Nghiên cứu loài bình vôi thu hái tại sapa (stephania brachyandra diels)

Với mục tiêu: góp phần tìm hiểu về đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và khả năng nhân giống của loài bình vôi này chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu loài bình vôi thu hái tại Sa

BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

BÙI THỊ THẢO

NGHIÊN c ú tr LOÀI BÌNH VÔI THU HÁI TẠI SA PA

(STEPHANIA BRACHYANDRA DIELS.)

Ths Nguyễn Quốc Huy

Thời gian thực hiện: 08/2006 - 05/2007

HÀ NỘI, THÁNG 05-2007

Jlcßl c ẩ m Cßti.

dẫn 4Ằâ ẹiiíp đ^oảacáữ ÌỉtầỶ câ, ẹia đln k oă ếạtu ỉtè.

'^ở¿ íUn ÌnẩẬt ũọHẹ> Itàif- t ỉ ÌÒHỶ ỉũết cen- ¿âu> ¿ắc däa^ minU đến Qề pkạm

'^ịlcuíịl Kiỷ, tu ịt^ tkầỉỷ đã íuõỉi, iậ it ũnk ỉuữỀHỶ dẫn oă ciuìtầo-oko- tôi.

íùn h â tt tnữ*uỊ> cảm Cßn “^Uẵ ỉ^ẹiUỷễH, 2iiẩo Jỉtuỷ, *iẹiếũA UtầỶ đã Lu&n nỉùệt

ũnk kưthiỶ <lẫ*í tíă đậtiỶ lữên tdi atißofi (Ịua mọi khá kkăK.

'XÌK ckâK tỉiàiiẤ aỉm <ßn> vă ỉỉầỶ ÌẴ lằ4i4Ị> iỷẽu, ttiển, ÌM cảo

C(m iậ cảa ìtặ m&n liệu, vã Ịfậ mồ*v 'Ikực ưật, KÍiỉènỶ H<f*e0ßi đã kỉt&HỶ *t<ỹại

UUữ-kJiãH^ o ẩ t vẬ để(ịiúỹ’ ÌM iioàn-UiánU kJiữd li4ậ*i.

Xùi hàiỷ t ỉ tòiiỶ Jũết Cßtt ỈM cUa mẹ, HẦtữnỶ tuỊứòei luở*t là cltẫ ầ t^ iUik tUä4i>

cko-iồi 4jüà xin cầm <m cấc <24ik cỊụ em, <ịi(í đmU

kiện, kạc tập,.

Xm ìtàiỷ t ỉ ¿ự iỷêu> mể*t ÌM cdo ỉtạn Jtè tòi, täüfyuf, Kẹưceí đã Lứ*t ẻ ỉíêtt t&i, cỉua

áẻ cùnỶ ià l iiẦtiỆttỶ iuũ vă Hầi ỉuiầH t^uutỉỊ, ỉtọc

ể a ß iu ^ iíỊ

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Đặc điểm thực vật của chi Stephania Lour 2

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Stephania Lour 2

1.1.2 Đặc điểm chung của chi Stephania Lour 2

1.1.3 Đặc điểm phân loại loài Stephania brachyandra Diels 3

1.1.4 Các loài thuộc chi Stephania Lour ở Đông Dương và Việt Nam 3

1.2 Phân bố của chi Stephania Lour 5

1.2.1 Trên thế giói 5

1.2.2 ở Việt Nam 5

1.3 Thành phần hoá học 5

1.3.1 Những nghiên cứu về alcaloid trong chi Stephania Lour trên thế giới 5

1.3.2 Những nghiên cứu về alcaloid trong chi Stephania Lour ở Việt Nam 6

1.4 Tác dụng dược lý và độc tính 8

1.5 Công dụng và dạng bào chế 11

PHẦN 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM 12

2.1 Nguyên liệu 12

2.2 Phương tiện nghiên cứu 12

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

PHẦN 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 14

3.1 Mô tả đặc điểm thực vật 14

3.2 Đặc điểm vi phẫu 17

3.2.1 Đặc điểm vi phẫu thân 17

3.2.2 Đặc điểm vi phẫu cuống lá 18

3.3, Đặc điểm bột dược liệu 18

3.4 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu 20

3.4.1 Định tính alcaloid 20

3.4.2 Định tính Aavonoid 21

3.4.3 Định tính anthranoid 21

3.4.4 Định tính coumarin 22

3.4.5 Định tính glycosid 22

3.4.6 Định tính saponin 23

3.4.7 Định tính tanin 23

3.4.8 Định tính tinh bột 24

3.4.9 Định tính đường khử tự do 24

3.4.10 Định tính acid hữu cơ 24

3.5 Định tính alcaloid bằng sắc ký lớp mỏng 26

3.6 Chiết xuất alcaloid toàn phần 27

3.7 Phân lập alcaloid 29

3.7.1 Phân lập alcaloid bằng sắc ký cột 29

3.7.2 Phân lập alcaloid bằng phương pháp điều chỉnh pH 29

3.8 Nhận dạng các alcaloid 30

3.8.1 Kiểm tra độ tinh khiết của các alcaloid 30

3.8.2 Nhận dạng các chất Ti và P1 30

3.9 Khảo sát sơ bộ khả năng nhân giống 35

3.9.1 Nhân giống bằng củ nguyên vẹn 35

3.9.2 Nhân giống bằng hạt 36

PHẨN 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 38

4.1 Kết luận 38

4.2 Đề xuất 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

s. : Stephania

SKLM : sắc ký lớp mỏng

Số Tên hình, bảng Trang Bảng 1.1 Một số loài thuộc chi Stephania Lour có ở Việt Nam 4

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hưu cơ trong dược liệu 25

Hình 3.12 Sắc ký đồ so sánh chất TiVÓi L-tetrahydropalmatin chuẩn 35

ĐẶT VẤN ĐỂQii Stephania Lour, là một chi lớn và phức tạp đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới cũng như ở Việt Nam ở Việt Nam có nhiều loài thuộc chi này mang tên bình vôi Loài bình vôi Stephania brachyandra Diels {S brachyandra Diels) ở Sa Pa là một loài cây quý do có hàm lượng L- tetrahydropalmatin rất lớn Hiện nay loài này đã bị khai thác quá mức nên đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam.

