Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Nghiên cứu định lượng ciprofloxacin trong chế phẩm và nước tiểu bằng phương pháp cực phổ xung vi phân
Trang 1
BOY TE
TRUONG DAI HOC DUOC HA NOI
NGUYEN THI YEN
NGHIEN CUU DINH LUONG CIPROFLOXACIN TRONG CHE
PHAM VA NUOC TIEU BANG
PHUONG PHAP CUC PHO XUNG VI PHAN
KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2012
Trang 2
BO Y TE
TRUONG DAI HOC DUOC HA NOI
NGUYEN THI YEN
NGHIEN CUU DINH LUONG
CIPROFLOXACIN TRONG CHE
PHAM VA NUOC TIEU BANG
PHUONG PHAP CUC PHO XUNG VI PHAN KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: T.S Vũ Đặng Hồng Nơi thực hiện:
Bộ mơn Hĩa Phân Tích- ĐH Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện: 09.2011 - 05.2012
HÀ NỘI - 2012
Trang 3LOI CAM ON
Lời đầu tiên tơi xin được gửi tới thây giáo - T.S Vũ Đặng Hồng lời
biết ơn chân thành và sâu sắc nhất Trong suốt quá trình tơi thực hiện đề tài,
thây đã trực tiếp hướng dẫn chỉ bảo tận tình về cả lý thuyết cũng như thực hành Với sự giúp đỡ của thây, tơi mới cĩ thê thao tác tốt trên máy cực phơ
cũng như 1 số trang thiết bị khác ,định hướng và từng bước đi sâu nghiên
cứu và hồn thành đề tài
Tơi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cơ Bộ mơn Hĩa Phân tích
- Kiếm Nghiệm Trường Đại Học Dược Hà Nội, các anh chị kỹ thuật viên
đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi về máy mĩc , trang thiết bị, cơ sở vật chất cũng như hĩa chất, dụng cụ trong suốt quá trình tơi thực hiện đề tài Và tơi cũng xin chân thành cảm ơn Ban quản lý và các thầy cơ trường Đại
học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện để tơi học tập, nghiên cứu hồn
thành tốt bản khĩa luận
Cuối cùng tơi xin được cảm ơn những người thân trong gia đình và
bạn bè đã luơn động viên, cơ vũ đề tơi hồn thành tốt khĩa luận của mình
Trang 4DANH MUC CAC BANG : Số Ký hiê thứ y " Tén bang Trang bang tự
01 | Bảng 1l.I | Các phương pháp định lượng ciprofloxacin 10 Kết quả ẩo cực phơ xung vì phân Ciprofloxacin
02 | Bang 3.3 0, ] ppm theo mơ hình thiệt kê nhân tơ tồn phán 22
03 | Bang 3.4 Kiểm tra tính thích hợp của hệ thơng 24 04 | Bảng 3.5 Ket qua Khảo sát khoảng tuyên tính của 24
ciprofloxacin
Kết quả khảo sát giới hạn định lượng dưới trong
05 Bảng 3.ĨC | nước tiểu 26
06 | Bảng 3.6d kế quả đinh lượng Ciprofloxacin trong 4 mau 28 kiêm sốt chát lượng (n = 6)
07 | Bảng 3.6 Độ thu hồi huyệt đổi Ciprofloxacin trong 4 mẫu 28 kiêm sốt chát lượng (n = 6)
08 | Bảng 3.6f | Kết quả tìm lại nước tiêu trong 3 ngày lien tiêp 28 09 | Bang 3.7 Bảng kết quả định lượng các chế phẩm trên thị truong 32
Trang 5DANH MUC CAC HINH: SO thir Ky higu Tên hình tự hình Trang
01 | Hình 1.1 | Tế bào đo trong cực phổ 03
02 Hình 12 Dạng điện áp phân cực trong kỹ thuật xung 05 vi phân
03 Hình 1.3 Dạng tín hiệu đầu ra của kỹ thuật xung vi 06 phân
04 Hình 1.4 | Cơng thức cầu tạo của Ciprofloxacin 07 Duong cong von-ampe vịng của dung dịch
