3.4.1. Định tính alcaloỉd
Lấy 5 g bột dược liệu cho vào bình nón có dung tích 200-250 ml thấm ẩm dược liệu bằng dung dịch amoniac 6N, trộn cho thấm đều, để yên 30 phút, cho vào bình nón 50 ml cloroform. Lắc 5-10 phút, rồi để yên Igiờ. Dịch chiết cloroform lọc qua giấy lọc không gấp nếp. Lấy 30 ml dịch lọc cho vào bình gạn, thêm 5 ml H2SO4 10% lắc 2-3 phút, gạn lấy phần acid để làm phản ứng. Cho vào bốn ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết, rồi thêm vào từng ống một loại thuốc thử và thấy kết quả như sau:
- ống 1: nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer : có tủa trắng. - ống 2: nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Dragendorff : có tủa da cam. - ống 3: nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat : có tủa nâu. - ống 4: nhỏ 2 - 3 giọt acid Rcric : có tủa màu vàng.
3.4.2. Định tính Flavonoid
Lấy 5 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml cồn 90°c. Lắc đều rồi để qua đêm. Lọc và cô cách thuỷ dung dịch lọc còn lại khoảng 10 ml. Dịch này để thử các phản ứng định tính sau:
- Phản ứng Cyanidin: Cho 2 ml dịch chiết vào 1 ống nghiệm, thêm một ít bột Magie kim loại. Sau đó cho thêm vài giọt HCl đặc. Để yên một vài phút quan sát không thấy dung dịch chuyển màu từ vàng sang đỏ (phản ứng âm tính).
- Phản ứng với kiềm: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, hơ khô rồi để yên trên miệng lọ có chứa amoniac đặc không thấy màu vàng của dịch chiết được tăng lên (phản ứng âm tính).
- Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết dược liệu, thêm vài giọt NaOH
1 0%, không thấy xuất hiện tủa màu vàng (phản ứng âm tính).
- Phản ứng với FeClji Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeClj 5% không thấy xuất hiện màu xanh đen (phản ứng âm tính).
Nhận xét Dược liệu không có flavonoid.
3.4.3. Định tính anthranoid
- Định tính antranoid: Qio 2g bột dược liệu vào bình nón 100 ml, thêm 15 ml dung dịch acid H2SO4 10%. Đun cách thuỷ 15 phút. Lọc, chuyển dịch lọc vào bình gạn, lắc với 5-7 ml ether ethylic trong 1-2 phút. Để yên cho tách thành hai lớp, loại bỏ phần nước. Cho vào phần ether 5 ml dung dịch NaOH 10%. Lắc lên thấy xuất hiện màu đỏ sim trong dung dịch kiềm (phản ứng dưcTQg tính).
- Vi thăng hoa: Cho vào ống trong nút chai bằng nhôm 1 ít bột dược liệu. Đậy nút bằng một phiến kính, trên đó có một ít bông thấm nước. Đun
dưới nút chai bằng đèn cồn qua lưới amiăng, lấy ra để nguội quan sát dưới kính hiển vi có tinh thể hình kim (phản ứng dương tính),
Nhận xét Dược liệu có antranoid.
3.4.4. Định tính coumarin
Lấy 5 g bột dược liệu cho vào cốc, thêm 50 ml cồn 90°, đun cách thuỷ trong khoảng 3-5 phút. Lọc nóng qua giấy lọc. Dịch chiết thu được làm các phản ứng sau:
- Phản ứng mở đóng vòng lacton: Cho vào ống nghiệm nhỏ mỗi ống nghiệm 1 ml dịch chiết, ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên. Sau đó đun cả hai ống nghiệm đến sôi và để nguội quan sát. cả 2 ống nghiệm đều trong. Sau khi để nguội cho thêm vào mỗi ống 2 ml nước cất quan sát thấy cả 2 ống nghiệm đều trong (phản ứng âm tính).