Với xu thế sử dụng thuốc hiện nay, ngành Dược đang chú trọng đến các chất có tác dụng chữa bệnh nguồn gốc thảo dược Hơn nữa, đã có những khuyến cáo chính thức về nhóm thuốc Diazepam do khả năng gây nghiện và một số tác dụng không mong muốn khác nên việc nghiên cứu các dược liệu có tác dụng an thần càng trở nên có ý nghĩa.

Với mục tiêu: góp phần tìm hiểu về đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và khả năng nhân giống của loài bình vôi này chúng tôi thực hiện đề tài

“Nghiên cứu loài bình vôi thu hái tại Sa Pa (Stephania brachyandra

Diels)” với các nội dung sau:

- Định tính các nhóm chất trong dược liệu.

- Chiết xuất và phân lập một số alcaloid.

- Nhận dạng các chất phân lập dược.

3- Khảo sát sơ bộ khả năng nhân giống của loài bình vôi nghiên cứu.

PHẦN 1 - TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm thực vật của chi Stephania Lour.

1.1.1 Vị trí phân loại chi Stephania Lour.

Theo tài liệu [2], [ 6 ], [11], [30], chi Stephania Lour thuộc

ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae)

liên bộ Hoàng liên (Ranunculanae)

bộ Hoàng liên (Ranunculales) phân bộ Tiết dê (Menispermineae)

họ Tiết dê (Menispermaceae)

1.1.2 Đặc điểm chung của chi Stephania Lour

Theo tài liệu [2], [18], [30], chi Stephania Lour được mô tả như sau: Dây leo, hầu hết mảnh khảnh Thân gỗ hay thân cỏ Rễ đôi khi thành

củ Lá với cuống thường gấp khúc ở gốc, phiến lá hình lọng, thường hình trứng hay gần hình tròn, 8-13 gân lá hình chân vịt Cụm hoa ở kẽ lá hay mọc trên thân cây già không lá, thường cấu tạo bởi những xim dạng tán có cuống, đơn độc hay xếp theo kiểu chùm, ít nhất ở các nhánh của tán cấp 1 , các nhánh cuối cùng đôi khi không đều, hoặc đôi khi có các xim tụ họp thành đầu hình đĩa Hoa đực 6 - 8 lá đài rời nhau, xếp thành 2 vòng, bằng nhau hay không bằng nhau, hoặc chỉ có 2-3 lá đài ở s capitata, đài ít nhiều hình trái xoan ngược Cánh hoa rời nhau, 3 hay 4, hình trứng ngược, mép bên nhiều khi gập vào trong Nhị hợp thành một trụ, bao phấn 4-8 ô nứt ngang Hoa cái đối xứng hay bất đối xứng, 1-8 lá đài, 2-4 cánh hoa, 1 lá noãn vòi rất ngắn hoặc không có,

núm nhụy chia thùy ngắn hoặc rách, choãi ra Quả hạch hình trứng ngược với vết sẹo của núm gần gốc, nhẩn; vỏ quả trong ờ phía lưng mang một dải hình móng ngựa gồm 2 hay 4 dãy dọc các bướu hay những gờ ngang Hạt hình móng ngựa Giá noãn có hoặc không có các lỗ thủng Cây mầm có lá mầm bằng rễ mầm, bao quanh bởi nội nhũ.

1.1.3 Đặc điểm phân loại loài Stephania brachyandra Diels

Theo khoá phân loại của Trung Quốc [33], [34] loài Stephania brachyandra Diels có những đặc điểm sau:

- Rễ củ to, thưòng nổi lên mặt đất.

- Cuống tán hoa có lá bắc.

- Hoa cái có bao hoa không đối xứng, đài 1, có khi 2 hoặc 3; cánh hoa

2 , có khi 3.

- Cánh hoa đực có mép bên cạnh cuộn vào.

- Cuống quả không nạc Quả hạch to.

- Hạt 9-10 mm, ở lưng có mang những hàng gai dọc, gai có đầu tù hoặc hơi phình ra, hoặc hình đầu, hạt có lỗ thủng ở giữa.

1.1.4 Số lượng các loài thuộc chi Stephania Lour, đã công bố

Trên thế giới hiện nay thống kê được tên khoảng 107 loài thuộc chi

Stephania Lour.[31].

Thống kê ở Đông Dưoĩig và Việt Nam, theo tác giả Nguyễn Tiến Bân [2] có 9 loài, Võ Văn Chi [11] có 8 loài, Phạm Hoàng Hộ [15] có 7 loài, Trần Công Khánh [17] có 9 loài, Sách đỏ Việt Nam [21] có 5 loài.

Theo Nguyễn Qiiều, Ngô Trại [9], Nguyễn Tiến Vững [10], [31], [32]

mô tả 14 loài thuộc chi Stephania Lour, có ở Việt Nam (bảng 1.1).

Bảng 1.1 Một số loài thuộc chi Stephanỉa Lour, có ở Việt Nam

1.2.Phân bố của chi Stephania Lour.

1.2.1 Trên thê giới

Theo tài liệu [31] chi Stephania Lour, phân bố ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, có ở các nước: Indonesia, Myanma, Malaysia, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam, Philippin, Ẩi Độ, Bangladesh, Srilanca, Trung Quốc, Đài Loan, Papua New Guinea, Nhật Bản, Australia, Nigeria, Ethiopi.

1.2.2 ở Việt Nam

Theo tài liệu [4], [9], [15], [26], [31] các loài bình vôi thường mọc hoang ở một số vùng núi đá vôi, núi đất lẫn đá, ở đồng bằng, ven biển, có loài mọc ngay trên bãi cát hoặc gò cát hoang vùng ven biển.

Các loài bình vôi ở nước ta có diện phân bố rất rộng trên cả 3 miền: Bắc, Trung, Nam.

+ Miền Bắc: Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Hà Tây, Hòa Bình, Yên Bái, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Phú Thọ, Lào Cai, Hà Giang, Sơn La, Nam Định, Ninh Bình.

