Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây

Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây Phân lập streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh hà tây

Bộ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

SINH VIÊN: Lê Thị Hưởng

TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ CÁC MẪU ĐẤT

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1997-2002

Thạc sỹ Phạm Thu Nga

Thời gian thực hiện: 0210312002 - 2010512002

HÀ NỘI 06-2002

Lời cảm ơn!

Trong quá trình học tập tại trường Đại Học Dược Hà Nội, tôi đã nhận được

sự dạy dỗ chỉ bảo ân cần của các thầy, cô và sự giúp đỡ của các phòng ban chức năng trong nhà trường Nhờ có sự hướng dẫn giúp đỡ tận tình của Cử nhân Nguyễn Lệ Phi, Tiến Sỹ Chu Thị Lộc, Thạc Sỹ Phạm Thu Nga, Kỹ Thuật

Viên Bùi Thị Xuyến, Kỹ Thuật Viên Nguyễn Thị Vân Sơn - Bộ môn Vi sinh -

Sinh học, tôi đã hoàn thành khoá luận tốt nghiệp trong thời gian quy định

Tôi xin bày tỏ lòng biết 0fn sâu sắc tới tất cả các thầy, cô trong nhà trường và đặc biệt là các thầy cô trong Bộ môn Vi sinh - Sinh học về sự giúp đỡ quý báu này

Hà Nội ngày 28 tháng 05 năm 2002

Sinh viên: Lê Thị Hưởng

MỤC LỤC

Trans

7

ĐẶT VẤN Đ Ề 1

PHẦN 1 TỔNG Q U A N

1.1 Đại cương về chi Streptomyces 2

1.1.1 Đặc điểm sinh th á i 2

1.1.2 Đặc tính hình th á i 2

1.1.3 Đặc điểm nuôi c ấ y 3

1.1.4 Đặc tính sinh lý sinh sinh h o á 4

1.1.5 Sự tạo kháng sinh của Streptomyces 4

ì2.Ỹ\iấĩ\\oọ.ì Streptomyces 5

1.2.1 Khoá phân loại xạ khuẩn đối kháng theo Gauze 1957 6

1.2.2 Khoá phân loại Waksman 1961 6

1.2.3 Khoá phân loại Krassilnicov 1970 7

1.2.4 Khoá phân loại ISP 1972 .7

PHẦN 2 THựC NG H ỆM VÀ KẾT Q U Ả 8

2.1 Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm 8

2.1.1 Nguyên liệ u 8

2.1.2 Phưcỉng pháp thực nghiệm 9

2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận x é t 19

2.2.1 Phân lập Ẵíre/ítomyceí và thử hoạt tính kháng s i n h 19

2.2.2 Chọn môi trường sinh tổng hợp kháng sinh thích hợp cho các chủng nghiên cứ u .19

2.2.3 Xác định tên các chủng ức chế nấm m ạnh 21

PHẦN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT : 29

TÀĨ L Ệ Ư THA.VI KHẢO

ĐẬT VẤN ĐỂ

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi ữong tự nhiên Người ta

đã nghiên cứu và ứng dụng các đặc tính đáng quí của nó trong nhiều lĩnh vực như nông nghiệp, công nghệ thực phẩm Trong ngành Y-Dược, xạ khuẩn được biết đến chủ yếu vói vai trò là nguồn sinh tổng hợp kháng sinh tự nhiên và một

số sản phẩm chuyển hoá khác như vitamin, enzym

Streptomyces, một chi thuộc bộ Actinomycetales, là những vi sinh vật có

khả năng sinh tổng hợp nhiều kháng sinh thuộc các nhóm khác nhau như streptomycin, erythromycin, cloramphenicol

Hiện nay, việc nghiên cứu tìm ra các kháng sinh mới nói chung và các kháng sinh chống nấm nói riêng đang được thế giói quan tâm Do đó, để góp phần nghiên cứu xác đinh tên và đánh giá khả năng sinh tổng hợp kháns sinh

của các loài Streptomyces có ở Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành đề t à i :

” Phân lập Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ các mẫu đất thuộc tỉnh Hà Tây”

Mục tiêu của đề tài:

1 Phân lập Streptomyces từ các mẫu đất thuộc tỉnh Hà Tây và thử khả

năng sinh tổng hợp kháng sinh của các chủng này

2 Sơ bộ tìm môi trưòíng nuôi cấy thích hợp cho sự phát triển và sinh tổng hợp kháng sùứi của các chủng nghiên cứu, trong điều kiện cho phép

