So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ

So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ So sánh một số phương pháp định lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phổ

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỢC SỸ KHOÁ 2002 - 2007)

Người hướng dẫn: TS Thái Nguyễn Hùng Thu

ThS Tạ Mạnh Hùng

Nơi thực hiện:

Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung ương

Thời gian thực hiện: 01.2007 - 05.2007

Á ^ i ũ ° y

HÀ NỘI - 05.2007

M f o ũ d L /tL Ơ Q l

~Kh()á luân nài/ đùcU' time hì tu dưới iut hiuúKỊ dẫn của thíìụ ^7hái QLạuụẪti T ỈC ì Ù ihị , 'lièu SÍỊ - rpitĩ hiêu titiĩiKỊ tiiíịiK/ <Dại họe rf)ỉt(ie 'X>à Qtệl Q’ ài rin oh ân thành ('ám on ÍỈIÍỈI/ £7kni QỉquụếtL 'Jớnụ đã

tận tình tfiup đ&, ItiioniỊ dẫn tồi tvOiKỊ hoe tập D Ù làm, đề tài.

Ỡ(M rill if ui lài ếm ĩt! tĩi ('ác cá a bê ếa Ỡra/tạ tăm đánh ạìá

tiùítKỊ ĩtmíiKỊ linh ỈHH‘ - r()ìi'H kiêm ittỊỈtièm tlmịe tìtUtiỊ lùi

M/ £7« JHạtih 'dùìtntỊ itã nhìêt tình tuiĩtHỊ dãn, (ỊỈúp itõ ồ tọa moi điều Uiên ('/10 tơi iàttt thưa ngÂìêm ttí hồn thành Uhố /i/ítí/ nàụ.

cjồi XÙI ti'ân tron (Ị (‘úm đu các thầy, (iỗ fi'Oittf (Ban (ịiám hiỀU; (Bà mồ*i 'Tơơú phàn tíeh I-ÌHKỊ cát' tỉuuỊ ầ (ỊỈáo eảa titiịiit/ rf)ạì liọe

7fí)à Qịội ĩtã tận tình tlift Ị Ịiútí tơi tvotHỊ những, mini litìe tập tại íruịtKỊ.

@uếì cùII(Ị »r/« (‘(ínt đti <fìa (Tìnlt D Ị Ịxnt hè (tã itơníỊ DÌên, (ỊÌúp ĩtõ’

tịi Ỉ!'tìntf suốt quá trình ho í' tập.

OãtKỊ "7h i QLạ&tt j£an

1.2.1 Nguyên tắc của phổ đạo hàm

1.2.2 Đặc điểm của đường cong quang phổ đạo hàm

1.2.3 ứng dụng của phổ đạo hàm trong kiểm nghiệm thuốc

1.3 QUANG PHỔ ĐẠO HÀM TỶ ĐÔÌ

1.4 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CỦA Đ ối

TƯỢNG NGHIÊN c ứ u1.4.1 Cafein

2.2.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng bằng quang phổ đạo hàm tỷ đối2.2.3 Phương pháp định lượng bằng quang phổ đạo hàm

2.2.4 Phương pháp định lượng bằng đo quang ở nhiều bước sóng

2.2.5 ứng dụng các phương pháp để định lượng thuốc tiêm cafein 7%2.3 BÀN LUẬN

2.3.1 Về phương pháp phổ đạo hàm tỷ đối

ĐẶT VÂN ĐỂ

Cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ, người ta đã tìm ra nhiều phương pháp mới để kiểm nghiệm thuốc Tuy nhiên với những đặc điểm và ưu thế của mình, phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến vẫn được sử dụng rộng rãi

để định lượng các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng và các chất có màu

Thông thường, đối với phương pháp quang phổ UV-VIS, khi phân tích hỗn họp nhiều thành phần có phổ hấp thụ xen phủ nhau, người ta thường phải tách riêng từng thành phần, sau đó mới có thể định lượng Vì vậy tốn thời gian, hoá chất và đôi khi còn không thể thực hiện được Khắc phục hạn chế này, người ta đã nghiên cứu và tìm ra một số phương pháp định lượng trực tiếp các hỗn hợp nhiều