+ Miền Trung: Thanh Hóa, Nghệ An, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Ninh Thuận, Quảng Nam, Đà Nẵng, Thừa Thiên Huế, Bình Định, Phú Yên.

+ Miền Nam: An Giang, Đồng Nai, Sông Bé, Bà Rịa-Vũng Tàu.

1.3.1 Những nghiên cứu về alcaloid trong chi Stephania Lour trên thế giới

Thành phần hóa học của chi Stephania gồm có alcaloid, tinh bột, đường khử, acid malic, men oxydase Trong đó alcaloid là thành phần chính và được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất.

Theo tài liệu [31], alcaloid có trong chi Stephania Lour, chia làm 8

5 Proaporphin Gồm 3 chất, trong đó có Stepharin C 18 H 19 NO 3

CJ 9 H 23 NO 4

7 Morphinan Gồm 1 1 chất, trong đó có Sinoacutin C 14 H 21 NO 4

8 Dibenzazonin Gồm 1 chất là Protostephamin C 2 1H 2 7 N O 4 có

trong loài Stephania japónica (Thunb) Miers.

1.3.2 Những nghiên cứu về alcaloid trong chi Stephania Lour ở Việt Nam

Trong tài liệu “Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của Gs Đỗ Tất Lợi [19] có ghi: năm 1940 Bùi Đình Sang xác định củ bình vôi mọc ở Việt Nam

có tinh bột, đường khử, men oxydase, nhiều alcaloid với tỉ lệ 0,12-0,15% (tính

trên củ tươi), trong đó chiết được một alcaloid Bùi Đình Sang đặt tên là Rotundin.

Năm 1965, Viện nghiên cứu cây thuốc và cây có tinh dầu toàn bang Xô Viết (Vilar) đã xác định Rotundin của Bùi Đình Sang chiết được từ củ bình vôi

ở Việt Nam chính là L-tetrahydropalmatin.

Năm 1964, Ngô Vân Thu [25] chiết được một alcaloid ở loài bình vôi khác với tỷ lệ 0,1% và đã xác định đó là Roemetin năm 1971.

Bùi Thị Bằng và cộng sự [28] đã khảo sát hàm lượng L- tetrahydropalmatin trên một số mẫu bình vôi mọc hoang ở các bộ phận thân,

rễ, củ và đi đến kết luận:

- Hàm lượng L-tetrahydropalmatin trong củ bình vôi không phụ thuộc vào màu sắc, khối lượng và hình dáng của củ Để đảm bảo chất lượng của dược liệu, kết hợp bảo vệ tái sinh cây, chỉ nên thu những củ có khối lượng từ 800g đến lOOOg trở lên.

Năm 1981, Văn Thị Sáu [22] phát hiện L-tetrahydropalmatin ở loài s pierrei Diels thu được ở Nghĩa Bình.

Năm 1992, Ngô Thị Tâm [23] công bố phát hiện có chất Cepharanthin trong củ bình vôi s pierrei thu hái ở Nghĩa Bình.

Năm 1999, Nguyễn Tiến Vững [31] đã phân lập và xác định cấu trúc 5 alcaloid:

- L-tetrahydropalmatin từ củ cả 3 loài s glabra (Roxb.) Miers., s

kuinanensỉs H.S.Lo et M.Yangvà Stephania sp3thu hái ở Quảng Ninh.

- Roemetin từ quả xanh loài s glabra (Roxb.) Miers

- Palmatin từ củ loài Stephania spj thu hái từ Quảng Ninh.

- Cycleanin từ củ loài Stephania sọị thu hái từ Quảng Ninh.

- Stepharin từ củ loài s kuinanensis H.S.Lo et M.Yang.

Năm 1999, Nguyễn Thị Hoài Anh [1] đã phân lập được 3 alcaloid từ củ bình vôi mọc ở Mộc Châu- Sơn La, không rõ loài gì nhưng đã xác định được cấu trúc hóa học:

- 9,10 Dihydroxy -2,3- dimethoxy tetrahydroprotoberberin.

- 2,10 Dihydro -3,9- dimethoxy tetrahydroprotoberberin (Stepholidin).

- 2 Hydroxy -3,9,10-trimethoxy tetrahydroprotoberberin (Iso

cory palmin tetrahy drocolumbamin).

Năm 2001 Nguyễn Quốc Huy [25] đã xác định hàm lượng L- tetrahydropalmatin trong củ Dòm (S dielsỉana Y.C.Wu) thu hái ở Hà Tây là 0,41% Đã chiết xuất và phân lập được một chất khác, dự kiến công thức là

C 19 H 15 O 3 N, có cấu trúc khung Aporphin.

Năm 2003 Vũ Xuân Giang [14] đã phân lập được L-tetrahydropalmatin

và palmatin từ loài S.viridiflavens H.S.Lo et M Yang thu hái ở Sơn La, đồng thời cũng đã xác định hàm lượng alcaloid toàn phần trong củ bình vôi này là 2,92%, trong đó L-tetrahydropalmatin là 0,63%.

Năm 2004 Đỗ Phương Loan [18] đã xác định hàm lượng alcaloid toàn phần trong củ bình vôi thu hái ở Sapa (S brachyandra Diels) là 10,38%, trong

triệu chứng giữ nguyên thể (catalepsy) với liều 2,5 mg/kg L- tetrahydropalmatin đối kháng tác dụng kích thích làm tăng hoạt động của chuột do Phenamin gây nên Trên chuột nhắt trắng bằng đường uống với liều

30 mg/kg L-tetrahydropalmatin có tác dụng kéo dài giấc ngủ của Thiopentan gấp 1,5 lần Đối với hoạt động của hệ thần kinh trung ương, quan sát trên điện não đồ của thỏ có cắm điện cực ở các vùng cảm giác, vận động trước sau phải trái và vùng thị giác của hai bán cầu não thấy L-tetrahydropalmatin với liều 20 mg/kg làm xuất hiện các cụm sóng chậm có biên độ cao Ngoài ra, thành phần các sóng delta ở các vùng vận động tăng và thành phần các sóng nhanh beta giảm [31].

