Nghiên cứu loài bình vôi thu hái tại sapa (stephania brachyandra diels)

BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI BÙI THỊ THẢO NGHIÊN cútr LOÀI BÌNH VÔI THU HÁI TẠI SA PA (STEPHANIA BRACHYANDRA DIELS.) (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2002-2007) __ Người hướng dẫn : Gs.Ts. Phạm Thanh Ths. Nguyễn Quốc Huy Nơi thực hiện : BỘ MÔN Dược LIỆU TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI Thời gian thực hiện: 08/2006 - 05/2007 HÀ NỘI, THÁNG 05-2007 Jlcßl c ẩ m Cßti. (ịu d UZềi t k i ^ ít ìệ tt Uiậ4i, i ũ , tô i ầ ă HỈtậ*t ầiẹ(fc HÌùều> i ự d ẫ n 4Ằâ ẹ iiíp . đ ^ o ả a c á ữ Ìỉtầ Ỷ câ, ẹ ia đ ln k o ă ếạtu ỉtè . '^ở¿ íUn ÌnẩẬt ũọHẹ> Itàif- t ỉ ÌÒHỶ ỉũ ế t cen- ¿âu> ¿ắc däa^ minU đ ến Q ề. p kạm '^ ịlcu íịl Kiỷ, t u ị t ^ tk ầ ỉỷ đ ã íu õ ỉi, i ậ i t ũ n k ỉuữỀHỶ d ẫ n o ă c iu ìtầo -o k o - tô i. íù n h â tt tnữ*uỊ> cảm Cßn “^Uẵ ỉ^ẹiUỷễH, 2 iiẩ o J ỉtu ỷ , *iẹiếũA UtầỶ đ ã Lu&n n ỉù ệ t ũ n k kưth iỶ <lẫ*í tíă đ ậtiỶ lữên td i atißofi (Ịua m ọi k h á kkăK. 'XÌK ck âK tỉià iiẤ a ỉm <ßn> v ă ỉỉầỶ ÌẴ lằ4i4Ị> iỷẽu, ttiển , ÌM cảo C(m iậ c ả a ìtặ m&n liệ u , v ã Ịfậ mồ*v 'I kự c ư ậ t, K ÍiỉènỶ H<f*e0ßi đ ã kỉt&HỶ *t<ỹại UUữ- kJiãH^ o ẩ t v Ậ để(ịiúỹ’ ÌM iio à n -U iánU kJiữd li4ậ*i. X ù i hàiỷ t ỉ tò iiỶ Jũết Cßtt ỈM cUa mẹ, HẦtữnỶ tuỊứòei luở*t là c ltẫ ầ t^ iU ik tUä4i> ck o -iồ i 4jüà x in cầm <m cấc <24ik cỊụ em, <ịi(í đm U k iện , k ạ c tậ p ,. X m ìtàiỷ t ỉ ¿ự iỷêu> mể*t ÌM cdo ỉtạ n Jtè tò i, täüfyuf, Kẹưceí đ ã Lứ*t ẻ ỉíê tt t&i, cỉu a á ẻ cùn Ỷ ià l iiẦtiỆttỶ iu ũ v ă Hầi ỉuiầH t^uutỉỊ, ỉtọ c ể a . ß i u ^ iíỊ MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 PHẦN 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Đặc điểm thực vật của chi Stephania Lour 2 1.1.1. Vị trí phân loại của chi Stephania Lour 2 1.1.2. Đặc điểm chung của chi Stephania Lour 2 1.1.3. Đặc điểm phân loại loài Stephania brachyandra Diels 3 1.1.4. Các loài thuộc chi Stephania Lour ở Đông Dương và Việt Nam 3 1.2. Phân bố của chi Stephania Lour 5 1.2.1. Trên thế giói 5 1.2.2. ở Việt Nam 5 1.3. Thành phần hoá học 5 1.3.1. Những nghiên cứu về alcaloid trong chi Stephania Lour trên thế giới 5 1.3.2. Những nghiên cứu về alcaloid trong chi Stephania Lour ở Việt Nam 6 1.4. Tác dụng dược lý và độc tính 8 1.5. Công dụng và dạng bào chế 11 PHẦN 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM 12 2.1. Nguyên liệu 12 2.2. Phương tiện nghiên cứu 12 2.3. Phương pháp nghiên cứu 13 PHẦN 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 14 3.1. Mô tả đặc điểm thực vật 14 3.2. Đặc điểm vi phẫu 17 3.2.1. Đặc điểm vi phẫu thân 17 3.2.2. Đặc điểm vi phẫu cuống lá 18 3.3, Đặc điểm bột dược liệu 18 3.4. Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu 20 3.4.1. Định tính alcaloid 20 3.4.2. Định tính Aavonoid 21 3.4.3. Định tính anthranoid 21 3.4.4. Định tính coumarin 22 3.4.5. Định tính glycosid 22 3.4.6. Định tính saponin 23 3.4.7. Định tính tanin 23 3.4.8. Định tính tinh bột 24 3.4.9. Định tính đường khử tự do 24 3.4.10. Định tính acid hữu cơ 24 3.5. Định tính alcaloid bằng sắc ký lớp mỏng 26 3.6. Chiết xuất alcaloid toàn phần 27 3.7. Phân lập alcaloid 29 3.7.1. Phân lập alcaloid bằng sắc ký cột 29 3.7.2. Phân lập alcaloid bằng phương pháp điều chỉnh pH 29 3.8. Nhận dạng các alcaloid 30 3.8.1. Kiểm tra độ tinh khiết của các alcaloid 30 3.8.2. Nhận dạng các chất Ti và P1 30 3.9. Khảo sát sơ bộ khả năng nhân giống 35 3.9.1. Nhân giống bằng củ nguyên vẹn 35 3.9.2. Nhân giống bằng hạt 36 PHẨN 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 38 4.1. Kết luận 38 4.2. Đề xuất 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC s. : Stephania TW : trung ương SKLM : sắc ký lớp mỏng TT : thuốc thử Số Tên hình, bảng Trang Bảng 1.1 Một số loài thuộc chi Stephania Lour. có ở Việt Nam 4 Bảng 1.2 Các nhóm chất chính trong chi Stephania Lour. 6 Hình 3.1 Đoạn thân mang lá 15 Hình 3.2 Củ 15 Hình 3.3 Hoa cái 15 Hình 3.4 Hoa đực 16 Hình 3.5 Quả 16 ffinh 3.6 Hạt 16 Hình 3.7 Vi phẫu thân 19 Hình 3.8 VI phẫu cuống lá 19 Hình 3.9 Đặc điểm bột dược liệu 20 Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hưu cơ trong dược liệu 25 Bảng 3.2 Kết quả định tính alcaloid bằng SKLM 27 Hình 3.10 Sắc ký đồ định tính alcaloid 27 Hình 3.11 Sơ đồ chiết xuất alcloid toàn phần 28 Bảng 3.3 Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân của Tj 34 Hình 3.12 Sắc ký đồ so sánh chất TiVÓi L-tetrahydropalmatin chuẩn 35 Hình 3.13 Hạt mới nảy mầm 37 Hình 3.14 Hạt sau nảy mầm 3 ngày 37 Hình 3.15 Cây bình vôi non trồng từ hạt 37 Hình 3.16 Cây bình vôi non sau khi ra bầu 37 ĐẶT VẤN ĐỂ Qii Stephania Lour, là một chi lớn và phức tạp đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới cũng như ở Việt Nam. ở Việt Nam có nhiều loài thuộc chi này mang tên bình vôi. Loài bình vôi Stephania brachyandra Diels {S. brachyandra Diels) ở Sa Pa là một loài cây quý do có hàm lượng L- tetrahydropalmatin rất lớn. Hiện nay loài này đã bị khai thác quá mức nên đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam. Với xu thế sử dụng thuốc hiện nay, ngành Dược đang chú trọng đến các chất có tác dụng chữa bệnh nguồn gốc thảo dược. Hơn nữa, đã có những khuyến cáo chính thức về nhóm thuốc Diazepam do khả năng gây nghiện và một số tác dụng không mong muốn khác nên việc nghiên cứu các dược liệu có tác dụng an thần càng trở nên có ý nghĩa. Với mục tiêu: góp phần tìm hiểu về đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và khả năng nhân giống của loài bình vôi này chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu loài bình vôi thu hái tại Sa Pa (Stephania brachyandra Diels)” với các nội dung sau: 1- Về thực vật: - Mô tả đặc điểm thực vật, thẩm định