- Chuẩn bị cột: Nhồi cột bằng Silicagel 60 (MERCK) có cỡ hạt 0,040-0,063 mm. - Chuẩn bị chạy sắc ký:
Cắn alcaloid toàn phần ở phần trên chiết với acid HCl 2% đến pHl, tách riêng tủa, Lấy dịch acid này kiềm hoá bằng N H 4 O H 6 N tới pH 10-11,
chiết lấy alcaloid base bằng CHCI3 tới kiệt. Bốc hơi CHCI3 thu được cắn. Hoà
tan cắn trong CHCI3 thành dịch alcaloid đậm đặc. - Tiến hành:
+ Cho dịch alcaloid đã chuẩn bị vào với một lượng Silicagel (đã hoạt hoá ở1 1 0°c/lh) vừa đủ rồi đưa hỗn hợp này lên cột.
+ Rửa giải bằng hệ dung môi CHCI3 : MeOH theo tỉ lệ tăng dần độ
phân cực bằng MeOH, hứng vào ống nghiệm nhỏ, mỗi ống khoảng 2 ml. Sau đó kiểm tra bằng SKLM (dùng 3 hệ dung môi chạy SKLM như ở phần định tính alcaloid bằng SKLM).
+ Dồn dịch rửa giải chứa 1 vết alcaloid có cùng RfVào một cốc nhỏ, bốc hơi dung môi thu được cắn, kết tinh lại nhiều lần trong MeOH thu được 1 chất kết tinh.
- Kê't quả: Phân lập được 1 chất ký hiệu là Pj.
3.7.2. Phân lập alcaỉoid bằng phương pháp điều chỉnh pH
Cắn alcaloid toàn phần ở trên chiết bằng acid HCl 5%, đến pHl tạo tủa alcaloid dạng muối. Lọc bằng phễu lọc chân không, lấy tủa riêng, dịch acid riêng.
Tủa alcaloid dạng muối thu được ờ trên sấy nhẹ, hoà trong nước, điều chỉnh tới pH6 sau đó xuất hiện tủa, lọc qua phễu chân không sẽ thu được tủa và dịch lọc.
Hoà tan hoàn toàn tủa trong nước, kiểm hoá bằng NH4OH 6N tới pHlO-
11, chiết lấy alcaloid base bằng cloroform. Dịch chiết alcaloid trong cloroform để bốc hơi tự nhiên, thu được tủa sau đó kết tinh nhiều lần trong MeOH thu được 1 chất có tinh thể hình kim không màu, ký hiệu là Tị.
3.8. Nhận dạng các alcaỉoid
Từ củ bình vôi Stephania brachyandra đã phân lập được 2 chất: TjVà Pj
3.8.1. Kiểm tra độ tinh khiết các alcaỉoid
Chất Ti được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM ở 3 hệ dung môi khác nhau:
H ệl : Cloroform: Methanol [9:1] Hệ II : Cloroform : Methanol: Amoniac [50:9:1] Hệ III : Toluen : Aceton : Cồn : Amoniac [45:20:3:3] Chất Pj được kiểm tra ở 3 hệ dung môi I, II, IV:
Hệ IV: N-butanol: Acid acetic: Nước [4:1:5]
Kết quả: Cả 2 chất đều xuất hiện 1 vết ở các hệ dung môi khác nhau, chứng tỏ các chất đã sạch, có thể tiến hành đo phổ.
3.8.2. Nhận dạng các chất Ti và Pi
3.8.2.1. Nhận dạng chất Tj
- Chất Tji dạng tinh thể hình kim , không màu. - Tan tốt trong C H C I 3 MeOH.
- SKLM so sánh với L-tetrahydropalmatin;
+ Chất Tj được hoà tan trong MeOH làm dung dịch thử.
+ L-tetrahydropalmatin hoà tan trong MeOH làm dung dịch đối chiếu. Chấm lên cùng bản mỏng 3 vết: dung dịch Tị, dung dịch L- tetrahydropalmatin và một vết là dung dịch Ti + L-tetrahydropalmatin.
