%: Cho 40ml NaCl 0,9% vào bình định mức dung tích 100ml, thêm chính xác 2,0ml dung dịch máu bò đã loại fibrin. Lắc nhẹ. Thêm dung dịch NaCl 0,9% vừa đủ 100ml.
+ Chuẩn bị dịch chiết rễ Ngưu tất. 2,5%:
Cân chính xác 2,5g bột rễ Ngưu tất đã tán nhỏ cho vào bình nón dung tích 100ml. Cho thêm 100ml dung dịch NaCl 0,9% vừa đun sôị Lắc và đặt trên nồi cách thuỷ sôi, đun sôi trong 30 phút. Lọc nóng qua bông vào trong cốc có mỏ. Để nguộị Chuyển dung dịch vào bình định mức 100ml. Tráng bình nón bằng dung dịch 0,9% và lọc qua lớp bông đã sử dụng. Thêm dung dịch NaCl .0,9% đến vừa đủ 100ml, lắc đềụ
Lấy 20 ống nghiệm nhỏ (5m l), đánh số thứ tự từ lđến 20 và cho vào mỗi ống lần lượt các dung dịch theo bảng 9.
Trộn đều dung dịch bằng cách bịt miệng ống nghiệm bằng ngón tay cái và dốc ngược dung dịch một cách nhẹ nhàng (làm tất cả với 20 ống nghiệm). Sau 15 phút trộn đều lại một lần nữạ Để yên 24 giờ, đọc kết quả.
Bảng 9: Xác định chỉ số phá huyết STT Dung dịch NaCl 0,9% ( ml ) Dịch chiết rễ Ngưu tất 2,5% (ml) Dung dịch máu bò 2% đã loai fibrin (mi) 1 0,95 0,05 1 2 0,90 0,10 1 3 0,85 0,15 1 4 0,80 0,20 1 5 0,75 0,25 1 6 0,70 0,30 1 7 0,65 0,35 1 8 0,60 0,40 1 0,55 0,45 1 10 0,50 0,50 1 11 0,45 0,55 1 12 0,40 0,60 1 13 0,35 0,65 1 14 0,30 0,70 1 15 0,25 0,75 1 16 0,20 0,80 1 17 0,15 0,85 1 18 0,10 0,90 1 19 0,05 0,95 1 20 0,00 1,00 1
Thí nghiệm tiến hành song song với 3 mẫu thử và được lặp lại 3 lần đều cho kết quả sau:
- Mẫu M l: Tụ huyết ở cả 20 ống.
- Mẫu M2: ống số 8 phá huyết đầu tiên và hoàn toàn. - Mẫu M3: Tụ huyết ở cả 20 ống.
* Kết luân:
+ MI và M3 không có hiện tượng phá huyết mà xảy ra hiện tượng tụ huyết, nồng độ dịch chiết càng cao thì tụ huyết càng nhiềụ Mẫu MI và M3 là các mẫu có xông sinh có thể do lượng S02 trong 2 mẫu này quá cao nên đã xảy ra hiện tượng tụ huyết.
c s p h= c7 x
Trong đó:
c : là nồng độ của dịch chiết rễ Ngưu tất (2,5%).
X : là số ml dịch chiết rễ Ngưu tất đã cho vào ống nghiệm mà ở ống đó có sự phá huyết đầu tiên và hoàn toàn.
Chỉ số phá huyết của dịch chiết rễ Ngưu tất ở mẫu sấy là: c s ™ = 0 5 1 0 4 ) 100 = 200
Vậy chỉ số phá huyết ở mẫu sấy là 200.