lại tên khoa học của loài nghiên cứu. - Xác định đặc điểm vi phẫu thân, lá và đặc điểm bột dược liệu loài nghiên cứu. 2- Về thành phần hoá học: - Định tính các nhóm chất trong dược liệu. - Chiết xuất và phân lập một số alcaloid. - Nhận dạng các chất phân lập dược. 3- Khảo sát sơ bộ khả năng nhân giống của loài bình vôi nghiên cứu. PHẦN 1 - TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm thực vật của chi Stephania Lour. 1.1.1. Vị trí phân loại chi Stephania Lour. Theo tài liệu [2], [6 ], [11], [30], chi Stephania Lour. thuộc ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae) liên bộ Hoàng liên (Ranunculanae) bộ Hoàng liên (Ranunculales) phân bộ Tiết dê (Menispermineae) họ Tiết dê (Menispermaceae) 1.1.2 Đặc điểm chung của chi Stephania Lour Theo tài liệu [2], [18], [30], chi Stephania Lour. được mô tả như sau: Dây leo, hầu hết mảnh khảnh. Thân gỗ hay thân cỏ. Rễ đôi khi thành củ. Lá với cuống thường gấp khúc ở gốc, phiến lá hình lọng, thường hình trứng hay gần hình tròn, 8-13 gân lá hình chân vịt. Cụm hoa ở kẽ lá hay mọc trên thân cây già không lá, thường cấu tạo bởi những xim dạng tán có cuống, đơn độc hay xếp theo kiểu chùm, ít nhất ở các nhánh của tán cấp 1 , các nhánh cuối cùng đôi khi không đều, hoặc đôi khi có các xim tụ họp thành đầu hình đĩa. Hoa đực 6-8 lá đài rời nhau, xếp thành 2 vòng, bằng nhau hay không bằng nhau, hoặc chỉ có 2-3 lá đài ở s. capitata, đài ít nhiều hình trái xoan ngược. Cánh hoa rời nhau, 3 hay 4, hình trứng ngược, mép bên nhiều khi gập vào trong. Nhị hợp thành một trụ, bao phấn 4-8 ô nứt ngang. Hoa cái đối xứng hay bất đối xứng, 1-8 lá đài, 2-4 cánh hoa, 1 lá noãn vòi rất ngắn hoặc không có, núm nhụy chia thùy ngắn hoặc rách, choãi ra. Quả hạch hình trứng ngược với vết sẹo của núm gần gốc, nhẩn; vỏ quả trong ờ phía lưng mang một dải hình móng ngựa gồm 2 hay 4 dãy dọc các bướu hay những gờ ngang. Hạt hình móng ngựa. Giá noãn có hoặc không có các lỗ thủng. Cây mầm có lá mầm bằng rễ mầm, bao quanh bởi nội nhũ. 1.1.3 Đặc điểm phân loại loài Stephania brachyandra Diels Theo khoá phân loại của Trung Quốc [33], [34] loài Stephania brachyandra Diels. có những đặc điểm sau: - Rễ củ to, thưòng nổi lên mặt đất. - Cuống tán hoa có lá bắc. - Hoa cái có bao hoa không đối xứng, đài 1, có khi 2 hoặc 3; cánh hoa 2 , có khi 3. - Cánh hoa đực có mép bên cạnh cuộn vào. - Cuống quả không nạc. Quả hạch to. - Hạt 9-10 mm, ở lưng có mang những hàng gai dọc, gai có đầu tù hoặc hơi phình ra, hoặc hình đầu, hạt có lỗ thủng ở giữa. 1.1.4 Số lượng các loài thuộc chi Stephania Lour, đã công bố Trên thế giới hiện nay thống kê được tên khoảng 107 loài thuộc chi Stephania Lour.