SKLM được khai triển với 3 hệ dung môi khác nhau: H ệ l : Cloroform: Methanol [9:1] Hệ II : Cloroform : Methanol: Amoniac [50:9:1] Hệ III : Toluen : Aceton : Cồn : Amoniac [45:20:3:3]
Sau khi cho bay hết hơi dung môi, phun hiện màu tấm sắc ký bằng thuốc thử Dragendorff.
Kết quả SKLM cho thấy vết Tj luôn có cùng Rf với L-tetrahydropalmatin và vết chấm chồng luôn là một vết ở 3 hệ dung môi khác nhau (hình 3.12). - Phổ uv đo trong MeOH cho 201,1 và 282,4nm.
- Phổ IR đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ờ 3607,43; 3393,30; 3200,58; 2930,49; 2836,56; 2800,87; 2750,91; 1611,70; 1514,54; 1459,39; 1283,45; 1262,45; 1081,25 cm *.
- Phổ MS chất Tj có [M+]=355mu tưcíng ứng với công thức phân tử C21H25NO4. Các pic phân mảnh 324 mu=355-31(OCH3). Sự có mặt của picl90 mu (C11H12O2N) đã chứng minh sự tồn tại của vòng A và B cũng như vòng c và D trong cấu trúc của Ti-
H3C0- H3C0
Phổ khối của Tj phù hợp với phổ khối của L-tetrahydropalmatin trong thư viện phổ là 94%.
- Phổ *H-NMR của Ti cho biết trong phân tử có 25H trong đó có 4 nhóm
0.CH3.
- Phổ ^^C-NMR cho biết trong phân tử Tj có 21C.
Phổ DEPT 90 và DEPT 135 cho thấy trong cấu trúc Ti có 4 nhóm CH2, 5 nhóm CH, 4 nhóm 0 CH3, 7C bậc 4.
Số liệu phổ ‘H-NMR và ‘^C-NMR được trình bày ở bảng 3.3
Kết luân: Căn cứ vào SKLM so sánh với chất chuẩn và số liệu các phổ u v , IR, MS, NMR 1 chiều và 2 chiều xác định chất Tj là L-tetrahydropalmatin.
H3C0— ^ 5 \4a 0 H3C0 — 2 n b 7|^ H' — 0 CH3 L-Tetrahydropalmatin 3.8.2.2. Nhận dạng chất Pj
- Chất Pj! dạng tinh thể hình kim, màu vàng cam. - Tan tốt trong C H C I 3 MeOH.
- Phổ uv đo trong MeOH cho ờ 227,4; 267,0; 349,0 và 433,Onm.
- Phổ IR đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ở: 3421,85; 2922,21; 2850,83; 1744,49; 1633,99; 1602,06; 1511,58; 1461,01;
- Phổ MS cho pic phân tử [M+l]'^= 353 mu do đó 352 mu tương ứng với công thức phân tử C 2 1 H 2 2 O 4 N , các pic phân mảnh: 321mu =352-3 UOCHg) và 262 mu =294 - 31(OCH3), pic 191 tưoỉng ứng với phân mảnh CjjHjjNOj. Đối chiếu với thư viện phổ cho biết chất Tj phù hợp với Palmatin.
Kết luân: Căn cứ vào phổ uv, IR và phổ MS, chúng tôi dự kiến nhận dạng chất Pi là Palmatin. H3C0 H3C0- A B + + Palmatin
Bảng 3.3 Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân của Tj Vị trí c ‘^C-NMR ôppm ‘H-NMR ỗppm J(Hz) 1-C H 108,70 6,73(s) 2 - C Vị trí c - 3 - C 147,54 - 4-C H 111,42 6,62(s) 4 a - c 126,83 - 5 -CH2 29,11 3,12(m) - 2,67(m) 6 -CH2 51,53 214-3,21(m) 8 -CH2 54,01 3,5(d) J=15,04; 2(d) J=15,0 Hz 8a - c 128,68 - 9 - C 145,11 - 1 0-C 151,29 - 11-CH 111,02 6,80(d) J=8,5 Hz 12-CH 123,87 6,8 8(d) J=8,5 Hz 1 2a - c 127,77 - I3-C H2 36,32 2,83(dd)J=ll,5 Hz ; 15,6 3,26(dd) J=4,0 Hz ; 15,6 13a-CH 59,34 3,54 1 3b - c 129,74 - 2 - O C H 3 56,11 3,89 3 - O C H 3 55,90 3,86 9 - O C H 3 60,12 3,87 10 - 0 CH3 55,87 3,86
f c
T c T+C T c T+C c T C+T
Hệ I Hệ II Hệ m
Hình 3.12 Sắc ký đồ so sánh chất Ti với L<tetrahydropalmatin chuẩn
TrchấtTi
C: L-tetrahydropalmatin chuẩn T+C: vết chấm chồng chất T và c
3.9. Khảo sát sơ bộ khả năng nhân giống
3.9.1. Nhân giống bằng củ nguyên vẹn
Củ loài Stephanỉa brachyandra Diels mang từ Sa Pa về trồng và theo dõi tại Hà Nội, kết quả cho thấy củ phát triển khá nhanh và dễ dàng, nhất là vào cuối xuân đầu hạ. Mẫu nghiên cứu hiện tại phát triển rất tốt, đã ra hoa, cần tiếp tục theo dõi.