05 Hinh 3.1a | Ciprofloxacin 0,1 ppm trong nén dém vạn 18 nang pH 5,02 (a), 4,1(b), 3,4 (c), 2,5 (d)
Đồ thị sự phụ thuộc vị trí xuất hiện peak
06 Hình 3.Ib trên đường cong von-ampe vong SỐ 19 Ciprofloxacin 0,05 ppm vao pH cua dém
van nang
Cực phơ đồ xung vi phân của dung dịch
0 Hình 3.2a | Ciprofloxacin 0,1 ppm trong nên đệm 20 phosphat pH 3,5
Cực phơ đơ xung vì phân của dung dịch
08 Hinh 3.2b | Ciprofloxacin 0,1 ppm trong nên đệm 20
citrate pH 3,5
Cực phơ đơ xung vi phân của dung dịch
09 Hinh 3.2c | Ciprofloxacin 0,1 ppm 21 trong nén dém acetate pH 3,5
Mặt đáp ứng biêu diễn ảnh hưởng của pH
10 Hình 3.3a và nơng đồ đệm đối với cường do dong do 23 được ( thê tích gĩp — l,l V và thời gian tích
gĩp 50 s)
Mặt đáp ứng biêu diễn ảnh hưởng của pH
11 Hình 3.3b | và nơng độ đệm đối với cường độ dịng do được ( pH 3,6 và nơng độ đệm 0,08M 23
Trang 6Cực phơ đơ xung vì phân của Ciprofloxacin 0,05 + 0,17 ppm 12 ? 25
Hinh 3.5a | trong nén dém acetate pH 3,6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của
13 Hình 3.5b Ciprofloxacin 25 trong dém acetate pH 3,6
Cực pho dé xung vi phan cia Ciprofloxacin
14 | Hinh 3.6a | “ÚI +02 ppm 27
trong nước tiêu
Đồ thị biêu diễn đường chuẩn của
15 | Hình 3.6b | Ciprofloxacin trong nước tiểu 27 16 Hình 3.7a Cực phổ đĩ xung ví phan cua Ciprofloxacin 31
trong ché pham Ciprobay
17 Hình 3.7b Cực phơ do xung vi phan cua Ciprofloxacin 31 trong ché pham Quindrops
18 Hình 3.7c | Cực phổ đồ xung vì phân của Ciprofloxacin 32
Trang 7ĐẶT VẤN ĐỀ L0 Q HT HS HH TH nh che
CHUONG I: TONG QUAN
1.1 Phân tích von —- ampe 1.1.1 Phương pháp cực phố xung vi phân (Differential Pulse Polarography) - HH nh HH ng 1.1.2 Định lượng trong phân tích điện hố 1.2 Ciprofloxacin 1.2.1 Cơng thức cầu tạo 1.2.2 Đặc điểm được lý -. c cv 1.2.2.1 Dạng dùng và hàm lượng 1.2.2.2 Phơ kháng khuân cccc-c c2 ccc s2 1.2.2.3 Dược động học 1.2.2.4 Chỉ định và tác dụng khơng mong muốn 1.2.2.5 Độ ồn định và bảo quản .- 1.2.3 Các phương pháp định lượng Ciprofloxacin
CHƯƠNG 2: DOI TƯỢNG
2.1 Đối tượng — nguyên liệu
Trang 82.2 Phương pháp nghiên cứu - - «5s <<<<s 2.2.1 Nghiên cứu cơ chế phản ứng khử cực ciprofloxacin với cực MIO thủy ngân tr€O - - - c c9 9n ng vn reg
2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng ciprofloxacin bằng phương pháp cực phố xung vi phân trong dung dịch đệm và nước 2.2.3 Ung dụng phương pháp cực phơ xung vi phân đã nêu để định lượng cIprofloxacIn trong các chê phâm và mâu nước tiêu tự 2.2.4 Xử lý kết quả thực nghiệm -. - 2 s2 cz+E£kezczxecee
CHUONG 3:THUC NGHIEM, KET QUÁ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Kết quả thực nghiệm và nhận xét
3.1.1 Chuẩn bị hĩa chất - - c xxx xxx vn 3.1.2 Chuẩn bị mẫu - - - 2 xxx vn re
3.1.3 Nghiên cứu cơ chế phản ứng khử cực ciprofloxacin với điện cực giọt thủy ngân fT€O - << cọ n
3.1.4 Xây dựng phương pháp định lượng Ciprofloxacin bằng phương pháp cực phơ xung vi phân trong dung dịch đệm và nước