thành phần mà không phải qua giai đoạn chiết tách như: đo ở nhiều bước sóng,

dùng quang phổ đạo hàm

Khái niệm quang phổ đạo hàm được đưa ra lần đầu vào thập kỷ 50 của thế

kỷ trước Đến cuối thập kỷ 70 của thế kỷ XX, khoa học công nghệ phát triển nhanh chóng, đặc biệt là máy vi tính ngày càng hiện đại đã cho phép sử dụng các phương pháp toán học để tạo ra phổ đạo hàm nhanh hơn, dễ hơn và có độ lặp cao hơn Từ đó, quang phổ đạo hàm được ứng dụng rộng rãi để phân tích dược phẩm Chúng đặc biệt có ích đối với hỗn hợp nhiều thành phần hoặc dược phẩm có chất phụ gia trong dạng bào chế, các tạp chất, các sản phẩm phân huỷ gây cản trở lớn đến hoạt chất chính cần định lượng Phương pháp phổ đạo hàm tỷ đối là sự kết hợp các phổ thành phần trước khi lấy đạo hàm cho giá trị cao hơn nên giảm được sai số so với phương pháp phổ đạo hàm

Một số cơ sở ở nước ta như: Viện kiểm nghiệm, Phân viện kiểm nghiệm và

Trung tâm kiểm nghiệm nghiên cứu dược quân đội đã có các công trình nghiên cứu ứng dụng phương pháp quang phổ đạo hàm Tuy nhiên, trong thực tế việc ứng dụng các phương pháp này chưa nhiều, nhất là đối với phương pháp phổ đạo hàm

tỷ đối

Với mong muốn đề xuất thêm các phương pháp mới tiện lợi hơn trong việc kiểm tra chất lượng của thuốc và có thể khai thác các tính năng sẩn có của thiết bị

-

2-1 - Xây dựng phương pháp định lượng trực tiếp chế phẩm hỗn hợp hai

thành phần bằng quang phổ đạo hàm tỷ đối.

2 - So sánh kết quả thu được của phương pháp với các phương pháp thông

dụng là quang phổ đạo hàm và đo quang ở nhiều bước sóng.

được triệt để hơn, chúng tôi tiến hành đề tài: “Sỡ sánh một sô phương pháp định

lượng trực tiếp dung dịch hai thành phần bằng quang phô’’ với hai mục tiêu:

PHẦN 1

TỔNG QUAN

1.1 QUANG PHỔ TỬNGOẠI - KHẢ KIÊN (UV-VIS):

1.1.1 Phổ hấp thụ ƯV-VIS: [3, 4]

Khi tia bức xạ tương tác với vật chất, có thể xảy ra một số quá trình: phản

xạ, tán xạ, hấp thụ, huỳnh quang và quang hóa Khi đo quang phổ tử ngoại khả kiến, người ta mong muốn chỉ có quá trình hấp thụ xảy ra Vì bức xạ điện từ là các hạt mang năng lượng nên khi được phân tử hấp thụ, nó sẽ kích thích hệ electron của phân tử và làm tăng nội năng của nó Năng lượng tổng của một phân

tử bao gồm: năng lượng chuyển động tịnh tiến của phân tử (Et), năng lượng của điện tử (Ee), năng lượng của các dao động (Ev) và năng lượng chuyển động quay (Ef):

Etổng = Et + Ee + Ev + Er (Ee » Ev » Er)

Sự hấp thụ bức xạ tử ngoại - khả kiến có thể làm thay đổi mức năng lượng điện tử Ee và là nguồn gốc của phổ UV-VIS Do đó, phổ UV-VIS được gọi là phổ điện tử

Phổ hấp thụ UV-VIS của một chất biểu diễn sự phụ thuộc khả năng hấp thụ của chất đó theo bước sóng

1.1.2 Định luật Lambert-Beer: [3, 4, 9, 15, 18, 20]

Chiếu một chùm tia đơn sắc có cường độ I0 qua một dung dịch có chiều dày / (cm) Sau khi bị dung dịch hấp thụ, cường độ chùm tia còn lại là I Theo '

định luật Lambert - Beer thì độ hấp thụ của dung dịch tỷ lệ với nồng độ của chất ị •

hấp thụ và chiều dày của môi trường hấp thụ:

-1: là chiều dày của lớp dung dịch (cm).

C: nồng độ chất tan trong dung dịch

* Nếu nồng độ c tính bằng mol/1, 1 tính bằng cm: A = S.L.C, khi c = IM và

1=1 cm thì A = K = s s là hệ sô hấp thụ phân tử hay độ hấp thụ mol, đặc trưng

cho bản chất của chất tan trong dung dịch, chỉ phụ thuộc bước sóng ánh sáng đơn sắc và hay được dùng trong mô tả cấu trúc, tính chất quang phổ của các chất hữu cơ

* Nếu nồng độ c tính theo %(kl/tt) và khi c = 1%, 1 = lcm thì K được gọi là hệ

sô hấp thụ riêng hay độ hấp thụ riêng; ký hiệu là A (1%, lent) hoặc Ej°^ Hệ sô

này hay được dùng trong phân tích kiểm nghiệm và được ghi trong Dược điển

* Các điều kiện áp dụng định luật:

- Chùm tia sáng phải đơn sắc: vì khi bước sóng thay đổi các hệ số hấp thụ cũng đều thay đổi Chùm tia sáng càng đơn sắc thì định luật càng đúng

- Dung dịch phải nằm trong khoảng nồng độ thích hợp: để hạn chế các sai lệch về hóa học do sự phân ly (ion hóa) hay tạo các sản phẩm trùng hợp (dimer, trimer ) Sai lệch hóa học còn có thể do phản ứng với các chất lạ hay tạo phức với các ion trong dung dịch Để hạn chế sai lệch này người ta thường dùng mẫu trắng có thành phần như dung dịch, chỉ thiếu chất cần khảo sát Vì định luật Lambert-Beer chỉ đúng trong một giới hạn nhất định của nồng độ nên trước khi xây dựng phương pháp định lượng cần khảo sát để tìm khoảng nồng độ thích hợp

- Dung dịch phải trong suốt để hạn chế hiện tượng phản xạ, khuếch tán ánh sáng,

- Chất thử phải bền trong dung dịch và bền dưới tác dụng của tia UV-VIS

1.1.3 ứng dụng quang phổ UV-VIS trong kiểm nghiệm thuốc: [3, 4, 6, 9]

1.1.3.1 Phân tích định tính và thử tinh khiết:

Thông thường các cực đại hấp thụ là đặc trưng định tính của một chất nên

có thể dựa vào các giá trị Xmax để định tính các chất Ngoài các cực đại, người ta

có thể căn cứ thêm vào tỷ lê mât độ quang tại các cực trị để phân biệt các chất Người ta cũng có thể phối hợp sử dụng giá trị mật độ quang tại các cực đại hấp thụ kết họp với dạng phổ để biết mức độ tinh khiết của chất đó

Vì dạng phổ ƯV-VIS có ít các yếu tố đặc trưng cho các chất nên để tăng khả năng phân biệt người ta còn dùng hệ số match với công thức tính:

5

-n n

trong đó X và y là độ hấp thụ của phổ thứ nhất và phổ thứ hai ở cùng một bước sóng và được xác định tại n bước sóng khác nhau

I.I.3.2 Phân tích định lượng:

Khi xây dựng quy trình định lượng, cần khảo sát chọn các điều kiện: bước sóng, khoảng nồng độ, pH, dung môi thích hợp để phép phân tích đảm bảo độ chính xác, tiến hành thuận tiện và kinh tế

* Các phương pháp định lượng dung dịch một thành phần:

* Tính toán trực tiếp từ mật độ quang đo được:

Với các chất có hệ số hấp thụ riêng biết trước chính xác và ổn định ở một bước sóng nào đó, người ta có thể đo mật độ quang của dung dịch chất đó trong dung môi tương ứng tại bước sóng này Nồng độ của dung dịch được tính theo công thức:

1 Cììĩ

Muốn áp dụng kỹ thuật này máy quang phổ phải được chuẩn hóa về bước sóng và giá trị mật độ quang Dung dịch đo phải trong suốt và có nồng độ nằm trong vùng đáp ứng của định luật Lambert-Beer

* Đo so sánh với dung dịch chuẩn:

Xác định mật độ quang của dung dịch thử có nồng độ Cx (chưa biết) được tiến hành cùng với việc xác định mật độ quang của dung dịch chuẩn có nồng độ

Cc đã biết chính xác trong điều kiện thỏa mãn định luật Lambert-Beer thì có thể tính toán nồng độ dung dịch thử theo công thức:

6

-trường hợp các dung dịch đo thỏa mãn các điều kiện của định luật Lambert-Beer thì đường chuẩn thẳng Khi đó, chỉ cần đưa giá trị mật độ quang Ax của dung dịch thử lên đường chuẩn và tìm ra giá trị Cx tương ứng Để hạn chế phải ngoại suy, nồng độ các dung dịch thử phải nằm trong khoảng nồng độ của dãy chuẩn Thông

thường việc khảo sát vùng tuyến tính phải được tiến hành trước Trên cơ sở đó,

tiến hành pha loãng các dung dịch thử một cách thích hợp để sao cho các dung dịch thử có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính đã xác định được

* Thêm chuẩn:

Để hạn chế ảnh hưởng của tạp chất người ta đưa thêm vào dung dịch thử một lượng chính xác chất chuẩn làm cho nồng độ dung dịch này tăng thêm một lượng C0 Đo mật độ quang Ax của dung dịch thử có nồng độ Cx và mật độ quang