3 Phân loại một số chủng có tác dụng ức chế nấm txên cơ sở các khoá phân loại phổ biến

PHẦN 1 TỔNG QƯAN

1.1 Đại cương về chi Streptomyces

1.1.1 Đặc điểm sinh thái [3, 4, 5,16,18]

Streptomvces là một chi thuộc họ Streptomỵcetaceae, bộ Actinomycemles, lớp Actinomvcetes Xạ khuẩn nói chung và Streptomyces nói riêng phàn bố rất

rộng rãi trong tự nhiên và thường có nhiều trong đất, nước, bùn ao và trong các

cơ chất hữu cơ khác, thậm chí ngay cả trên các cơ chất mà nấm mốc và vi khuẩn không thể phát triển được Điều đó cho thấy nhu cầu về chất dinh dưỡng cùa xạ khuẩn là tương đối đơn giản và chúng thích nghi với nhiều điều kiện sống khác nhau Trong đất, xạ khuẩn chiếm tỷ lệ rất lớn, có hàng triệu xạ khuẩn trong một gam đất Phần lớn các xạ khuẩn sống hoại sinh và hiếu khí, một số ít kị khí hoặc

vi hiếu khí có thể gây ra các bệnh cho người, cho động vật và cho cây trồng

1.1.2 Đặc điểm hình thái [3, 4, 5,16,18]

Đặc tính hình thái là những dấu hiệu quan trọng để xác định loài

Atinomycetes Streptomvces là nhóm vi sinh vật có nhiều đặc điểm hình thái

khác với vi khuẩn và nấm

Hệ sợi hay còn gọi là khuẩn ti chia thành hai loại là khuẩn ty khí sinh và

khuẩn ty cơ chất (khuẩn ty địa sinh), đưòíng kính của khuẩn ty thay đổi từ 0 ,2 -

1,0 |J đến 2-3 |J , đa số không có vách ngăn và không tự đứt đoạn Hệ sợi phân nhánh đa dạng và có mầu sắc phong phú: trắng, vàng, da cam, tím, đỏ nâu, xám

Cuống sinh hào tử, sau một thời gian phát triển, trên đỉnh khuẩn ty khí sinh

sẽ xuất hiện các sợi mang bào tử (cuống sinh bào tử) Hình thái cuống sinh bào

tử là dấu hiệu quan trọng để phân loại xạ khuẩn, chúng có thể có dạng thẳng (straight), xoắn (spiral), sóng (wave) có thể mọc vòng quanh một trục theo kiểu đơn hoặc kép

Bào tử được hình thành bên trong một lớp màng có cấu trúc sợi, do đó một

số trường hợp vẫn quan sát được lớp màng này do nó không bị mất đi khi bào tử hình thành

Số lượng hào tử trong một chuỗi thường trên 50 bào tử nhưng cũng có khi

chỉ có từ 5 đến 10 bào tử tạo thành một đoạn thẳng

Bào tử cũng có nhiều dạng như hình cầu, hình chữ nhật, hình que, hình oval,

hình ống Bể mặt bào tử có thể quan sát thấy một trong bốn dạng nhẵn (smooth), có gai (spiny), có bướu (warty) hoặc có lông (hair-like)

Thành tế hào của chi Streptomyces thuộc kiểu I, thành phần chính gồm

acid L, L - 2, 6 diaminopimelic, giycin, acid glutamic và alanin, không có hoặc

có rất ít đường pentose, đa số Streptomyces là các tế bào Gram dương

Khuẩn lạc của Strepromỵces rất đặc biệt, nó không trơn ướt như khuẩn lạc vi

khuẩn mà thô ráp, xù xì, có thể có dạng phấn, nhung có các nếp toả ra theo

hình phóng xạ (vì thế có tên là xạ khuẩn) Streptomyces cũng không làm vẩn đục

môi trường lỏng như vi khuẩn mà mọc thành một lớp màng trên bề mặt hoặc lắng ở đáv bình thành đám như những sợi bông

1.1.3 Đặc điểm nuòi cấy [5, 6,16,18]