[31]. Thống kê ở Đông Dưoĩig và Việt Nam, theo tác giả Nguyễn Tiến Bân [2] có 9 loài, Võ Văn Chi [11] có 8 loài, Phạm Hoàng Hộ [15] có 7 loài, Trần Công Khánh [17] có 9 loài, Sách đỏ Việt Nam [21] có 5 loài. Theo Nguyễn Qiiều, Ngô Trại [9], Nguyễn Tiến Vững [10], [31], [32] mô tả 14 loài thuộc chi Stephania Lour, có ở Việt Nam (bảng 1.1). Bảng 1.1. Một số loài thuộc chi Stephanỉa Lour, có ở Việt Nam STT Loài Tên Việt Nam Tài liệu 1 s. brachyandra Diels Bình vôi 9; 31 2 s. Cambodia Gagnep Bình vôi 9; 31 3 s. cepharantha Hay Bình vôi 9; 31; 32 4 s. dielsiana Y.C.Wu Củ dòm 8 ; 9; 16; 27 5 s. excentrica H.s. Lo 9; 31 6 s. hainensỉs H.S.Lo Bình vôi 9; 31 7 s. hernandifolia (Willd.) Walp Dây mối 9; 31 8 S. kwangsiensis H.S.Lo Bình vôi Quảng Tây 9; 31 9 S. longa Lour. Dây lõi tiền rễ dài 9; 31 10 s pierrei. Diels Bình vôi trắng 9; 31 11 S. sínica Diels Bình vôi tán ngắn 9; 31 12 S. glabra (Roxb.) Miers Bình vôi (Ninh Bình) 9; 31 13 S. kuinanennis H.S.Lo et M.Yang Bình vôi (Lạng Sơn) 32 14 S. viridiflavens H.S.Lo et M.Yang Bình vôi (Sơn La) 10; 14 [...]... trong đó L-tetrahydropalmatin là 0,63% Năm 2004 Đỗ Phương Loan [18] đã xác định hàm lượng alcaloid toàn phần trong củ bình vôi thu hái ở Sapa ( .brachyandra Diels) là 10,38%, trong S đó L-tetrahydropalmatin là 3,7% ở Việt Nam chưa tìm được tài liệu nào tiếp tục nghiên cứu về loài bình vôi này 1.4 Tác dụng dược lý và độc tính Rotundin (L-tetrahydropalmatin) Theo tài liệu [27] L-tetrahydropalmatin thử... e r i thu hái ở Nghĩa Bình ire Năm 1999, Nguyễn Tiến Vững [31] đã phân lập và xác định cấu trúc 5 alcaloid: - L-tetrahydropalmatin từ củ cả 3 loài s glabra (Roxb.) Miers., kuinanensỉs H.S.Lo et M.Yangvà Stephania sp3 t u hái ở Quảng Ninh h - Roemetin từ quả xanh loài s glabra (Roxb.) Miers - Palmatin từ củ loài Stephania s jthu hái từ Quảng Ninh p - Cycleanin từ củ loài Stephania sọị thu hái từ Quảng... Viện nghiên cứu cây thu c và cây có tinh dầu toàn bang Xô Viết (Vilar) đã xác định Rotundin của Bùi Đình Sang chiết được từ củ bình vôi ở Việt Nam chính là L-tetrahydropalmatin Năm 1964, Ngô Vân Thu [25] chiết được một alcaloid ở loài bình vôi khác với tỷ lệ 0,1% và đã xác định đó là Roemetin năm 1971 Bùi Thị Bằng và cộng sự [28] đã khảo sát hàm lượng Ltetrahydropalmatin trên một số mẫu bình vôi mọc... nhỏ, gai có đầu tù Giá noãn có lỗ hình trứng đảo ở giữa Qua quan sát các đặc điểm của loài nghiên cứu và tham khảo các tài liệu nhất là khóa phân loại chi Stephania Lour, của Trung Quốc, chúng tôi đã xác định loài nghiên cứu là Stephania brachyandra Diel, họ Tiết dê: Menispermaceae Tên Việt Nam: bình vôi núi cao, bình vôi nhị ngắn Hình 3.1 Đoạn thân mang lá Hình 3.2 Củ 3.3d Hình 3.3 Hoa cái 3.3a, 3.3b... Chúng tôi thu hái mẫu tại Sa Pa (Lào Cai) vào tháng 07 năm 2006 Lấy mẫu trồng ở Hà Nội để theo dõi sự phát triển của cây Thu mẫu có hoa, quả, hạt ở Sa Pa để thẩm định tên khoa học, lấy củ và hạt làm nguyên liệu nghiên cứu 2.2 Phương tiện nghiên cứu - Vi phẫu được chụp ảnh trực tiếp trên kính hiển vi tại bộ môn Thực vật Trường Đại học Dược Hà Nội - Phân tích hoa bằng kính lúp nổi Nikon của Nhật tại bộ... củ bình vôi không phụ thu c vào màu sắc, khối lượng và hình dáng của củ Để đảm bảo chất lượng của dược liệu, kết hợp bảo vệ tái sinh cây, chỉ nên thu những củ có khối lượng từ 800g đến lOOOg trở lên Năm 1981, Văn Thị Sáu [22] phát hiện L-tetrahydropalmatin ở loài s p e r iDiels thu được ở Nghĩa Bình ire Năm 1992, Ngô Thị Tâm [23] công bố phát hiện có chất Cepharanthin trong củ bình vôi s p e r i thu. .. Malaysia, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam, Philippin, Ẩi Độ, Bangladesh, Srilanca, Trung Quốc, Đài Loan, Papua New Guinea, Nhật Bản, Australia, Nigeria, Ethiopi 1 2 2 ở V ệ Nam i t Theo tài liệu [4], [9], [15], [26], [31] các loài bình vôi thường mọc hoang ở một số vùng núi đá vôi, núi đất lẫn đá, ở đồng bằng, ven biển, có loài mọc ngay trên bãi cát hoặc gò cát hoang vùng ven biển Các loài bình vôi ở... đó có Sinoacutin C14H21NO4 Gồm 1 chất là Protostephamin C 2 1H 2 7 N O 4 có trong loài Stephania japónica (Thunb) Miers 1 3 2 Những nghiên cứu về a c l i trong c iStephania Lour V ệ Nam laod h ở it Trong tài liệu “Cây thu c và vị thu c Việt Nam” của Gs Đỗ Tất Lợi [19] có ghi: năm 1940 Bùi Đình Sang xác định củ bình vôi mọc ở Việt Nam có tinh bột, đường khử, men oxydase, nhiều alcaloid với tỉ lệ 0,12-0,15%... Dòm ( d e s a a Y.C.Wu) thu hái ở Hà Tây là S ilỉn 0,41% Đã chiết xuất và phân lập được một chất khác, dự kiến công thức là C19H15O3N, có cấu trúc khung Aporphin Năm 2003 Vũ Xuân Giang [14] đã phân lập được L-tetrahydropalmatin và palmatin từ loài S v r d f a e s H.S.Lo et M Yang thu hái ở Sơn La, đồng iiilvn thời cũng đã xác định hàm lượng alcaloid toàn phần trong củ bình vôi này là 2,92%, trong đó... Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Hà Tây, Hòa Bình, Yên Bái, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Phú Thọ, Lào Cai, Hà Giang, Sơn La, Nam Định, Ninh Bình + Miền Trung: Thanh Hóa, Nghệ An, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Ninh Thu n, Quảng Nam, Đà Nẵng, Thừa Thiên Huế, Bình Định, Phú Yên + Miền Nam: An Giang, Đồng Nai, Sông Bé, Bà Rịa-Vũng Tàu 1.3 Thành phần hóa học 1 3 1 Những n h ê cứu v a c l i t o gc iStephania Lour t ê t . tài Nghiên cứu loài bình vôi thu hái tại Sa Pa (Stephania brachyandra Diels) với các nội dung sau: 1- Về thực vật: - Mô tả đặc điểm thực vật, thẩm định lại tên khoa học của loài nghiên cứu. -. loài thu c chi này mang tên bình vôi. Loài bình vôi Stephania brachyandra Diels {S. brachyandra Diels) ở Sa Pa là một loài cây quý do có hàm lượng L- tetrahydropalmatin rất lớn. Hiện nay loài. phần trong củ bình vôi thu hái ở Sapa (S. brachyandra Diels) là 10,38%, trong đó L-tetrahydropalmatin là 3,7%. ở Việt Nam chưa tìm được tài liệu nào tiếp tục nghiên cứu về loài bình vôi này. 1.4.