3.1.4.1 Tối ưu hĩa điều kiện phân tích - 2 2 +s sscsd 3.1.4.2 Tính thích hợp của hệ thống - -. -
Trang 93.2 Ứng dụng phương pháp cực phố xung vi phân để định lượng Ciprofloxacin trong các chế phẩm và mẫu nước tiểu tự
3.2.1 Xử lý mẫu và chuẩn bị mẫu đo - <<:
Trang 10DAT VAN DE
Quinolon là nhĩm kháng sinh phố rộng thường được chỉ định khi nhiễm vi khuẩn hiếu khí gram âm va gram dương Việc ra đời các quinolon thế hệ mới đã đem lại hy vọng trong việc điều tri các vi khuân nguy hiểm đang cĩ xu hướng ngày càng đề kháng với các kháng sinh quen thuộc
Các quinolon thế hệ 2 hay cịn gọi là fluoroquinolon, đặc trưng bởi việc thêm nguyên tử fluor vào cấu trúc quinolon, được đưa ra thị trường vào khoảng thập niên 1980 Các fluoroquinolon cĩ tác dụng với nhiều chủng vi khuẩn gram âm và cĩ tác dụng tồn thân So với các quinolon thế hệ 1, các
kháng sinh này cĩ khá ít tác dụng phụ, và khắc phục được tình trạng vi
khuẩn nhanh chĩng kháng thuốc Kết quả trên lâm sàng cho thấy các fluoroquinolon cĩ hiệu quả trong điều trị nhiễm trùng tiết niệu và viêm đài
bề thận khơng biến chứng và cĩ biến chứng, bệnh lây qua đường tình dục,
viêm tuyên tiên liệt, nhiêm trùng da và mơ mêm
Hién nay, Ciprofloxacin là một trong những fluoroquinolon đang được sử
dụng khá phơ biến dưới nhiều dạng bào chế khác nhau như viên nén, viên
bao phim, thuốc nhỏ mắt, thuốc tiêm Để định luong ciprofloxacin trong cac dang ché pham nay, duoc điển Việt Nam IV và một số dược điển như
Anh, Mỹ đều quy định dùng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [2, 8, 23]
Với mong muốn đề xuất một phương pháp định lượng Ciprofloxacin cé
khả năng thay thé HPLC trong cơng tác kiếm nghiệm thuốc, đặc biệt tại các
Trang 111.Xây đựng phép định lượng Ciprofloxacin bằng phương pháp cực phơ xung vi phân
2.Ứng dụng phương pháp này để định lượng Ciprofloxacin trong một số dạng chế phẩm hiện đang lưu hành trên thị trường và trong mẫu
Trang 12CHUONG I: TONG QUAN 1.1 PHAN TICH VON - AMPE
Phân tích von - ampe là một nhĩm các kỹ thuật phân tích điện hố nghiên cứu sự phụ thuộc của cường độ dịng điện (I) vào điện thế đặt trên hai điện cực cơng tác và so sánh (E) trong quá trình điện phân chất phân tích Sự phụ thuộc trên được biểu diễn dưới dạng đường cong von - ampe trên hệ trục toạ độ E — I
1.1.1 Phương pháp cực phố xung vi phân (Differential Pulse Polarography)
Trang 13Phuong pháp này được Heyrovsky phát minh vào năm 1920 và cho đến nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, phương pháp này ngày càng được cải tiến Cơ sở của phương pháp này là dựa trên phản ứng điện hố của các chất phân tích trong dung dịch điện li trên điện cực giọt thuỷ ngân theo phản ứng: Ox + ne — kh Trong đĩ: Ox: Dang oxi hoa kh: Dạng khử n: Số e trao đơi Phương trình Ilkovic biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ dịng điện qua mạch cực phố tỷ lệ thuận với nồng độ chất khử cực: lạ=607.n.D'“.m”.t'".C