Trên mô hình gây co giật bằng Conazol hoặc bằng Strychnin hoặc bằng shock điện Rotundin với liều cao (> 100 mg/kg) có tác dụng kháng co giật và bảo vệ được một phần súc vật khỏi bị tử vong Trên mèo gây mê dùng Rotundin bằng đường tiêm tĩnh mạch với liều 5-20 mg/kg có tác dụng làm hạ huyết áp [27].

Thí nghiệm trên ruột thỏ tại chỗ (instu) với liều 0,5-1,0 mg/kg làm giảm trương lực cơ troỉn trên ruột Bằng đường uống trên thỏ thí nghiệm với liều 15 mg/kg L-tetrahydropalmatin có tác dụng giảm đau [27].

Trên chuột cống trắng bình thường và chuột bị cắt tuyến giáp trạng, L- tetrahydropalmatin đều có tác dụng hạ nhiệt độ và giảm chuyển hoá cơ bản Tác dụng hạ nhiệt có thể là do ức chế trung khu điều nhiệt và làm giãn các mạch máu ngoại vi [27].

Về độc tính cấp, trên chuột nhắt trắng bằng đường uống, Rotundin chlohydrat có L D 5 0 = 1 0 0 0 mg/kg Trên thỏ, tiêm tĩnh mạch với liều 30 mg/kg, súc vật tỏ ra mệt mỏi trong 1-2 ngày sau đó phục hồi bình thường [27].

về độc tính mạn, trên chuột cống trắng cho cùng với liều 10-30 mg/kg trong 60 ngày liên tiếp không thấy xuất hiện các triệu chứng nhiễm độc trên các lô thí nghiệm [27].

Thí nghiệm trên chuột cống trắng đực, dùng với liều 8 mg trên mỗi con chuột, không gây đột biến nhiễm sắc thể ở tế bào tuỷ xương và tế bào tinh hoàn [27].

Cepharanthin

Cepharanthin được phân lập từ s cepharantha và s pierrei theo tài liệu [24] thử trên súc vật chiếu xạ tia X, Cepharanthin với liều 1 mg/kg làm giảm nhẹ hiện tượng giảm bạch cầu do sử dụng các thuốc chống ung thư gây nên,

có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu máu do collagen gây nên và có tác dụng ngăn ngừa sự phát triển của bệnh bụi phổi thí nghiệm Cepharanthin được coi

là một chất có tác dụng kích thích miễn dịch và làm giảm nhẹ một cách hữu hiệu những tác dụng phụ của các thuốc chống ung thư Cepharanthin ức chế sự phát triển của trực khuẩn lao Thí nghiệm trên ống kính (invitro) ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư Hela và Hela Sg.Cepharanthin đã được chứng minh có tác dụng ức chế mạnh quá trình sao chép (replication) của HIVI [27].

Palmatin

Palmatin hydroclorid có tác dụng ức chế đối với tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) và liên cầu khuẩn (Streptococcus), còn đối với các loại vi khuẩn khác (lỵ, thương hàn ) thì không thấy có kết quả rõ rệt Tác dụng ức chế vi khuẩn của palmatin hydroclorid kém các loại kháng sinh thông thường [5].

1.5 Công dụng và dạng bào chế

Theo các tài liệu [3], [4], [7], [ 8 ], [19], [27], [29] đã ghi loài bình vôi Việt Nam có:

Tính vị, quy kinh: Vị đắng hơi ngọt, tính mát, quy vào hai kinh can và tỳ Công năng, chủ trị: An thần, dưỡng huyết, thanh nhiệt, giải độc, tán ứ, hành huyết, hoá đàm, tán kết, khu phong, hoạt lạc Chủ trị mất ngủ, sốt nóng, nhức đầu, đau dạ dày, hen suyễn, khó thở, phối hợp với các thuốc khác để trị

ho, sốt rét, kiết lỵ, ngoài da lở ngứa, mụn nhọt.

Ngày 3-6g dược liệu dạng thuốc sắc, thuốc bột hay rượu thuốc.

Ngày dùng 0,05g-0,10g Rotundin dưới dạng thuốc bột, thuốc viên Có thể chế thành dạng tiêm 0,05g Rotundin hydroclorid hay Rotundin Sulfat trong ống 5ml Trẻ em từ 1-5 tuổi uống với liều từ 0,020g - 0,025g; trẻ em 5-10 tuổi uống từ 0,030g - 0,050g.

Hiện nay trên thị trường có các dạng bào chế:

- Viên Rotunda 30mg, viên Sen vông, viên Tepar, siro Rotunda ( Xí nghiệp Dược phẩm TW 2)

- Viên Rotunda 30mg ( Xí nghiệp Dược phẩm TW 1 ).

- Viên RosenSO ( 30 mg/viên ), chè an thần ( Xí nghiệp dược phẩm Hà Nội).

- Viên StiluxóO ( 60 mg/viên ) ( Công ty cổ phần Traphaco ).

- Viên nén bao phim Secluren ( Công ty dược và vật tư y tế Cà M au)

- Rotundin S u lf a t tiêm ( 60 mg/2ml) ( Học viện Quân Y)

- Cốm hoà tan Rotundin (tương đương 50 mg Rotundin/gói) ( Xí nghiệp dược phẩm 120 - Bộ Quốc phòng )

PHẦN 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM 2.1 Nguyên liệu

Chúng tôi thu hái mẫu tại Sa Pa (Lào Cai) vào tháng 07 năm 2006 Lấy mẫu trồng ở Hà Nội để theo dõi sự phát triển của cây Thu mẫu có hoa, quả, hạt ở Sa Pa để thẩm định tên khoa học, lấy củ và hạt làm nguyên liệu nghiên cứu.

2.2 Phương tiện nghiên cứu

- Vi phẫu được chụp ảnh trực tiếp trên kính hiển vi tại bộ môn Thực vật Trường Đại học Dược Hà Nội.

- Phân tích hoa bằng kính lúp nổi Nikon của Nhật tại bộ môn Thực vật Trường Đại học Dược Hà Nội.

- Đo độ ẩm xác định trên máy Precisa tại Bộ môn Dược liệu Trường Đại học Dược Hà Nội.