3.9.2. Nhân giống bằng hạt
Thu hái quả chín của loài này, tách bỏ thịt quả, đãi sạch và xử lý hạt trước khi gieo. Kết quả:
Gieo ngay sau khi thu hái: Trung bình sau 20 ngày nảy mầm. Tỷ lệ nảy mầm khá cao, đạt tới 89%.
Bảo quản hạt ở nơi khô ráo, thoáng mát trong 3 tháng rồi đem gieo: trung bình sau 22 ngày nảy mầm. Tỷ lệ nảy mầm đạt 87%.
Hạt sau khi nảy mầm phát triển khá tốt và dễ dàng.
Nhận xét: Qua khảo sát theo dõi 2 phương pháp nhân giống, chúng tồi sơ bộ rút ra nhận xét sau:
- Nhân giống bằng hạt là phương pháp hiệu quả, có thể nhân giống trong thời gian ngắn. Có thể bảo quản hạt trong vài tháng rồi đem gieo mà tỷ lệ nảy mầm vẫn cao. Do đó có thể áp dụng trong sản xuất tạo ra giống phục vụ cho trồng trọt.
- Việc nhân giống bằng củ có thể áp dụng để giữ giống, đồng thời tận dụng những củ nhỏ.
Hình 3.13 Hạt mới nảy mầm Hình 3.14 Hạt sau nảy mầm 3 ngày
Hình 3.15 Cây bình vôi non trồng từ hạt
PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
4.1. Kết luận
Sau thời gian làm khoá luận tốt nghiệp về cây bình vôi thu hái tại Sa Pa chúng tôi đã thu được một số kết quả:
- Về thực vật:
+ Đã thu hái mẫu cây có hoa, quả, hạt, mô tả đặc điểm thực vật, đặc biệt lần đầu tiên mô tả chi tiết cấu tạo hoa đực và hoa cái loài bình vôi nghiên cứu. Đối chiếu với các tài liệu phân loại chúng tôi đã thẩm định lại tên khoa
học là: Stephania brachyandraDieỉs, Menispermaceae.
+ Đã xác định đặc điểm vi phẫu cuống lá, thân và đặc điểm bột dược liệu, góp phần tiêu chuẩn hoá dựơc liệu.
- Về hoá học:
+ Đã định tính xác định trong củ loài Stephania brachyandra Diels ở Sa Pa có alcaloid, anthranoid, tinh bột, đường khử tự do, acid hữu cơ trong đó alcaloid là thành phần chính.
+ Bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi Toluen: Aceton: Cồn: Amoniac [45:20:3:3] đã phát hiện có 9 vết hiện màu với thuốc thử Dragendorff.
+ Đã chiết xuất và phân lập đựơc 2 alcaloid từ củ, ký hiệu là TiVà Pj. Dựa vào số liệu phổ u v , IR, MS, phổ NMR 1 chiều và 2 chiều nhận dạng chất
- v ề khảo sát nhân giống
Bước đầu khảo sát khả năng nhân giống loài bình vôi đang nghiên cứu bằng phương pháp gieo hạt và nhân giống từ củ, sơ bộ đánh giá khả năng nhân giống từ hạt tốt hơn.