lạ: Cường độ dịng cực đại giới hạn (uA) n: Số electron tham gia vào phản ứng điện cực
D: Hệ số khuếch tán (cm/s)
m: Tốc độ chảy giọt Hg (mg/s) t: Chu ky giọt của điện cực giọt (s)
C: Nơng độ chất phân tích (mM)
Tuy nhiên do ảnh hưởng của dịng tụ điện nên độ nhạy của phản ứng chỉ đạt
được 10 + 107M Cùng với sự phát triển của khoa học và kỹ thuật, nhiều cải
tiễn đã được áp dụng nhằm loại trừ dịng tụ điện nâng cao tỉ số đo tín hiệu nhiễu Trên cơ sở này, kỹ thuật cực phơ xung vi phân đã được ra đời
Trang 14biên độ thay đổi trong khoảng 10 — 100 mV và độ đài xung cỡ 40 — 100 ms Dịng được đo 2 lần cho 1 giọt thủy ngân (Hình 1.2)
Tại t¡: Ở 17 ms thời điểm trước khi áp xung
Tại tạ: Khoảng 40 ms sau khi đặt xung (trước khi giọt rơi)
Ưu điểm của phương pháp này là cĩ độ nhạy cao (107 M) đối với các hợp chất vơ cơ cũng như hữu cơ, phản ứng thuận nghịch cũng như khơng thuận nghịch Hơn nữa dạng đường cực phơ là dạng peak cĩ cực đại nên sau mỗi lần ghi đường nên lại trở vê vị trí ban đầu nên độ chọn lọc của phương pháp này
Trang 15Hinh 1.3: Dang tin hiệu đầu ra của kỹ thuật xung vì phân
Cùng với sự ra đời của kỹ thuật von - ampe hịa tan hấp phụ (Adsorption Stripping Voltammetry) với điện cực làm việc là cực giọt thủy ngân treo (Hanging Drop Mercury Electrode), kỹ thuật cực phổ xung vi phân ngày càng được sử dụng khá phơ biến trong nghiên cứu định lượng các thuốc [11, 13,
14, 16, 20]
1.1.2 Định lượng trong phân tích điện hố
Về nguyên tắc, việc xác định nồng độ của chất phân tích bằng phương pháp
cực phố xung vi phân cĩ thể tiến hành theo các kỹ thuật: so sánh, đường
chuẩn, thêm chuẩn và thêm đường chuẩn
Trong khĩa luận này, nồng độ của Ciprofloxacin được xác định bằng kỹ thuật đường chuân
Trang 16độ khác nhau, thường dùng 5 - 8 dung dịch chuẩn Đo cường độ dịng điện của từng dung dịch chuẩn và vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa cường độ dịng và nơng độ của các dung dịch chuẩn Xác định vùng tuyến tính là khoảng nồng độ cho đoạn đường chuẩn cĩ hệ số tương quan r > 0,990 Đề hạn chế phải ngoại suy, nồng độ các dung dịch thử phải năm trong khoảng nồng độ của dãy chuân Nơng độ của dung dịch thử được xác định dựa vào phương
trình hồi qui tuyến tính biểu diễn mối quan hệ giữa cường độ dịng và nồng độ
các dung dịch chuẩn 1.2 CIPROFLOXACIN
1.2.1 Cơng thức cấu tao
(3 A
Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo của Ciprofloxacin
- Tên khoa học: Acid 1-cyclopropyl-6-fluoro-l,4-dihydro-4-oxo-7-(1- piperazinyl)-3-quinolein carboxylic monohydroclorid monohydrat
- Cong thurc hoa hoc C;7 Hig FN3 O3
- Khối lượng phân tử: 331,346 - Nhiệt độ nĩng chảy: 318 -320 °C
Trang 171.2.2 Đặc điểm dược lý 1.2.2.1 Dạng dùng và hàm lượng: Dạng đề uống là Ciprofloxacin hydroclorid, dạng tiêm là ciprofloxacin lactat - Viên nén 100 mg, 150 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg - Viên nang 200 mg - Viên đạn 500 mg - Thuốc tiêm 200 mg/100ml, 100 mg/50ml, 100 mg/10ml - Thuốc nhỏ mắt 0,3% 1.2.2.2 Phố kháng khuẩn