- Phản ứng diazo hoá: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thuỷ đến sôi và để nguội. Thêm vài giọt thuốc thử diazo (mới pha) không thấy xuất hiện màu đỏ gạch (phản ứng âm tính).
Nhận xét'. Dược liệu không chứa coumarin.
3.4.5. Định tính glycosid tim
Lấy 2 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm, thêm 10 ml cồn 90°. Đun cách thuỷ sôi trong vài phút, lọc qua giấy lọc, dịch lọc được dùng để làm phản ứng định tính.
- Phản ứng Liebermann: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn, bốc hơi cách thuỷ đến khô để nguội. Thêm 0,5 ml anhydrid acetic, lắc mạnh, sau đó thêm từ từ 0,5 ml H2SO4 đậm đặc (sử dụng pipet đã sấy khô) theo thành ống nghiệm. Không thấy màu tím đỏ xuất hiện ở mặt tiếp xúc hai chất lỏng (phản ứng âm tính).
- Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm 0,5 ml thuốc thử mới pha (gồm 0,5 ml dung dịch NaOH 10% và 9,5 ml dung dịch acid Picric trong nước) khồng thấy xuất hiện màu đỏ cam (phản ứng âm tính).
- Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 5 giọt dung dịch Natri Nitropprusiat 1% và vài giọt dung dịch NaOH 10%, không có màu đỏ xuất hiện (phản ứng âm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có glycosid tim.
3.4.6. Định tính saponin
Lấy 2g bột dược liệu, cho vào bình nón 100 ml, thêm 20 ml nước cất, đun sôi nhẹ, lọc. Dịch lọc cho vào một ống nghiệm và lắc ống nghiệm 5 phút dọc theo chiều dọc để yên 15 phút, quan sát hiện tượng tạo bọt. Bọt tan sau 5 phút.
Nhận xét Dược liệu không có saponin.
3.4.7. Định tính tanin
Lấy Ig dược liệu cho vào cốc 100 ml, cho vào đó 15 ml H2O, đun cách thuỷ trong 15 phút. Lọc dịch chiết qua giấy lọc thu được dung dịch dùng để định tính các phản ứng sau:
- Phản ứng với FeClj 5%: Cho 1 ml dịch lọc ở trên vào ống nghiệm, thêm vài giọt FeClj 5%, không thấy xuất hiện màu xanh đen (phản ứng âm tính).
- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Cho 1 ml dịch lọc ở trên vào một ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch gelatin 1%. Quan sát không thấy xuất hiện tủa bông (phản ứng âm tính).
3.4.8. Định tính tinh bột
Nhỏ 1-2 giọt nước cất lên phiến kính nhỏ. Dùng mũi mác lấy một ít dược liệu để vào giọt nước và nghiền đều. Đậy lam kính lên trên, rồi nhỏ 1-2 giọt dung dịch lod-Iodid loãng nhỏ vào cạnh lam kính, dung dịch lod-Iodid thấm vào trong (hiện tượng mao dẫn). Soi kính hiển vi thấy các hạt tinh bột bị nhuộm màu xanh.
Nhận xét Dược liệu có tinh bột.
3.4.9. Định tính đường khử tự do
Lấy Ig bột dược liệu cho vào ống nghiệm 20 ml. Thêm vào đó 10 ml nước cất, đun cách thuỷ 3 - 5 phút. Lọc nóng, lấy dịch lọc thử phản ứng sau:
- Cho 2 ml dịch lọc vào một ống nghiệm thêm vào đó 0,5 ml thuốc thử Fehling A và 0,5 ml thuốc thử Fehling B. Đun sôi cách thuỷ vài phút thấy xuất hiện tủa đỏ gạch (phản ứng dưcfng tính).
Nhận xét Dược liệu có đường khử.