A ’x của dung dịch đã có thêm chất chuẩn (nồng độ Cx+Co) Nồng độ của dung dịch thử được tính toán như sau:

Phương pháp thêm đường chuẩn được tiến hành bằng cách thêm các lượng chính xác chất chuẩn khác nhau vào dung dịch cần định lượng Vẽ đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ chất chuẩn đã thêm Giao điểm của đường chuẩn với trục nồng độ chỉ giá trị của nồng độ dung dịch cần định lượng

* Phương pháp chuẩn độ đo quang:

Xác định điểm tương đương bởi sự thay đổi khả năng hấp thụ ánh sáng của dung dịch Phương pháp này có ưu điểm là áp dụng được cho dung dịch có màu hoặc đục không quá đậm, không tìm được chỉ thị màu, không định lượng được bằng phương pháp chuẩn độ đo thế

*1* Định lượng dung dịch hỗn hợp các chất:

Độ hấp thụ ánh sáng có tính chất cộng tính nên dung dịch chứa nhiều chất tan khác nhau thì độ hấp thụ tổng cộng sẽ là tổng độ hấp thụ của các chất:

Atổng = Aị + A2 + A3 + + An Thông thường với hỗn hợp nhiều chất người ta phải chiết đo quang, tức là tách riêng chất cần khảo sát ra khỏi hỗn hợp và tiến hành định lượng như với dung dịch của riêng một chất Tuy nhiên có thể định lượng trực tiếp mà không cần chiết tách bằng phương pháp đo quang hỗn hợp tại nhiều bước sóng

7

-AẦ1 = + E2X,1.C2 + .+ EnÀ1.Cn

v ề nguyên tắc phương pháp này có thể áp dụng cho hỗn hợp n thành phầnbằng cách đo mật độ quang ở n bước sóng và giải hệ phương trình:

A^n = E]^n_Ci + E xn Q + _ + Enx".Cn

cụ và sai số của mật độ quang đo được làm cho sai số của phép định lượng tăng lên gấp bội khi giải hệ phương trình

1.2 QUANG PHỔ ĐẠO HÀM: [3, 4, 6, 10, 16, 17]

1.2.1 Nguyên tắc của phổ đạo hàm: [3,4, 6]

Trong PĐH, độ hấp thụ (A) của mẫu được lấy vi phân theo bước sóng (Ả)

để tạo ra đạo hàm bậc 1, bậc 2 hoặc bậc cao hơn

Vì ỉ là độ dày của lớp dung dịch luôn không đổi và tại một bước sóng nhất định

thì đạo hàm của E|% là hằng số nên giá trị PĐH của dung dịch chỉ còn phụ thuộc tuyến tính đối với nồng, độ c của d'jng dịch

Atóng = A] + A2 + A3 + + An

Ngoài ra, vì PĐH là kết quả của sự chuyển đổi từ phổ hấp thụ nên giá trị PĐH tạicác bước sóng cũng có sư cộng tính như phổ hấp thụ khi đo phổ hỗn hợp củanhiều chất:

í>.0í.-07-ị ị I

Hình 1.1 - Phổ hấp thụ và các phổ đạo hàm từ bậc 1 đến bậc 4

PĐH bậc 1 là tốc độ biến thiên của độ hấp thụ đối với bước sóng, nó đi qua

điểm 0 tại Xmax của phổ hấp thụ Và ở 2 bên điểm 0 này có 1 cực đại và 1 cực tiểu

tại các bước sóng là điểm uốn của phổ hấp thụ Do vậy hàm lưỡng cực là đặc tính của tất cả các PĐH bậc lẻ

Đặc trưng nhất của PĐH bậc 2 là có một cực tiểu chính tại Ằmax của phổ

hấp thụ và có 2 cực đại phụ ở 2 bên cực tiểu chính Trong khi đó, PĐH bậc 4 có 1 cực đại chính tại Ằmax của phổ hấp thụ Như vậy, việc tạo ra 1 cực tiểu chính (bậc

2) hoặc cực đại chính (bậc 4) ở cùng Ấmax của phổ hấp thụ là đặc tính của PĐH

bậc chẵn

Từ các PĐH trên (từ bâc 1 đến bâc 4) ta thấy từ 1 cưc trị của phổ hấp thụ ta

sẽ có số cực trị bằng số bậc của PĐH cộng 1

9

-1.2.3 ứng dụng của phổ đạo hàm trong kiểm nghiệm thuốc: [3, 4, 6, 10, 17]