- Đo phổ tử ngoại (UV) trên máy GBC Instrument- 2855 tại Viện hoá học, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam.

- Đo phổ hồng ngoại (IR) trên máy Impact 410 của hãng Nicolet tại Viện Hoá học, Viện khjoa học và công nghệ Việt Nam.

- Phổ khối (MS) đo trên máy: 5989B-MS, tại phòng cấu trúc, Viện hóa học, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy NMR - BRUKER - 500MHZ tại phòng NMR, Viện hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3 Phương pháp nghiên cứu

- Vi phẫu được cắt và nhuộm theo phương pháp ghi trong tài liệu “Thực tập hình thái và giải phẫu thực vật” [17].

- Vi phẫu sau khi nhuộm được chụp ảnh qua kính hiển vi.

- Định tính các nhóm chất trong dược liệu theo tài liệu “Bài giảng dược liệu” [4] và “Thực tập dược liệu” [5].

- Chiết xuất và phân lập các alcaloid trong dược liệu theo tài liệu “Bài giảng dược liệu” [4] , “Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc” [12] và

“Chiết tách, phân lập, xác định các chất bằng dung môi hữu cơ: từ lý thuyết đến thực hành” [ 2 0 ].

- Nhận dạng các chất phân lập được dựa trên điểm chảy, SKLM so với chất chuẩn và số liệu các phổ u v , IR, MS, H^-NMR, C‘^-NMR.

- Nhân giống theo phương pháp ghi trong tài liệu [13].

Hoa đcfn tính khác gốc Cụm hoa mọc ở nách lá hoặc ở kẽ những cành ngắn Cụm hoa cái xim tán kép gần dạng đầu, cuống cụm hoa dài 5-10 cm, ở gốc tán có lá bắc nhỏ Hoa cái nhỏ có một đài màu lục nhạt, nhỏ, hình mác rộng nhọn đầu, 2 cánh hoa rời, xếp lệch về 2 phía, màu vàng cam, hình trứng ngược, dày, nạc, dài 0,5- 0,7 mm Bầu hình trứng ngược, núm nhuỵ có 5 thuỳ dạng gai nhỏ mềm ngả ra phía ngoài Cụm hoa đực xim tán kép, cuống cụm hoa dài 3-4 cm, gồm 7-8 tán, mỗi tán gồm 5-6 hoa, cuống hoa dài 4-5 mm, ở gốc có lá bắc nhỏ hình mác Hoa đực nhỏ gồm 6 lá đài rời, xếp trên 1 vòng, kích thước không đều nhau, 3 lá đài nhỏ xen kẽ với 3 lá đài lớn hơn, dài 1,7- 2,2 mm; cánh hoa 3, dày nạc, mép cánh hoa cuộn vào trong, giữa cánh hoa lõm vào tạo thành rãnh Bộ nhị hàn liền thành một trụ cao khoảng 0,5-1,0 cm, với 6 bao phấn xếp thành vòng tròn Quả hình trứng ngược, dài 0,7-0 ,8 cm, hơi dẹt, khi chín có màu đỏ Hạt hình móng ngựa có 4 hàng gai gờ lên ở phía lưng, mỗi hàng gai gồm 14-15 gai nhỏ, gai có đầu tù Giá noãn có lỗ hình trứng đảo ở giữa.

Qua quan sát các đặc điểm của loài nghiên cứu và tham khảo các tài liệu nhất là khóa phân loại chi Stephania Lour, của Trung Quốc, chúng tôi đã

xác định loài nghiên cứu là Stephania brachyandra Diel, họ Tiết dê: Menispermaceae Tên Việt Nam: bình vôi núi cao, bình vôi nhị ngắn.

Hình 3.1 Đoạn thân mang lá

3.3d Lá đài

Hình3.4 Hoa đực 3.4a, 3.4b: cụm hoa 3.4c, 3.4d: lá bắc 3.4e: bông hoa 3.4f: lá đài

3.2 Đặc điểm vi phẫu

3.2.1 Đặc điểm vi phẫu thân

Sử dụng đoạn thân bánh tẻ để cắt vi phẫu.

Lấy lát cắt ngang phần thân cây: Tẩy, nhuộm kép, loại nước, soi dưới kính hiển vi, quan sát thấy các đặc điểm sau (hình 3.7):

- Biểu bì (1): Cấu tạo bởi một hàng tế bào hình chữ nhật đều, phía ngoài phủ cutin.

- Mô mềm vỏ (2): Mô mềm vỏ thân được phân thành 2 phần bởi cung

mô cứng uốn lượn hình cánh hoa 8 cánh.

+ Mô mềm phía ngoài cung mô cứng: Gồm khoảng 10-15 hàng tế bào hình trứng, màng mỏng bằng cellulose, kích thước nhỏ hơn nhiều so với các tế bào mô mềm vỏ phía ngoài.

+ Mô mềm phía trong cung mô cứng: Gồm các tế bào màng mỏng bằng cellulose, hình đa giác không đều nhau, kích thước lớn hơn so với các tế bào mô mềm vỏ phía ngoài.

- Cung mô cứng (3): Cấu tạo bởi các tế bào hình nhiểu cạnh, màng dầy hoá gỗ, kích thước không đều nhau Mỗi cung mô cứng tương ứng với một bó libe - gỗ Các mô cứng xếp liền nhau tạo thành vòng gồm 8 cung.

- Bó libe - gỗ cấp II (4): Libe ở ngoài, gỗ ở trong, giữa bó libe - gỗ là hàng tế bào thượng tầng (tầng phát sinh libe - gỗ).

- Mô mềm ruột (5): Gồm những tế bào màng mỏng bằng cellulose, hình cầu, kích thước không đều nhau.

Tia ruột ( 6 ): Gồm những tế bào màng mỏng bằng cellulose, nằm xen

kẽ các bó libe - gỗ.

3.2.2 Đặc điểm vi phẫu cuống lá

Cắt ngang cuống, tẩy và nhuộm kép, soi kính hiển vi thấy có đặc điểm sau (hình 3.8):

Mặt cắt cuống lá có tiết diện tròn, từ ngoài vào trong có:

- Biểu bì ( 1 ): Gồm 1 hàng tế bào hình chữ nhật đều đặn, phía ngoài phủ một lớp cutin mỏng.