3.4.10. Định tính acid hữu cơ
Cho khoảng 2g bột dựoc liệu vào ống nghiệm to, thêm 5ml nước cất, đun sôl trực tiếp trong 10 phút, để nguội, lọc. Lấy dịch lọc cho thêm ít tinh thể NajCOg, quan sát thấy có bọt khí bay lên (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Dược liệu có acid hữu cơ.
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong củ loài bình vôi thu hái ở Sa Pa được tóm tắt ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong củ 11 Tên nhóm
chất
Phản ứng Kết quả Kết luận sơ bọ
1 Alcaloid Tạo tủa với thuốc thử chung 'l'r Mayer TT Dragendorff '1'1' Bouchardat rr Acid picric ++++ ++++ ++++ ++++ Có 2 Flavonoid Phản ứng cyanidin Phản ứng vói kiềm
Phản ứng với dung dich FeCl3 - Không 3 Coumarin Phản ứng mở đóng vòng lacton Phản ứng diazo hoá - Không 4 Antranoid Phản ứng Borntraeger Vi thăng hoa ++ ++ Có
5 Glycosid tim Phản ứng Liebermann -
Phản ứng Balgie - Không
Phản ứng Legal -
6 Saponin Hiện tượng tạo bọt - Không 7 Tanin Phản ứng với FeClj
Phản ứng với dung dịch gelatin 1%
Không
8 Tinh bột Phản ứng với lod - lodid ++ Có 9 Đường khử
tự do
Phản ứng vói thuốc thử
Fehling A và Fehling B ++ Có
Ghi chú:
+ : Phản ứng dương tính. ++ : Phản ứng lên khá rõ. +++ : Phản ứng lên rõ. ++++ : Phản ứng lên rất rõ.
Kết luận'.
Trong củ cây bình vôi nghiến cứu {Stephania brachyandra Diels) chứa alcaloid, anthranoid, tinh bột, đường khử tự do, acid hữu cơ. Trong đó alcaloid là thành phẩn chính.
3.5. Định tính alcaloid bằng SKLM
- Qiuẩn bị bản mỏng:
Sử dụng bản mỏng Silicagen G F 2 5 4 đã tráng sẵn của Merck, hoạt hoá ở
1 1 0® c/lh, để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm. - Chuẩn bị dịch chấm sắc ký:
Lấy Ig bột dược liệu cần nghiên cứu chiết như phần định tính rồi cô cách thuỷ đến khô, cắn còn lại để nguội, hoà tan trong methanol. Dịch chiết này để chấm sắc ký.
- Tiến hành:
Chấm dịch chiết dược liệu đã chuẩn bị ở trên lên một bản mỏng đã hoạt hoá, sau đó triển khai bằng 3 hệ dung môi sau:
Hệ I : Cloroform: Methanol [9:1] Hệ II : Cloroform : Methanol: Amoniac [50:9:1] Hệ III : Toluen : Aceton : Cồn : Amoniac [45:20:3:3]
Phun hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff. So sánh sau nhiều lần khai triển sắc ký với 3 hệ dung môi trên chúng tôi nhận thấy hệ III tách với số lượng và các vết rõ ràng nhất.
Kết quả sắc ký khai triển với hệ dung môi III của dịch chiết sau khi phun thuốc thử Dragendorff được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.10.
Bảng 3.2 Kết quả định tính alcaloid bằng sắc ký lổp inỏng(với hệ dung môi in)
Vêt Rf Độ đậm Vi 0,776 ++ V2 0,737 ++++ V3 0,553 +++ V4 0,487 + V5 0,434 ++ V6 0,342 +++ V7 0,289 ++ Vg 0,039 + V9 0,026 -1- Hình 3.10 Sắc ký đồ định tính alcaloid Chú thích: ++++: Rất đậm Đậm vừa - H - + : Đậm +: IXroỉng tính
Kết quả sắc ký lớp mỏng cho thấy dịch chiết củ bình vôi nghiên cứu có 9 vết, tìrong đó vết V2 là đậm nhất.