1.2.3.1 Phân tích định tính:

Các phổ hấp thụ của các chất có thể tương tự nhau nhưng sẽ khác hơn khi

ở dạng PĐH do số các cực trị tăng khi tăng số bậc của PĐH Sự phức tạp của

PĐH sẽ rất có ích trong phân tích định tính vì nó giúp cho việc nhận biết hoặc mô

tả đặc tính của nguyên liệu

Mặt khác số bậc đạo hàm càng tăng thì độ rộng của các dải PĐH bậc chẵn càng giảm Nếu so với dải phổ hấp thụ có dạng hình chuông thì độ rộng đó lần lượt giảm còn 53%, 41% và 34% so với độ rộng gốc ở đạo hàm bậc 2, bậc 4 và bậc 6 Chính đặc điểm này của PĐH bậc chẵn hay được dùng trong phân tích định

tính để xác định 2 chất có các giá trị ở Ầmax trên phổ hấp thụ không đủ phân biệt.

1.2.3.2 Phán tích định lượng:

* Định lượng đơn thành phần

Khi đo quang phổ, nhiều khi đường nền bị trôi do máy (đèn hoặc detector không ổn định) hoặc do mẫu (vị trí đặt cuvet) Vì đạo hàm bậc nhất của đường nền hấp thụ bằng 0 nên người ta thường sử dụng đạo hàm bậc nhất để loại trừ sự

ảnh hưởng này và tăng độ chính xác cho định lượng.

Một ứng dụng quan trọng của PĐH là sự hạn chế các dải phổ rộng đối với các dải phổ hẹp, và sự hạn chế này tăng khi số bậc của PĐH tăng Giá trị PĐH Dn của một dải phổ hình chuông ở bậc n tỷ lệ nghịch với độ rộng của dải phổ ở bậc n (W")

D " -—

w n

Ngoài ra khi định lượng còn có sự tán xạ do các hạt lơ lửng (thường là các

tá dược trong viên nén hoặc viên nang) Điều này tạo ra sự hấp thụ đường nền biểu kiến và gây sai số vì ánh sáng thay vì đi qua dung dịch để đến detector thì nay đã bị tán xạ thành một góc Bởi vậy, ngay khi cả khi không có sự hấp thụ, vẫn

có rất ít ánh sáng đến được detector Người ta có thể khắc phục bằng cách lọc mẫu trước khi đo nhưng đôi khi không thể thực hiện được

-10-sóng ánh sáng và nó tỷ lệ nghịch với bình phương của bước -10-sóng.

Sai số do sự tán xạ tăng ở bước sóng thấp Vì mối quan hệ này là tỷ lệ

nghịch nên việc sử dụng PĐH không loại trừ được hoàn toàn sự tán xạ nhưng các phổ này rất giống với dải phổ rộng nên người ta dùng PĐH để giảm sự ảnh hưởng của nó trong định lượng

Một dải phổ hấp thụ có độ rộng là 40nm và có một dải phổ giống như vậy

nhưng có hiện tượng tán xạ Nếu không hiệu chỉnh thì ở 500nm độ hấp thụ đo

được là 1,0920 thay vì 1,0 Nếu định lượng ở bước sóng này thì sai số là + 9,2%

Nếu dùng PĐH bậc 1 và sử dụng tổng giá trị PĐH ở cực đại và cực tiểu thì

sẽ đo được 0,02992 thay vì 0,03024 Lúc này sai số chỉ là - 1,1% Như vậy, khả năng hạn chế các thành phần gây tán xạ đã được dùng rộng rãi trong phân tích dược phẩm khi các tá dược trong viên nén, viên nang và viên bao gây sai số trong định lượng

Đặc biệt các chế phẩm có chất phân hủy, chất bảo quản hoặc tá dược ảnh hưởng lớn đến việc định lượng hoạt chất chính nếu dùng quang phổ UV-VIS thông thường, cũng có thể dùng PĐH để loại trừ sự ảnh hưởng này Ví dụ, viên bao đường Mg-B6 của Sanofi Pharma Việt Nam chỉ có một thành phần vitamin B6

có hấp thụ quang nhưng trong quá trình chuẩn bị mẫu để đo quang, dung dịch vẫn

bị đục sau khi lọc qua giấy lọc Đó là do chế phẩm có tá dược không thể lọc được

hết bằng cách lọc thông thường Nếu đo ở phổ hấp thụ, dung dịch sẽ gây ra sai số

là + 11,8%, còn đo ồ đạo hàm bậc 1 chỉ gây ra sai số là + 1,3%, ở đạo hàm bậc 2

l à -0,97% ^ '* 7

* Định lượng 2 hay nhiều thành phần

Phổ đạo hàm có một tính chất đặc biệt là tại các điểm cực trị của đường cong hấp thụ thì đạo hàm bậc 1 của nó bằng 0 và tại điểm uốn thì đạo hàm bậc 2 bằng 0 Đó là cơ sở lý thuyết để có thể dùng PĐH định lượng đồng thời các chất trong hỗn hợp 2 thành phần một cách dễ dàng