Nhiều tác giả đã coi các đặc tính nuôi cấy như là dấu hiệu quan trọng để

xác định loài Streptomyces Đó là các đặc điểm như màu sắc khuẩn ty khí sinh,

cơ chất và dạng khuẩn tv khí sinh (dạng nhung, dạng phấn ), sự tạo thành các giọt nước trên bề mặt khuẩn ty khí sinh, sắc tố hoà tan trong các môi trưòíng nuôi cấy

Sắc tố hoà tan cũn2 có nhiều loại: nâu, vàng, tím, đỏ, xanh da tròd, xanh lục Người ta lại chia sác tố hòa tan làm hai loại di truyền và không di truyền, nếu là sắc tố di truyền thì không thay đổi sau 30 ngày nuôi cấy, ngược lại sắc tố không di truyền thì thay đổi theo điều kiện và thời gian nuôi cấy: pH, nhiệt độ,

thời gian nên lúc có màu lúc không màu.

1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá [5,16,18]

Nhiệt độ ứiích hợp cho sự sinh trưcmg và phát tiiển của Streptomyces là 25

- 30° c , pH trung tính, ở giá trị pH 5,0 có rất ít bào tử phát triển Bào tử

Streptomyces bị tiêu diệt ở nhiệt độ 70° c trong 10 phút Khả năng chịu muối,

sống trong điều kiện khô tuỳ thuộc vào từng loài

Nhiều tác giả cho rằng các đặc tính sinh lý, sinh hoá không phải là dấu

hiệu quan trọng để phân ioại Streptomyces Tuy nhiên khi mô tả một loài Streptomyces cần đề cập tới vấn đề này bởi vì nó đánh giá được túứi chất sinh

học của loài đó Hơn nữa, những đặc tính này tuy không ổn đinh nhưng không thể không dùng tói nó khi xác định các loài có cùng các đặc túih khác (nuôi cấy, hình thái ) giống nhau

Tuỳ theo loài Streptomyces có các đặc tính sinh hoá như :

• Dịch hoá gelatin

• Làm đông vón và pepton hoá sữa

• Thuỷ phân tinh bột

• Đồng hoá các nguồn carbon khác nhau

• Thuỷ phân cellulose

• Khử niừat

• Sự hình thành sắc tố melanin

• Sinh HjS

1.1.5 Sự tạo thành kháng sinh của Streptomyces [2,8,9,12,17]

Chi Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp nhiều chất kháng sinh thuộc

các nhóm khác nhau như: các aminoglycosid, phenicol, các tetracyclin, các macrolid, rifamycin và các kháng sinh chống nấm Nhưng do độc tính của chúng nên chỉ có rất ít txong số đó được sử dụng trong điều trị cho con người

Những chủng khác nhau của một ỉoài có thể sinh tổng hợp những kháng sinh khác nhau, chẳng hạn s griseus có thể cho các chất streptomycin, cycloheximid,

streptocin hay s /radiae có thể cho neomycin, íradicin.

Có những loài có thể cho vài chất kháng sinh tương tự nhau ví như các viomycin A, B, c của loài s vinaceus Tuy nhiên, cùng một chủng ưong ĩihững

điều kiện sinh tổng hợp khác nhau có thể cho những chất khác nhau điển hình là

các actinomycin Nói chung các Streptomyces đều kháng các kháng sinh do

chúng tạo ra

Bảng 1 Một số kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces.

1 Streptomycin Aminoglycosid s griseus

2 Kanamycin Aminoglycosid s kanamyceus

3 Tobramycin Aminoglycosid s tenebrarius

5 Cloramphenicol Phenicol s venezuelae

6 Tetracyclin Tetracyclin s viridifaciens

7 Oxytetracyclin Tetracyclin s rimosus

8 Erythromycin Macrolid s erythreus và S.sp khác

1 0 Lincomycin Lincosamid s ỉincolnensis

11 Nystatin Kháng sinh chống nấm s noursei và s griseus

12 Amphotericin Kháng sinh chống nấm s nodosus

1.2 Phân loại Streptomyces [5 ,1 1 ,1 3 ,1 4 ,1 5 ,1 6 ,1 8 ,1 9 ]

Streptomyces là vi sinh vật đã được nghiên cứu rất nhiều về phân loại cũng

như khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chúng Hàng triệu chủng đã được phân lập ở các phòng thí nghiệm ữên khắp thế giói, và số chủng được xác định tên đã lên tód trên 600 chủng