3.6- Chiết xuất alcaỉoỉd toàn phần
Alcaloid trong dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp ngâm lạnh với dung môi cồn 70° đã acid hoá bằng acid tatric 1%.
Dược liệu được tán nhỏ đến độ mịn thích họfp, sau đó thấm ẩm bằng cồn 70° đã được acid hoá, để qua đêm. Chuyển lượng dược liệu này vào bình ngấm kiệt và tiến hành chiết với dung môi cồn đã acid hoá ở trên tới kiệt alcaloid (thử bằng thuốc thử Mayer), thu được dịch chiết alcaloid trong cồn, cất thu hồi cồn dưới áp suất giảm thu được dịch chiết đậm đặc. Kiềm hoá dịch này bằng Amoniac đặc đến pH 10-11 thu được tủa alcaloid dạng base. Chiết alcaloid dạng base bằng dung môi cloroíorm tới kiệt. Cất thu hồi dung môi ta được cắn alcaloid toàn phần. Quy trình chiết được tóm tắt ở sơ đồ sau (hình 3.11).
3.7. Phân lập aỉcaỉoỉd
3.7.1. Phân lập alcaloid bằng sắc ký cột
- Chuẩn bị cột: Nhồi cột bằng Silicagel 60 (MERCK) có cỡ hạt 0,040-0,063 mm. - Chuẩn bị chạy sắc ký:
Cắn alcaloid toàn phần ở phần trên chiết với acid HCl 2% đến pHl, tách riêng tủa, Lấy dịch acid này kiềm hoá bằng N H 4 O H 6 N tới pH 10-11,
chiết lấy alcaloid base bằng CHCI3 tới kiệt. Bốc hơi CHCI3 thu được cắn. Hoà
tan cắn trong CHCI3 thành dịch alcaloid đậm đặc. - Tiến hành:
+ Cho dịch alcaloid đã chuẩn bị vào với một lượng Silicagel (đã hoạt hoá ở1 1 0°c/lh) vừa đủ rồi đưa hỗn hợp này lên cột.
+ Rửa giải bằng hệ dung môi CHCI3 : MeOH theo tỉ lệ tăng dần độ
phân cực bằng MeOH, hứng vào ống nghiệm nhỏ, mỗi ống khoảng 2 ml. Sau đó kiểm tra bằng SKLM (dùng 3 hệ dung môi chạy SKLM như ở phần định tính alcaloid bằng SKLM).
+ Dồn dịch rửa giải chứa 1 vết alcaloid có cùng RfVào một cốc nhỏ, bốc hơi dung môi thu được cắn, kết tinh lại nhiều lần trong MeOH thu được 1 chất kết tinh.
- Kê't quả: Phân lập được 1 chất ký hiệu là Pj.
3.7.2. Phân lập alcaỉoid bằng phương pháp điều chỉnh pH
Cắn alcaloid toàn phần ở trên chiết bằng acid HCl 5%, đến pHl tạo tủa alcaloid dạng muối. Lọc bằng phễu lọc chân không, lấy tủa riêng, dịch acid riêng.
Tủa alcaloid dạng muối thu được ờ trên sấy nhẹ, hoà trong nước, điều chỉnh tới pH6 sau đó xuất hiện tủa, lọc qua phễu chân không sẽ thu được tủa và dịch lọc.
Hoà tan hoàn toàn tủa trong nước, kiểm hoá bằng NH4OH 6N tới pHlO-
11, chiết lấy alcaloid base bằng cloroform. Dịch chiết alcaloid trong cloroform để bốc hơi tự nhiên, thu được tủa sau đó kết tinh nhiều lần trong MeOH thu được 1 chất có tinh thể hình kim không màu, ký hiệu là Tị.