4.2. Đề xuất
- Tiếp tục nghiên cứu, chiết xuất, phân lập các alcaloid trong củ bình vôi.
- Tiếp tục theo dõi sự phát triển của cây bình vôi do gieo trồng từ hạt để giữ giống và đưa vào phục vụ sản xuất vì đây là loài bình vôi có hàm lượng L- tetrahydropalmatin rất cao so với các loài khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
❖ Tài liệu tiếng Việt.
1. Nguyên Thị Hoài Anh (1999), Luận văn cao học, Viện Hoá học.
2. Nguyễn Tiến Bân (1997), cẩm nang nhận biết các họ thực vật hạt kín ở Việt nam, Nxb Nông nghiệp, tr.10,15.
3. Bộ môn Dược học cổ truyền (Đại học Dược Hà Nội) (1998), Dược học cổ truyền, tr. 8 8.
4. Bộ môn Dược liệu (Đại học Dược Hà Nội ) (2002), Bài giảng Dược liệu,
Nxb Y học, Tập 2.
5. Bộ môn Dược liệu (Đại học Dược Hà Nội ) (1999), Thực tập dược liệu- Phẩn hoá học, Trung tâm thông tin trường Đại học Dược Hà Nội
6. Bộ môn Thực vật Dược (Đại học Dược Hà Nội) (1997), Thực vật Dược- Phân loại thực vật, Nxb Y học.
7. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, Nxb Y học, tr. 302,321.
8. Bộ Y tế (1972), Dược liệu Việt Nam, Nxb Y học, tr. 43-45.
9. Nguyễn Chiều, Ngô Trại (1986), '‘^Nghiên cứu cây bình vôi ở Việt Nanỉ\
Tạp chí Dược học, Số 4, tr. 10-12.
10. Nguyễn Chiều, Nguyễn Tiến Vững (2002), “Phát hiện loài bình vôi Stephanỉa viridiflavens H.s. Lo et M.Yang ở Sơn Là’\ Tạp chí Dược học, SỐ 2, tr. 9-10.
11. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học, tr. 95-97, 326-327, 385-386, 388-389, 895-896,1439.
12. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, Nxb Y học.
13. Lê Trần Đức ( 1 9 9 7Cây thuốc Việt Nam: trồng hái, chế biến , trị bệnh ban đầu, Nxb Nông nghiệp.
14. Vũ Xuân Giang (2003), Nghiên cứu loài Stephania viridiỷlavens HS.Lo et M.Yang thu hái ở Sơn La, Luận văn thạc sỹ Dược học.
15. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, tr. 336-338.
16. Nguyễn Quốc Huy ( 2 0 0 1Nghiên cứu loài Stephania dielsiana Y.C.Wu thu hái ở Hà Tây, Luận văn thạc sỹ Dược học.
17. Trần Công Khánh (1981j, Thực tập hình thái giải phẫu thực vật, Nxb Đại học và trung học chuyên nghiệp.
18. Đỗ Phưofng Loan (2004), Nghiên cứu về đặc điểm thực vật và thành phần hoá học loài bình vôi thu hái tại Sa Pa (Stephania brachyandra Dieỉs), Khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ.
19. Đỗ Tất Lọi (1999), Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Tr. 241-242,512-514, 779-782.
20. Hồ Viết Quý (2002), Chiết tách, Phân lập, xác định các chất bằng dung môi hữu cơ: từ lý thuyết đến thực hành, Nxb KHKT.
21. Sách đỏ Việt Nam (1996), Nxb KH và KT, tr 258-264.
22. Văn Thị Sáu (1981), “Bước đầu nghiên cứu một loài bình vôi mới ở Nghĩa Bình"’, tạp chí Dược học, Số 4, tr. 10-11.
23. Ngô Thị Tâm (1991), “ơớp phần nghiên cứu thuốc an thần từ củ bình vôi Việt Nanỉ\ Tạp chí Dược học, Số 6, tr. 18,20.
24. Ngô Thị Tâm (1998), ’’''Nghiên cứu phát hiện chất Cepharanthin có trong củ bình vôi Việt Nam”, Tạp chí Dựơc học, Số 5, tr. 13.