Trên PĐH bậc 1 của chất thứ nhất, số bước sóng ứng với giá trị 0 nhiều hơn số bước sóng hấp thụ cực đại Tại những điểm có giá trị 0 này có thể tìm được giá trị khác 0 trên PĐH bậc 1 của chất thứ 2 Vậy tại bước sóng đó có thể xác định được chất thứ 2 một cách độc lập, không bị chất thứ nhất ảnh hưởng

Dùng PĐH bậc 2 cũng tương tự: 2 chất có cực đại hấp thụ gần nhau nhưng các điểm uốn có thể xa nhau Tại bước sóng ứng với điểm uốn trên phổ hấp thụ

11

-1.3 QUANG PHỔ ĐẠO HÀM TỶ ĐÔÌ: [6, 16]

Giả sử có phổ hấp thụ UV-VIS của một dung dịch chất X ở nồng độ Cx và

một dung dịch chất Y ở nồng độ C0 Tại mỗi bước sóng ta có một giá trị của tỷ số giữa độ hấp thụ của X với độ hấp thụ của Y ở nồng độ CG Đường biểu diễn mối liên hệ giữa các giá trị này với bước sóng ánh sáng là phổ tỷ đối của X so với Y ở nồng độ C0 và đạo hàm của PTĐ này được gọi là PĐHTĐ của dung dịch X so vói dung dịch Y ở nồng độ Cq

Như vậy, PTĐ của chất Y ở nồng độ Cy so với Y ở nồng độ c 0 theo lý thuyết là một đường thẳng song song với trục bước sóng và do vậy đạo hàm của

Nếu dung dịch khảo sát chứa hai chất X có nồng độ Cx và Y có nồng độ Cy

thì đạo hàm PTĐ của nó so với phổ của Y ở nồng độ C0 được tính như sau:

Nếu dung dịch khảo sát chứa 3 chất A, B và c thì đạo hàm PTĐ của nó so với phổ của c ở nồng độ Co là:

Giá trị PĐHTĐ trong trường hợp này phụ thuộc vào nồng độ của B, nồng

độ của A và nồng độ của c° đã biết Nếu tại bước sóng Xx nào đó giá trị PĐHTĐ

của B đối với c ở nồng độ c 0 bằng 0, tức là:

-

vào giá trị PĐHTĐ đo được tại Xx.

Thực tế, phương pháp PĐHTĐ đã được sử dụng để định lượng thuốc nhỏ

mắt collydexa chứa 3 thành phần cloramphenicol (C), dexamethason natri

phosphat (D) và naphazolin (N) Khảo sát PĐH bậc 1 của phổ tỷ đối D/C°, N/C°

và N/D°, chọn các bước sóng để định lượng từng thành phần của hỗn hợp 3 chất:

1.4 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CỦA Đ ố i

Tên khoa học: 1,3,7-trỉmethyl xanthin monohydrat

Cafein là một alcaloid có nhân purin được tìm thấy trong nhiều loại thực vật như chè, cà phê, ca cao Cafein được Runge chiết xuất vào năm 1920, Pelletier và Caventou chiết vào năm 1921 Do nhu cầu sử dụng lớn nên hiện nay cafein được điều chế chủ yếu bằng phương pháp tổng hợp hóa học

Cafein ở dưới dạng tinh thể trắng, mịn hay bột kết tinh trắng, không mùi,

vị hơi đắng, nóng chảy ở 234°c - 239°c, vụn nát ngoài không khí khô Khi đun nóng ở 100°c cafein sẽ mất nước và thăng hoa ở khoảng 200°c Cafein hơi tan trong nước, dễ tan trong nước sôi, chloroform; khó tan trong ethanol và ether, tan trong các dung dịch acid và dung dịch đậm đặc của benzoat hay salicylat kiềm Dung dịch cafein trong nước có phản ứng trung tính với giấy quỳ

TƯƠNG NGHIÊN CÚU:

1.4.1 Cafein: [1,2]

o c h3

c h3Công thức phân tử: C8H 10O2N4.H2O

Khối lượng mol: 212,21

-

13-Cafein trong phân tử không có hydro linh động nên không có tính acid mà chỉ là một base yếu Nó tạo muối với các acid mạnh và các muối này không bền,

dễ bị phân ly Trong môi trường kiềm, cafein không bền, dễ bị phân hủy thành chất cafeidin không có tác dụng và độc