Cơ chế kháng khuẩn: ức chế men gyrase, nên thuốc ngăn sự sao chép của chromosom khiến cho vi khuẩn khơng sinh sản được nhanh chĩng [3]
- Ciprofloxacin cĩ phơ kháng khuẩn rất rộng, bao gơm phần lớn các mam bệnh quan trọng Phần lớn các vi khuẩn gram 4m, ké ca Pseudomonas va Enterobacter đều nhạy cảm với thuốc Thuốc nhạy cảm cao với Salmonella,
Shigella, Yersina và Vibrio cholerae, các vi khuẩn gây bệnh đường hơ hấp
như Haemophilus và Legionella, rat nhạy cảm với Neisseria Mycoplasma va Chiamydia chỉ nhạy cảm vừa phải với thuốc
Các vi khuân Gram đương kém nhạy cảm hơn Ciprofloxacin khơng cĩ tác dụng trên phần lớn các vi khuẩn ky khí, khơng cĩ tác dụng chéo với các thuốc khang sinh khac nhu aminoglycosid, cephalosporin, tetracyclin, penicillin 1.2.2.3 Dược động học:
Ciprofloxacin hấp thu nhanh ở đường tiêu hố, ít bị ảnh hưởng bởi thức ăn,
sinh khả dụng tuyệt đối: 50 — 85%
Trang 18Đường tiêm tĩnh mạch: Tiêm truyền tĩnh mạch với liều đơn 200 hoặc 400 mg Ciprofloxacin ở người khoẻ mạnh trong khoảng thời gian t = 1 h, nồng độ cực đại của Ciprofloxacin đạt được ngay khi tiêm truyền xong tương ứng 2,4 và
4,6 mg/L và giảm cịn 0,3 và 0,7 mg/L sau 6 h ké tir khi bat dau tiêm truyền
[7]
- Thời gian bán huỷ: 3 - 5 h - Chuyên hố: qua gan
- Thải trừ: chủ yếu qua thận dưới dạng khơng đổi
Với đường tiêm tĩnh mạch: Khoảng 75 % đào thải qua nước tiểu, 15 % đào thải qua phân
Với đường uống: Khoảng 40 — 50 % liều uống đào thải qua nước tiểu
+ Khi uống liều 250 mg, sau 2 h đầu tiên, nồng độ Ciprofloxacin trong nước
tiêu cĩ thê đạt 200 mg/L va sau 8 - 12h, c6 thé dat 30 mg/L [3]
1.2.2.4 Chỉ định và tác dụng khơng mong muốn
Chỉ định:
- Các nhiễm khuân nặng mà các thuốc kháng sinh thơng thường khơng tác dụng để tránh phát triển các vi khuẩn kháng cipofloxacin:
+ Viêm đường tiết niệu trên và dưới, viêm tuyến tiền liệt, viêm xương - tủy,
viêm ruột vi khuẩn nặng, nhiễm khuẩn nặng mắc trong bệnh viện (nhiễm
khuẩn huyết, người bị suy giảm miễn dịch)
- Dự phịng bệnh não mơ cầu và nhiễm khuẩn ở người suy giảm miễn dịch
Tác dụng khơng mong muốn
- Trên các giác quan: mất cảm giác mùi vị, rỗi loạn thị giác
- Dị ứng: nỗi mề đay, sốc phản vệ
- Trên máu và hệ tạo máu: thiéu máu, giảm bạch cầu hạt, tăng bạch cầu ưa
Trang 1910
1.2.2.5 D6 6n dinh va bao quan
Bảo quản các chế phẩm cé chita Ciprofloxacin hydroclorid trong lo kin 6 nhiét d6 dudi 30°C, tranh anh sáng cực tím mạnh
Dung dịch Ciprofloxacin hydroclorid trong nước cĩ pH từ 1,5 đến 7,5 giữ ở nhiệt độ phịng cĩ thê bên vững trong ít nhất 14 ngày
1.2.3 Các phương pháp định lượng Ciprofloxacin
Bảng 1.1: Các phương pháp định lượng Ciprofloxacin Phương pháp Đặc diém Tài liệu tham khảo
Điện hĩa Cực phơ xung vi phân
Điện cực cơng tác: điện cực paste cacbon
Tốc độ quét: 0,02 V/s
Khoảng thế: -0,3 —› — 1,3 V
Biên độ xung: 50 mV Thời gian tích gĩp: 2 phút