25. Ngô Vân Thu (1964), ‘'^Nghiên cứu một alcaloid mới chiết từ củ bình
vôi”, Tập san hoá học, Số 10, tr. 1-6.
26. Từ điển bách khoa dược học (1999), Nxb Từ điển bách khoa, tr. 77. 27. Viện Dược liệu ( 2 0 0 4Cây thuốc và động vật làm thuốc à Việt Nam , Tậpl,NxbKHvàKT.
28. Viện Dược liệu (1986), Công trình nghiên cứu khoa học Viện Dược liệu (1972-1986), Nxb Y học, tr. 47-57
29. Viện Dược liệu (1971), Danh lục cây thuốc miền bắc Việt Nam 1964- 1969, Nxb Y học, tr. 27.
30. Viện Dược liệu (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, Nxb KH và KT, tr. 83-91.
31. Nguyễn Tiến Vững (2000j, Nghiên cứu về thực vật, hoá học và tác dụng sinh hoc của một số loài thuộc chi Stephania Lour. ở Việt Nam, Luận án tiến sỹ Dược học.
32. Nguyễn Tiến Vững, Bùi Kim Liên, Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn ơiiều (1999), ‘‘‘‘Phát hiện cây Bình vôi mới ở Lạng Sơn”, Tạp chí Dược học , Số 9, tr. 8- 9.
❖ Tài liệu tiếng nước ngoài.
33.http://flora.huh.harvard.edu/china/mss/volume07/Menisĩ>ermaceae- K edited.htm
34.http://flora of china.im.ac.cn/mss/volume07/Menispermaceae- K edited.htm
200.0 220.0 240.0 260.0 280.0 300.0 320.0 340.0 360.0 380.0 400.0 420.0 440.0 460.0 480.0 500.0
Mau T I nm
HHCTNl.UVD: Mau T I
Date: 05/18/07 Time: 17:56:01
Type: Dispersive User: GBC Instrument - 2855
Abscissa: nm Ordinate: Abs Slit: 2.0 Min: 199.63 Max: 500.00 Range: nm Ndp: 705 Data Interval: 0.42667
Analysis Name: T l. d
Method: DoMS_01.m
:>ample Name: T1
Analysis Info: MAU LC-MS Thao-8/05
Instrument: Agilent 6310 Ion Trap
Operator: NAM_DANG
INSTTTUTE OF NATURAL PRODUCTS CHEMISTRY
Print Date: 5/8/2007 1;46;42 PM
Acq. Date: 5/8/2007 1:38:10 PM
tntens.
Analysis Name: Tl.d
Method: DoMS_01.m
Sample Name: T1
Analysis Info: MAU LC-MS Thao-8/05
Instrument: Agilent 6310 Ion Trap
Operator: NAM_DANG
INSTTTUTE OF NATURAL PRODUCTS CHEMISTRY
Print Date: 5/18/2007 10:22:04 AM
Acq. Date: 5/8/2007 1:38:10 PM
Irtens.
Analysis Name: Tl.d
Method: DoMS_01.m
Instrument: Operator:
Agilent 6310 Ion Trap NAM_DANG Print Date: 5/18/2007 10:34:31 AM Acq. Date: 5/8/2007 1:38:10 PM Sample Name: Analysis Info: T1 MAU LC-MS Thao-8/05
Intens. Xl08 Mass List: # m/z Res. FWHM I 1% S/N 1 208.7 518751 0.2 13.2 2 323.9 911572 0.4 23.2 3 328.0 9216223 4.3 234.6 4 329.0 2314726 1.1 58.9 5 329.9 1115224 0.5 28.4 6 330.9 909091 0.4 23.1 7 335.9 715778 0.3 18.2 8 338.0 7619197 3.6 194.0 9 339.0 1548055 0.7 39.4 10 340.0 2508763 1.2 63.9
# m/z Res. FWHM I I«/o S/N 11 341.0 615543 0.3 15.7 12 342.0 85260616 40.1 2170.6 13 343.0 16394452 7.7 417.4 14 344.0 2365594 1.1 60.2 15 352.0 12787005 6.0 325.5