Khi nghiên cứu một chủng xạ khuẩn cho kháng sinh, bên cạnh việc phân lập chủng, giữ chủng, tìm điều kiện lên men thích hợp, chiết xuất và xác định thành phần kháng sinh, việc xác định chủng giống là một khâu quan trọng

Việc phân loại xạ khuẩn nói chung wkStreptomyces nói riêng là một vấn đề

khá phức tạp Ngàv nay, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, các phương pháp tiên tiến đã được ứng dụng trong phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên, không phải nơi nào cũng có điều kiện để sử dụng các phưoíng pháp hiện đại, do

đó một số phương pháp cổ điển vẫn được dùng

Các phương pháp phân loại cổ điển thường dựa trên đặc điểm nuôi cấy, hình thái, sinh lý sinh hoá, khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định và điều kiện sinh thái Sau đây là một số khoá phân loại phổ biến :

1.2.1 Khoá phân loại xạ khuẩn đối kháng theo Gauze 1957 [5]

Khoá phân loại này chủ yếu dựa vào màu sắc của hệ khuẩn ty khí sinh và

cơ chất khi nuôi cấy trên hai môi trưcmg có ngiổn nitrat vô cơ và hữu cơ

Theo đó, xạ khuẩn {Actinomyces) đối kháng được chia thành 15 nhóm

(seris- một vị trí trung gian giữa loài và giống)

1.2.2 Khoá phân loại W aksman 1961 [5]

Khoá này đã mô tả 252 loài Streptomyces dựa trên các tính chất:

• Kích thước, hình dạng và cấu tạo bề mặt của bào tử, hình thái cuống sinh bào tử, màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất

• Sự thay đổi màu sắc môi trường khi xạ khuẩn phát triển

• Sự hình thành sắc tố đen (melanin) trên môi tatờng có protid

• Sự hình thành sắc tố hoà tan trên môi trường tổng hợp, một số tính chất sinh hoá, đặc biệt là khả năng ihuỷ phân tinh bột, thuỷ phân protid, khử nitrat, sinh H2S, sử dụng carbon và sự hình thành các chất kháng sinli đặc hiệu

1.2.3 Khoá phàn loại xạ khuẩn của Krassilnikov 1970 [5]

Để xây dựng khoá phân loại này, tác giả đã dùng các đặc tính sau đây:

• Đặc tính hình thái: Hình dạng và kích thước của bào tử, cuống sinh bào

tử, cách hình thành bào tử và cấu tiTJC màng bào tử.

• Đặc tính nuôi cấy: Hình dạng và cấu tạo của khuẩn lạc, màu sắc khuẩn ty khí sinh và môi ti-ường, các sắc tố tiết ra môi trường

• Hoạt tính men của xạ khuẩn: Khả năng hình thành các men phân huỷ protid, cellulose, men khử nitrat và các men khác như catalase, urease

• Khả năng đồng hoá các chất dinh dưỡng: Nguồn carbon (glucose, mannitol ), nitơ từ các nguồn khác nhau (muối amon, nitrat )

• Khả năng tạo các sản phẩm trao đổi chất, chủ yếu là chất kháng sinh

Toàn bộ lớp xạ khuẩn {Actinomycetes) được Ki-assilnikov chia ra làm hai

lớp phụ, 6 họ và 26 giống, Streptomyces thuộc giống Actinomyces Giống Actinomyces lại được chia làm 16 nhóm dựa trên màu sắc hệ sợi, sắc tố hoà tan

và hình thái cuống sinh bào tử

1.2.4 Khoá phân loại - ISP 1972 [13,14,15]

Hiên nay, khoá phân loại này được dùng rất phổ biến dựa trên các đặc điểm:

• Màu sắc khuẩn ty lchí sinh, cơ chất, cuống sinh bào tử, bề mặt bào tử, số bào tử trên một chuỗi

• Sắc tố hoà tan trong môi trường hữu cơ

• Khả năng hình thành sắc tố đen (meỉanin)

• Khả năng đồng hoá các nguồn carbon khác nhau (các loại đường: glucose, galactose, mannitol, inositol )

Theo khoá phân ỉoại đơn giản của Eberhard Küster [13], đã có 274 loài

Streptomyces được xác định tên.

PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm

2.1.1 Nguyên liệu

2.1.1.1 Các mẫu đát

Các mẫu đất dùng để phân lập Streptomyces được lấy ờ một số ruộng ttồng

lúa, hoa màu và đất vườn thuộc huyện Thưòng Tín, tỉnh Hà Tây

2.1.1.2 Các chủng Streptomyces đặi diện để nghiên cứu.

Chúng tôi đã phân lập được 89 chủng Streptomyces khác nhau Sau khi thử

hoạt tính kháng khuẩn của các chủng này, chúng tôi đã chọn ra 4 chủng có tác dụng ức chế Candida albicans để nghiên cứu tiếp, nhằm xác định sơ bộ tên của các chủng này và chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho hoạt tính kháng sinh cao

2.1.1.3 Chủng vi sinh vật kiểm định.

Vi khuẩn Gram (-)Escherichia coli Proteus imrabilis Shigella flexneri Salmonella typhi Pseudomonas aeruginosa

Vi khuẩn Gram (+)

Staphylococcus aureus Bacillus cereus

Bacillus pumilus Bacillus subtilis Sarcina lutea

Vi nấm: Candida albicans

ATCC 25922 BV108 DT112 DT220 VM201

ATCC 12228 ATCC9946 NTCC 8241 ATCC6633 ATCC9341 ATCC 10231

Các vi sinh vật kiểm định là những chủng quốc tế hoặc được phân lập ở các viện nghiên cứu hoặc bệnh viện của Việt Nam.

2.I.I.3 Môi trường: 19 mội trường đã sử dụng trong quá trình nghiên cứu

là các môi trường của ISP và từ những tài liệu nghiên cứu về Actinomycetes của

thế giới Những môi trường này được nêu cụ thể trong các thí nghiệm

2.1.2 Phương pháp thực nghiệm

2.1.2.1 Phương pháp lây mẫu đất

Để phân lập các chủng Streptomyces chúng tôi đã tiến hành lấy các mẫu đất

ruộng và đất vưcm ở độ sâu 1 0 -2 0 cm, tại 10 địa điểm khác nhau với khoảng cách từ 5 km đến 10 km, sau đó trộn đều để phân lập chủng

2.1.2.2 Phương pháp phân XỈỊụStreptomyces

Mỏi trường M Tl: Gauze I

Tinh bột khoai tây 20, 0 g

Nshiền nhỏ mẫu đất chứa xạ khuẩn cần phân lập trong một cối sứ nhỏ vô

trùng, sau đó lấv 1 gam từ cối cho vào lOOml dung dịch KCuOj 0,4% mới pha

rồi lắc đều trong 2 giờ (bằng máy lắc hoặc bằng tav) ta được hỗn dịch đất có nồng độ lO'" Sau đó pha loãng để có các hỗn dịch đất ở nồng độ 10'\ 10"^, 10'^,

10-"

Q

Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1 ml hỗn dịch của các nồng độ lên txên bề mặt thạch, dùng que gạt vô trùng gạt đều khắp bề mặt đĩa, nuôi cấy ở 28-30° c ữong

5 - 7 ngày

Sau thời gian nuôi cấy các khuẩn lạc Streptomyces sạch, mọc riêng rẽ được

cấy chuyển sang ống thạch nghiêng Gauze I

2.I.2.3 Phưoìig pháp thử hoạt tính kháng sinh.

• Các môi trường thử hoạt tính kháng sinh:

Mối trường MT 1: Gauze I

Mối trường MT2: pH 7,0 - 7,2

Bột đậu tương 15, OgBột khoai tây .20, 0 gCao m e n 10, 0 g

K2HPO4.7H2O 0, 5 g

MgS04.7H2Ơ 0, 5 g

K N O 3 l , O g

N a Q 0, 5 gThạch .18, OgNước c ấ t 1000 mlMôi trường MT 3:

pH 7 ,0 -7 ,2

Nước c ấ t 1000 ml

pH 7,0 - 7,2 Mối trường MT 5:

• Môi trưòtig nuôi cấy vi nấm:

Mỏi trường MT7 : Sabouraud

Các chủng Streptomyces được cấy ria trên các đĩa petri với những môi trường

khác nhau Sau 5 - 7 ngàv nuôi cấy ở 28 - 3QP c, lấy ra thử tác dụng khángkhuẩn bằng phương pháp khối thạch (Ezopob 1969) Vi sinh vật kiểm định được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp, sau đó được làm thành nhũ dịch

có khoảng 10'-10^ tế bào trong Iml với NaCl 0,9%

Chúng tôi đã tiến hành thử hoạt tính kháng sinh của 89 chủng phân lập được trên môi trưòmg M Tl, sau đó bốn chủng được chọn nghiên cứu sẽ được thử tiếp trên các môi trường MTl, MT2, MT3, MT4 và MT5 để so sánh chọn môi trưÒTig thích hợp cho mỗi chủng sinh tổng hợp kháng sinh

2.I.2.4 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cày và đặc điểm hình tháiCác chủng được nuôi cấy trong 7 ngày, sau đó xác định màu sắc khuẩn ty, sắc tố hoà tan của các chúng Hình dạng cuống sinh bào tử được quan sát trên kính hiển vi quans học bằng phương pháp microfilm

Bề mặt, kích thước, hình dạng bào tử được quan sát trên kính hiển vi điện tử JEOL 1010- TEM, Viện vệ sinh dịch tễ trung ương

Các ĩĩiôi trường nuôi cấy;

Mối trường MTl: Gauze I

Mỏi trường MT 8: glucose - asparagin

L- asparagin 0,5 g

G lu co se 10,0 g

K2HPO4.7H2O 0,5 g

Thạch 18,0 gNước cất 1000 ml

pH 6 ,8 - 7,0

Mối trưòng MTIO:

Khoai tây gọt v ỏ 200, 0 g

G lu co se 20,0 gCaCOa 0, 2 gMgS04.7H2Ơ : 0, 2 gThạch .5 ,0 gNước c ấ t 1000 ml

p H 7 ,0 - 7,2

Mỏi trưởng MTl 1: Môi trưcmg men tinh bột

2.I.2.5 Phương pháp nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hoá

Thử khả năng dich hoá gelatin

Môi trường MT12:

G e la tin 100, 0 g

Pepton 5, 0 gGlucose 20,0 g

T hạch 18, 0 gNước c ấ t 1000 ml

pH 7,4-7,6

Nuôi cấy các chủng Streptomyces trên môi trường MT12 ở 25 - 28°c, sau 7

ngày khả năng dịch hoá gelatin bằng cách nhỏ dung dịch acid acetic đặc lên khuẩn lạc và lên khắp bề mặt thạch, nếu xuất hiện vòng ữong xung quanh khuẩn

lạc thì kết luận chủng Streptomyces này có khả năng dịch hoá gelatin.

Thử khả năng thuv phán tinh bỏt

Mối trường MT13: (ũH 7,0-7,2)

P e p to n 5, 0 gCao th ịt 5, 0 g

N a Q 5, 0 gTinh b ộ t 10, 0 g

T hạch 18, 0 gNước c ấ t 1000 ml

Sau 7 ngày nuôi cấy các chủng trên mồi trường MT13, dùng dung dịch lugol nhỏ lên khuẩn lạc và trên khắp bề mặt môi trường, nếu tinh bột bị thuỷ phân sẽ tạo vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc, phần môi trường vẫn còn tinh bột thì có màu tím.

Khả năng làm đông vón và pẹpton hoá sữa

Mối trưòng MT 14:

Sữa tưoi loại b ơ 1000 mlCaCOs 0, 02 g

p H 7 ,0 - 7 ,2

Nuôi cấy Streptomyces ở nhiệt độ 28°c trên môi trường MT14, sau bảy

ngày quan sát sự đông vón và pepton hoá của sữa bằng cách quan sát sự biến đổi màu trên môi trường trên ( từ màu sữa sang màu vàng )

Khả năng thuv phân casein

Môi trường MT15: Casein hydrolysis

Sữa g ầ y 100, 0 g

T h ạ c h 18, OgNước c ấ t 1000 ml

pH 7,0 - 7,2 Tiệt trùng ở 110°c trong 20 phút

Nuôi cấy Streptomyces trên môi trường 15 sau 1-2 tuần đánh giá khả năng

thuỷ phân casein qua độ trong của phần môi txưòfng xung quanh khuẩn lạc

Thử khả năng đóng hoá các nguồn carbon khác nhau

Mối trường MT16 (ISP 9)

I Dung dịch vết muối (Pridham and Gottlieb)