- Mô dày (2): Gồm 2-3 hàng tế bào mô dày góc xếp xen kẽ với hàng

- Bó libe - gỗ (5): Gồm 7 bó libe - gỗ kích thước khá đều nhau.

+ Bó libe: Phía ngoài, gồm nhiều tế bào màng mỏng bằng cellulose + Bó gỗ: Phía trong, gồm nhiều bó gỗ kích thước không đều nhau.

- Mô mềm ruột ( 6 ); Gồm những tế bào màng mỏng bằng cellulose, hình tròn, kích thước không đều nhau.

3.3 Đặc điểm bột dược liệu

Bột màu vàng, vị đắng, sau hơi ngọt.

Soi kính hiển vi thấy các đặc điểm sau: tinh bột (E), tinh bột kép đôi (H), tinh bột kép ba (I, K), tinh thể calcioxalat (C, B, D), thể cứng (A) (hình 3.9).

Hình 3.7 Vi phẫu thân

Hình 3.8 Vi phẫu cuống lá

3.4 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu

3.4.1 Định tính alcaloỉd

Lấy 5 g bột dược liệu cho vào bình nón có dung tích 200-250 ml thấm

ẩm dược liệu bằng dung dịch amoniac 6 N, trộn cho thấm đều, để yên 30 phút, cho vào bình nón 50 ml cloroform Lắc 5-10 phút, rồi để yên Igiờ Dịch chiết cloroform lọc qua giấy lọc không gấp nếp Lấy 30 ml dịch lọc cho vào bình gạn, thêm 5 ml H 2 SO 4 10% lắc 2-3 phút, gạn lấy phần acid để làm phản ứng Cho vào bốn ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết, rồi thêm vào từng ống một loại thuốc thử và thấy kết quả như sau:

- ống 1: nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer : có tủa trắng.

- ống 2: nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Dragendorff : có tủa da cam.

- ống 3: nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat : có tủa nâu.

- ống 4: nhỏ 2 - 3 giọt acid Rcric : có tủa màu vàng.

Nhân xét: Dươc liệu có alcaloid

3.4.2 Định tính Flavonoid

Lấy 5 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml cồn 90°c Lắc đều rồi để qua đêm Lọc và cô cách thuỷ dung dịch lọc còn lại khoảng 10 ml Dịch này để thử các phản ứng định tính sau:

- Phản ứng Cyanidin: Cho 2 ml dịch chiết vào 1 ống nghiệm, thêm một

ít bột Magie kim loại Sau đó cho thêm vài giọt HCl đặc Để yên một vài phút quan sát không thấy dung dịch chuyển màu từ vàng sang đỏ (phản ứng âm tính).

- Phản ứng với kiềm: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, hơ khô rồi để yên trên miệng lọ có chứa amoniac đặc không thấy màu vàng của dịch chiết được tăng lên (phản ứng âm tính).

- Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết dược liệu, thêm vài giọt NaOH

1 0 %, không thấy xuất hiện tủa màu vàng (phản ứng âm tính).

- Phản ứng với FeClji Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeClj 5% không thấy xuất hiện màu xanh đen (phản ứng âm tính).

Nhận xét Dược liệu không có flavonoid.

3.4.3 Định tính anthranoid

- Định tính antranoid: Qio 2g bột dược liệu vào bình nón 100 ml, thêm

15 ml dung dịch acid H 2 SO 4 10% Đun cách thuỷ 15 phút Lọc, chuyển dịch lọc vào bình gạn, lắc với 5-7 ml ether ethylic trong 1-2 phút Để yên cho tách thành hai lớp, loại bỏ phần nước Cho vào phần ether 5 ml dung dịch NaOH 10% Lắc lên thấy xuất hiện màu đỏ sim trong dung dịch kiềm (phản ứng dưcTQg tính).

- Vi thăng hoa: Cho vào ống trong nút chai bằng nhôm 1 ít bột dược liệu Đậy nút bằng một phiến kính, trên đó có một ít bông thấm nước Đun

dưới nút chai bằng đèn cồn qua lưới amiăng, lấy ra để nguội quan sát dưới kính hiển vi có tinh thể hình kim (phản ứng dương tính),

Nhận xét Dược liệu có antranoid.

3.4.4 Định tính coumarin

Lấy 5 g bột dược liệu cho vào cốc, thêm 50 ml cồn 90°, đun cách thuỷ trong khoảng 3-5 phút Lọc nóng qua giấy lọc Dịch chiết thu được làm các phản ứng sau:

- Phản ứng mở đóng vòng lacton: Cho vào ống nghiệm nhỏ mỗi ống nghiệm 1 ml dịch chiết, ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên Sau đó đun cả hai ống nghiệm đến sôi và để nguội quan sát cả 2 ống nghiệm đều trong Sau khi để nguội cho thêm vào mỗi ống 2 ml nước cất quan sát thấy cả 2 ống nghiệm đều trong (phản ứng âm tính).

- Phản ứng diazo hoá: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vào đó

2 ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thuỷ đến sôi và để nguội Thêm vài giọt thuốc thử diazo (mới pha) không thấy xuất hiện màu đỏ gạch (phản ứng âm tính).

Nhận xét'. Dược liệu không chứa coumarin.

3.4.5 Định tính glycosid tim

Lấy 2 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm, thêm 10 ml cồn 90° Đun cách thuỷ sôi trong vài phút, lọc qua giấy lọc, dịch lọc được dùng để làm phản ứng định tính.

- Phản ứng Liebermann: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn, bốc hơi cách thuỷ đến khô để nguội Thêm 0,5 ml anhydrid acetic, lắc mạnh, sau

đó thêm từ từ 0,5 ml H 2 SO 4 đậm đặc (sử dụng pipet đã sấy khô) theo thành ống nghiệm Không thấy màu tím đỏ xuất hiện ở mặt tiếp xúc hai chất lỏng (phản ứng âm tính).

- Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm 0,5 ml thuốc thử mới pha (gồm 0,5 ml dung dịch NaOH 10% và 9,5 ml dung dịch acid Picric trong nước) khồng thấy xuất hiện màu đỏ cam (phản ứng âm tính).

- Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 5 giọt dung dịch Natri Nitropprusiat 1% và vài giọt dung dịch NaOH 10%, không có màu đỏ xuất hiện (phản ứng âm tính).

Nhận xét: Dược liệu không có glycosid tim.

3.4.6 Định tính saponin

Lấy 2g bột dược liệu, cho vào bình nón 100 ml, thêm 20 ml nước cất, đun sôi nhẹ, lọc Dịch lọc cho vào một ống nghiệm và lắc ống nghiệm 5 phút dọc theo chiều dọc để yên 15 phút, quan sát hiện tượng tạo bọt Bọt tan sau 5 phút.

Nhận xét Dược liệu không có saponin.

3.4.7 Định tính tanin

Lấy Ig dược liệu cho vào cốc 100 ml, cho vào đó 15 ml H 2 O, đun cách thuỷ trong 15 phút Lọc dịch chiết qua giấy lọc thu được dung dịch dùng để định tính các phản ứng sau:

- Phản ứng với FeClj 5%: Cho 1 ml dịch lọc ở trên vào ống nghiệm, thêm vài giọt FeClj 5%, không thấy xuất hiện màu xanh đen (phản ứng âm tính).

- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Cho 1 ml dịch lọc ở trên vào một ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch gelatin 1% Quan sát không thấy xuất hiện tủa bông (phản ứng âm tính).

Nhận xét: Dược liệu không có tanin.

3.4.8 Định tính tinh bột

Nhỏ 1-2 giọt nước cất lên phiến kính nhỏ Dùng mũi mác lấy một ít dược liệu để vào giọt nước và nghiền đều Đậy lam kính lên trên, rồi nhỏ 1-2 giọt dung dịch lod-Iodid loãng nhỏ vào cạnh lam kính, dung dịch lod-Iodid thấm vào trong (hiện tượng mao dẫn) Soi kính hiển vi thấy các hạt tinh bột bị nhuộm màu xanh.

Nhận xét Dược liệu có tinh bột.

3.4.9 Định tính đường khử tự do

Lấy Ig bột dược liệu cho vào ống nghiệm 20 ml Thêm vào đó 10 ml

nước cất, đun cách thuỷ 3 - 5 phút Lọc nóng, lấy dịch lọc thử phản ứng sau:

- Cho 2 ml dịch lọc vào một ống nghiệm thêm vào đó 0,5 ml thuốc thử Fehling A và 0,5 ml thuốc thử Fehling B Đun sôi cách thuỷ vài phút thấy xuất hiện tủa đỏ gạch (phản ứng dưcfng tính).

Nhận xét Dược liệu có đường khử.

3.4.10 Định tính acid hữu cơ

Cho khoảng 2g bột dựoc liệu vào ống nghiệm to, thêm 5ml nước cất, đun sôl trực tiếp trong 10 phút, để nguội, lọc Lấy dịch lọc cho thêm ít tinh thể NajCOg, quan sát thấy có bọt khí bay lên (phản ứng dương tính).

Nhận xét: Dược liệu có acid hữu cơ.

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong củ loài bình vôi thu hái ở

Sa Pa được tóm tắt ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong củ

-Không

lacton Phản ứng diazo hoá

Phản ứng với dung dịch gelatin 1 %

Sử dụng bản mỏng Silicagen G F 2 5 4 đã tráng sẵn của Merck, hoạt hoá ở

- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký:

Lấy Ig bột dược liệu cần nghiên cứu chiết như phần định tính rồi cô cách thuỷ đến khô, cắn còn lại để nguội, hoà tan trong methanol Dịch chiết này để chấm sắc ký.

- Tiến hành:

Chấm dịch chiết dược liệu đã chuẩn bị ở trên lên một bản mỏng đã hoạt hoá, sau đó triển khai bằng 3 hệ dung môi sau:

Hệ II : Cloroform : Methanol: Amoniac [50:9:1]

Hệ III : Toluen : Aceton : Cồn : Amoniac [45:20:3:3]

Phun hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff So sánh sau nhiều lần khai triển sắc ký với 3 hệ dung môi trên chúng tôi nhận thấy hệ III tách với số lượng và các vết rõ ràng nhất.

Kết quả sắc ký khai triển với hệ dung môi III của dịch chiết sau khi phun thuốc thử Dragendorff được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.10.

- H - + : Đậm +: IXroỉng tính

Kết quả sắc ký lớp mỏng cho thấy dịch chiết củ bình vôi nghiên cứu có

9 vết, tìrong đó vết V 2 là đậm nhất.

3.6- Chiết xuất alcaỉoỉd toàn phần

Alcaloid trong dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp ngâm lạnh với dung môi cồn 70° đã acid hoá bằng acid tatric 1%.

Dược liệu được tán nhỏ đến độ mịn thích họfp, sau đó thấm ẩm bằng cồn 70° đã được acid hoá, để qua đêm Chuyển lượng dược liệu này vào bình ngấm kiệt và tiến hành chiết với dung môi cồn đã acid hoá ở trên tới kiệt alcaloid (thử bằng thuốc thử Mayer), thu được dịch chiết alcaloid trong cồn, cất thu hồi cồn dưới áp suất giảm thu được dịch chiết đậm đặc Kiềm hoá dịch này bằng Amoniac đặc đến pH 10-11 thu được tủa alcaloid dạng base Chiết alcaloid dạng base bằng dung môi cloroíorm tới kiệt Cất thu hồi dung môi ta được cắn alcaloid toàn phần Quy trình chiết được tóm tắt ở sơ đồ sau (hình 3.11).

Hình 3.11 Sơ đồ chiết xuất aỉcaloỉd toàn phần

- Tiến hành:

+ Cho dịch alcaloid đã chuẩn bị vào với một lượng Silicagel (đã hoạt

+ Rửa giải bằng hệ dung môi CHCI3 : MeOH theo tỉ lệ tăng dần độ

phân cực bằng MeOH, hứng vào ống nghiệm nhỏ, mỗi ống khoảng 2 ml Sau

đó kiểm tra bằng SKLM (dùng 3 hệ dung môi chạy SKLM như ở phần định tính alcaloid bằng SKLM).