Cafein có tác dụng kích thích hoạt động của hệ thần kinh trung ương chọn lọc trên vỏ não, làm tăng khả năng nhận thức, tăng khả năng làm việc trí óc, làm giảm cảm giác mệt mỏi, buồn ngủ Trên tim, thuốc có tác dụng kích thích, liều cao làm tim đập nhanh, co bóp mạnh, tăng lưu lượng máu qua tim Trên thận, có tác dụng lợi tiểu nhưng kém theophyllin và theobromin

Cafein ít tan trong nước nhưng độ tan của nó tăng lên nhiều khi kết hợp với muối benzoat hoặc salicylat kiềm Vì vậy, trong ngành dược thường dùng dung dịch cafein natri benzoat (chứa 7% cafein) làm thuốc tiêm

1.4.2 Natri benzoat: [2]

Công thức phân tử: C7H5N a02

Khối lượng mol: 144,1

Tên khoa học: natri bemencarboxylat

Tính chất: bột kết tinh hay hạt hoặc mảnh màu trắng, hơi hút ẩm, dễ tan trong nước, hơi tan trong ethanol 96%

Thuốc có tác dụng long đờm, sát khuẩn đường hô hấp, đường tiết niệu Dùng phối hợp với thuốc ho khác để điều trị ho do viêm phế quản (cần dùng kháng sinh), bệnh gút, viêm thận (do thuốc thải trừ qua đường thận) Thuốc còn dùng ngoài để sát trùng, chữa nấm

1.4.3 Các phương pháp đã được dùng để định lượng CA và NB:

14-ư u điểm: đơn giản, dễ thực hiện.

Nhược điểm: lâu, phải tách cafein ra khỏi thuốc tiêm trước khi định lượng

1.4.3.2 Phương pháp chuẩn độ trong môi trường khan: [14, 18, 24, 25]

Phương pháp này dùng để định lượng NB và CA khi ở dạng nguyên liệu

(phát hiện điểm tương đương bằng chỉ thị hoặc bằng điện cực) Nguyên tắc: CA

và NB đều là các base hữu cơ, được chuẩn độ bằng acid percloric trong môi trường acid acetic khan nước

Ưu điểm: nhanh, thuận tiện, chính xác

1.4.3.3 Phương pháp khôi lượng: [5, 14, 24]

Phương pháp này dùng để định lượng CA Đầu tiên CA được kiềm hóa bằng NaOH 0,1N (chỉ thị phenolphtalein), sau đó chiết bằng cloroform rồi bốc hơi đến khô và cân cắn

1.4.3.4 Phương pháp đo iod: [5, 14, 18, 24]

Phương pháp này dùng để định lượng dung dịch thuốc tiêm CA Trong môi trường acid sulfuric, CA cho tủa periodid với dung dịch iod 0,1N (dư) Lọc tủa rồi định lượng iod dư bằng dung dịch thiosulfat 0,1N

1.43.5 Phương pháp quang phố, quang ph ổ đạo hàm:

Nguyên tắc: do trong phân tử của CA và NB có dây nối đôi liên hợp nên có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại

Để định lượng CA trong viên nén phối hợp với Aspirin, với phenolbarbital hoặc với paracetamol (trong viên nén Sedapa), người ta chiết CA bằng cloroform rồi đo quang [11, 12, 16]

Đo ở nhiều bước sóng được áp dụng để định lượng CA và NB trong thuốc '

tiêm, CA trong viên nén Naoquing chứa CA và Aminopyrin [24] J

Phương pháp PĐH: định lượng CA trong viên bao đường chứa CA; meclozin dihydroclorid [17] và trong thuốc tiêm chứa CA; NB [6]

1.4.3.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao: [6, 7, 11, 12]

* Định lượng CA ở dạng nguyên liệu

Tốc độ dòng: 1 mL/phút.

* Định lượng CA khi ở dạng viên nén:

Chế phẩm phối hợp CA với paracetamol hoặc phối hợp với paracetamol và Aspirin Điều kiện sắc ký:

- Pha động: nước : m ethanol: acid acetic [69 : 28 : 3]

- Cột RP 18 (5 hoặc 10 Jim)

- Nhiệt độ cột: 45°c ± 1

- Detector: 275 nm

- Tốc độ dòng: 2 mL/phút

* Định lượng CA ở dạng viên nang:

Chế phẩm phối hợp CA vci Butabital, Aspirin và codein phosphat Điều kiện sắc ký:

- Pha động: đệm phosphat 0,0IM : methanol [55 : 45], điều chỉnh đến

Ưu điểm: nhanh nhạy, chính xác, có thể dịnh lượng đồng thời các thành phần

Tuy nhiên, nhiều cơ sở chưa thể áp dụng được vì cần chất chuẩn và máy móc hiện đại

16-PHẦN 2

THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM:

2.1.1 Nguyên vật liệu:

2.1.1.1 Đối tượng nghiên cứu:

Đối tượng chúng tôi chọn để nghiên cứu là thuốc tiêm cafein 7% Chế

phẩm này có chứa 2 thành phần là cafein (CA) và natrí benzoat (NB) đều có khả

năng hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại Thông thường muốn định lượng chế phẩm này bằng quang phổ, người ta phải chiết riêng từng chất, sau đó mới tiến hành định lượng

2.1.1.2 Nguyên liệu và thiết bị:

- Nguyên liệu:

Chất đối chiếu cafein là ống 200 mg đạt 99,63% của Viện kiểm nghiệm (SKS: 0100099)

Natri benzoat (Merck)

Mẫu thử là dung dịch thuốc tiêm Cafein 7% của Xí nghiệp Dược phẩm Trung ương II (SKS: 041205 - Hạn dùng: 041207)

- Thiết bị:

Máy quang phổ UV-1700 series của hãng Shimadzu

Đây là một máy quang phổ 2 chùm tia hiện đại, chính xác Có trang bị phần mềm xử lý các số liệu hằng ngày và lưu giữ các thông số gốc của máy và có thể cài đặt lại khi chương trình chạy máy bị hỏng

Máy có thể đo trong khoảng bước sóng 190 nm - 900 nm với nhiều chức năng: đo độ hấp thụ, độ truyền qua, ghi dải phổ, ghi phổ đạo hàm từ bậc 1 đến bậc 4 và đạo hàm tỷ đối

Độ phân giải: 0,1 nm

Tốc độ quét: trung bình

- Các điều kiện ghi phổ:

Cốc đo thạch anh bề dày 1 cm

Tốc độ quét: trung bình

Độ rộng khe: 1 nm

Mẫu trắng: nước cất

17

-2.1.2 Phương pháp thực nghiệm:

2.1.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng CA và NB bằng phương pháp

quang p h ổ đạo hàm tỷ đôi:

- Phương pháp xây dựng được khảo sát với các nội dung:

+ Chọn bước sóng định lượng thích hợp để loại bỏ được ảnh hưởng của các chất gây cản trở

+ Chọn vùng nồng độ có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và các giá trị PĐHTĐ bậc thích hợp

+ Kiểm tra độ lặp lại

+ Kiểm tra độ đúng của phương pháp

- Dựa vào các kết quả xử lý thống kê để biện luận và rút ra các kết luận cần thiết

2.1.2.2 So sánh một sô phương pháp định lượng bằng quang p h ổ trên đôi

tượng nghiên cứu:

- Tiến hành định lượng các thành phần trong cùng mẫu bằng các phương pháp:

+ Đo quang tại nhiều bước sóng

hệ số a, b và r một cách nhanh chóng Thường gặp khi cần tìm khoảng nồng độ tuyến tính

Ngoài ra có thể dùng các hàm của Microsoft Excel để xác định các đại lượng đặc trưng của các mẫu thống kê như:

2.2.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu:

2.2.1.1 Các dung dịch chuẩn đơn chất và hỗn hợp:

❖ Dung dịch chuẩn CA: cân chính xác khoảng 50 mg CA chuẩn, pha với nước,

định mức thành 50 mL Lấy chính xác 10 mL dung dịch trên cho vào bình định mức 100 mL, thêm nước vừa đủ để có dung dịch gốc CA có nồng độ 100 |ig/mL

Từ dung dịch gốc này pha thành dãy chuẩn có nồng độ: 2,5; 5; 10; 15 và 20fig/mL

♦♦♦ Dung dịch chuẩn NB: cân chính xác khoảng 75 mg NB chuẩn, pha với nước,

định mức thành 50 mL Lấy chính xác 10 mL dung dịch trên cho vào bình định mức 100 mL, thêm nước vừa đủ để có dung dịch gốc NB có nồng độ 150 |ig/mL

Từ dung dịch gốc này pha loãng thành dãy dung dịch có nồng độ: 3,75; 7,5; 15; 22,5 và 30 |ig/mL

♦♦♦ Dung dịch hỗn hợp chuẩn CA và NB: Các dung dịch HH1 đến HH5 được

chuẩn bị từ các dung dịch gốc đơn chất theo các thể tích như trong bảng 2.1