3.8. Nhận dạng các alcaỉoid
Từ củ bình vôi Stephania brachyandra đã phân lập được 2 chất: TjVà Pj
3.8.1. Kiểm tra độ tinh khiết các alcaỉoid
Chất Ti được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM ở 3 hệ dung môi khác nhau:
H ệl : Cloroform: Methanol [9:1] Hệ II : Cloroform : Methanol: Amoniac [50:9:1] Hệ III : Toluen : Aceton : Cồn : Amoniac [45:20:3:3] Chất Pj được kiểm tra ở 3 hệ dung môi I, II, IV:
Hệ IV: N-butanol: Acid acetic: Nước [4:1:5]
Kết quả: Cả 2 chất đều xuất hiện 1 vết ở các hệ dung môi khác nhau, chứng tỏ các chất đã sạch, có thể tiến hành đo phổ.
3.8.2. Nhận dạng các chất Ti và Pi
3.8.2.1. Nhận dạng chất Tj
- Chất Tji dạng tinh thể hình kim , không màu. - Tan tốt trong C H C I 3 MeOH.
- SKLM so sánh với L-tetrahydropalmatin;
+ Chất Tj được hoà tan trong MeOH làm dung dịch thử.
+ L-tetrahydropalmatin hoà tan trong MeOH làm dung dịch đối chiếu. Chấm lên cùng bản mỏng 3 vết: dung dịch Tị, dung dịch L- tetrahydropalmatin và một vết là dung dịch Ti + L-tetrahydropalmatin.
SKLM được khai triển với 3 hệ dung môi khác nhau: H ệ l : Cloroform: Methanol [9:1] Hệ II : Cloroform : Methanol: Amoniac [50:9:1] Hệ III : Toluen : Aceton : Cồn : Amoniac [45:20:3:3]
Sau khi cho bay hết hơi dung môi, phun hiện màu tấm sắc ký bằng thuốc thử Dragendorff.
Kết quả SKLM cho thấy vết Tj luôn có cùng Rf với L-tetrahydropalmatin và vết chấm chồng luôn là một vết ở 3 hệ dung môi khác nhau (hình 3.12). - Phổ uv đo trong MeOH cho 201,1 và 282,4nm.
- Phổ IR đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh ờ 3607,43; 3393,30; 3200,58; 2930,49; 2836,56; 2800,87; 2750,91; 1611,70; 1514,54; 1459,39; 1283,45; 1262,45; 1081,25 cm *.
- Phổ MS chất Tj có [M+]=355mu tưcíng ứng với công thức phân tử C21H25NO4. Các pic phân mảnh 324 mu=355-31(OCH3). Sự có mặt của picl90 mu (C11H12O2N) đã chứng minh sự tồn tại của vòng A và B cũng như vòng c và D trong cấu trúc của Ti-
H3C0- H3C0
Phổ khối của Tj phù hợp với phổ khối của L-tetrahydropalmatin trong thư viện phổ là 94%.
- Phổ *H-NMR của Ti cho biết trong phân tử có 25H trong đó có 4 nhóm
0.CH3.
- Phổ ^^C-NMR cho biết trong phân tử Tj có 21C.
Phổ DEPT 90 và DEPT 135 cho thấy trong cấu trúc Ti có 4 nhóm CH2, 5 nhóm CH, 4 nhóm 0 CH3, 7C bậc 4.
Số liệu phổ ‘H-NMR và ‘^C-NMR được trình bày ở bảng 3.3
Kết luân: Căn cứ vào SKLM so sánh với chất chuẩn và số liệu các phổ u v , IR, MS, NMR 1 chiều và 2 chiều xác định chất Tj là L-tetrahydropalmatin.
H3C0— ^ 5 \4a 0 H3C0 — 2 n b 7|^ H' — 0 CH3 L-Tetrahydropalmatin 3.8.2.2. Nhận dạng chất Pj
- Chất Pj! dạng tinh thể hình kim, màu vàng cam. - Tan tốt trong C H C I 3 MeOH.
- Phổ uv đo trong MeOH cho ờ 227,4; 267,0; 349,0 và 433,Onm.