+ Dồn dịch rửa giải chứa 1 vết alcaloid có cùng RfVào một cốc nhỏ, bốc hơi dung môi thu được cắn, kết tinh lại nhiều lần trong MeOH thu được 1 chất kết tinh.

- Kê't quả: Phân lập được 1 chất ký hiệu là Pj.

3.7.2 Phân lập alcaỉoid bằng phương pháp điều chỉnh pH

Cắn alcaloid toàn phần ở trên chiết bằng acid HCl 5%, đến pHl tạo tủa alcaloid dạng muối Lọc bằng phễu lọc chân không, lấy tủa riêng, dịch acid riêng.

Tủa alcaloid dạng muối thu được ờ trên sấy nhẹ, hoà trong nước, điều chỉnh tới pH 6 sau đó xuất hiện tủa, lọc qua phễu chân không sẽ thu được tủa

và dịch lọc.

Hoà tan hoàn toàn tủa trong nước, kiểm hoá bằng NH4OH 6N tới

pHlO-11, chiết lấy alcaloid base bằng cloroform Dịch chiết alcaloid trong cloroform

để bốc hơi tự nhiên, thu được tủa sau đó kết tinh nhiều lần trong MeOH thu được 1 chất có tinh thể hình kim không màu, ký hiệu là Tị.

3.8 Nhận dạng các alcaỉoid

Từ củ bình vôi Stephania brachyandra đã phân lập được 2 chất: TjVà Pj

3.8.1 Kiểm tra độ tinh khiết các alcaỉoid

Chất Ti được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM ở 3 hệ dung môi khác nhau:

Hệ II : Cloroform : Methanol: Amoniac [50:9:1]

Hệ III : Toluen : Aceton : Cồn : Amoniac [45:20:3:3]

Chất Pj được kiểm tra ở 3 hệ dung môi I, II, IV:

Hệ IV: N-butanol: Acid acetic: Nước [4:1:5]

Kết quả: Cả 2 chất đều xuất hiện 1 vết ở các hệ dung môi khác nhau, chứng tỏ các chất đã sạch, có thể tiến hành đo phổ.

3.8.2 Nhận dạng các chất Ti và Pi

- Chất Tji dạng tinh thể hình kim , không màu.

- Tan tốt trong C H C I 3 MeOH.

- [ oi ] d =-276° (ethanol)

- SKLM so sánh với L-tetrahydropalmatin;

+ Chất Tj được hoà tan trong MeOH làm dung dịch thử.

+ L-tetrahydropalmatin hoà tan trong MeOH làm dung dịch đối chiếu Chấm lên cùng bản mỏng 3 vết: dung dịch Tị, dung dịch L- tetrahydropalmatin và một vết là dung dịch Ti + L-tetrahydropalmatin.

SKLM được khai triển với 3 hệ dung môi khác nhau:

Hệ II : Cloroform : Methanol: Amoniac [50:9:1]

Hệ III : Toluen : Aceton : Cồn : Amoniac [45:20:3:3]

Sau khi cho bay hết hơi dung môi, phun hiện màu tấm sắc ký bằng thuốc thử Dragendorff.

Kết quả SKLM cho thấy vết Tj luôn có cùng Rf với L-tetrahydropalmatin

và vết chấm chồng luôn là một vết ở 3 hệ dung môi khác nhau (hình 3.12).

- Phổ uv đo trong MeOH cho 201,1 và 282,4nm.

- Phổ IR đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ờ 3607,43; 3393,30; 3200,58; 2930,49; 2836,56; 2800,87; 2750,91; 1611,70; 1514,54; 1459,39; 1283,45; 1262,45; 1081,25 cm *.

- Phổ MS chất Tj có [M+]=355mu tưcíng ứng với công thức phân tử

C 21 H 25 NO 4 Các pic phân mảnh 324 mu=355-31(OCH3) Sự có mặt của picl90

mu (C 11 H 12 O 2 N) đã chứng minh sự tồn tại của vòng A và B cũng như vòng c

và D trong cấu trúc của

Ti-H 3 C 0

-H 3 C 0

B

Phổ khối của Tj phù hợp với phổ khối của L-tetrahydropalmatin trong thư viện phổ là 94%.

- Phổ *H-NMR của Ti cho biết trong phân tử có 25H trong đó có 4 nhóm

0.CH3.

- Phổ ^^C-NMR cho biết trong phân tử Tj có 2 1 C.

Phổ DEPT 90 và DEPT 135 cho thấy trong cấu trúc Ti có 4 nhóm CH 2 ,

5 nhóm CH, 4 nhóm 0 CH 3 , 7C bậc 4.

Số liệu phổ ‘H-NMR và ‘^C-NMR được trình bày ở bảng 3.3

Kết luân: Căn cứ vào SKLM so sánh với chất chuẩn và số liệu các phổ u v ,

IR, MS, NMR 1 chiều và 2 chiều xác định chất Tj là L-tetrahydropalmatin.

- Chất Pj! dạng tinh thể hình kim, màu vàng cam.

- Tan tốt trong C H C I 3 MeOH.

- Phổ uv đo trong MeOH cho ờ 227,4; 267,0; 349,0 và 433,Onm.

- Phổ IR đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở: 3421,85; 2922,21; 2850,83; 1744,49; 1633,99; 1602,06; 1511,58; 1461,01; 1362,55;1274,73; 1109,74; 1019,25; 809,02; 590,80; 468,38 cm *.

- Phổ MS cho pic phân tử [M+l]'^= 353 mu do đó 352 mu tương ứng với công thức phân tử C 2 1 H 2 2 O 4 N , các pic phân mảnh: 321mu =352-3 UOCHg)

và 262 mu =294 - 31(OCH3), pic 191 tưoỉng ứng với phân mảnh CjjHjjNOj Đối chiếu với thư viện phổ cho biết chất Tj phù hợp với Palmatin.

Kết luân: Căn cứ vào phổ uv, IR và phổ MS, chúng tôi dự kiến nhận dạng chất Pi là Palmatin.

Bảng 3.3 Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân của Tj