Điện ly nền: đệm phosphate 0,1M, pH 4,0, cĩ thê cĩ
natri dodecyl benzen sulfonat 1x10 ~* mol/L
[22]
Von - ampe quét thê tuyên tính
Điện cực cơng tác: Cacbon than chì biến tính ống nano cacbon da lớp Khoang thế: -0,4— —1,1V Tốc độ quét: 10 mV/s Điện ly nền: đệm phosphate pH 7 [9]
Cực phơ quét thê tuyên tính
Trang 2011 long hiéu nang cao dén pH 3,0 voi triethylamin) - acetonitril (87: 13) Cột: C18 (250 x 4,6 mm, 5 um) Nhiệt độ cột: 40°%C Tốc độ dịng: 1,5 mL/phút Detector: 278 nm Thể tích tiêm: 20 uL
Pha động: Hỗn hợp dung dịch acid phosphoric 0,025 M
(đã được điều chỉnh đến pH 3,0 với triethylamin) - acetonitril (87 : 13) Cột: C18 (250 x 4,6 mm, 10 um) Nhiét d6 cét: 30°C Detector: 278 nm Thé tich tiém: 20 ul Tốc độ dịng: 1 ml/phút [23]
Pha d6ng: acid phosphoric 2,45 g/L (da duoc điêu chỉnh
đến pH 3,0 với triethylamin) - acetonitril (87 : 13) Cot: C18 (250 x 4,6 mm, 5 um) Nhiệt độ cột: 40°C Detector: 278 nm Thể tích tiém: 10 pl Tốc độ dịng: 1,5 ml/phút [8]
Pha động: Nước - acetomtril - triethylamin (80: 20 : 0,3), pH 3,3 điều chỉnh bằng acid phosphoric Cot: C18 (125 x 4 mm, 5 um) Nhiệt độ cột: 24°C Detector: 279 nm Thể tích tiém: 20 pl Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút [19] Pha động: 900 mL (50 mL/L acetic acid), 50 mL acetonitril va 50 mL methanol /L
Nước - acetomitril - triethylamin (80 : 20 : 0.3), pH 3,3
diéu chinh bang acid phosphoric
Cot: C18 (150 x 6 mm, 5 um) [17]
Trang 2112 Nhiệt độ cột: 50”C Detector: 280 nm Thé tích tiém: 20 pl Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút
Đo quang Đo quang tại 435 nm sau khi phản ứng với sắt (III) nitrat 1 % trong dung dich acid nitric 1 % [15]
Đo quang tại 447 nm sau phản ứng tạo phức với sắt (IID) trong dung dich acid sulfuric 5,0 x 10 7 > M, trong diéu
kién luc ion 0,2 M
[10]
Đo quang tại bước sĩng 545 sau phản ứng tạo phức với
palladium(II) và eosin khi c6 mat methy] cellulose
Đo huỳnh quang tại bước sĩng phát xa 540 nm với bước sống kích thích 310 nm sau phản ứng tạo phức với với palladium(II) và eosin khi cĩ mặt methyl cellulose
[6]
Chuân độ đo thê: dựa trên phản ứng tạo phức nhanh với ion sắt (II) theo tỉ lệ 3 : 1 trong acid sunfuric lỗng 0,09 M Điện cực hỗn hong bạc được sử dụng đề làm hệ chỉ
thi [5]
Trang 2213
CHUONG 2:
DOI TUQNG VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU 2.1 DOI TUQNG - NGUYEN LIEU VA THIET BI
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
- Viên nén Ciprobay (cơng ty Bayer, Leverkusen, Đức) Số lơ: BXEURK3 Số đăng ký: VN - 1594 - 06 Ngày sản xuất: 28/01/2011 Hạn dùng: 28/01/2016 - Thuốc nhỏ mắt Quindrops, (céng ty Altomega drug Pvt., Ltd, An D6) Số lơ: QN - 1101 Số đăng ký: VN — 5184 — 08 Ngày sản xuất: 02/02/2011 Hạn dùng: 01/02/2013
- Dung dịch tiêm truyền Ciprofloxacin (cơng ty cỗ phần Dược phẩm TWI —
Pharbaco): bán thành phẩm trước và sau khi hấp tiệt trùng
- Mẫu tự tạo dịch truyền của cơng ty cỗ phần dược phẩm TW1 — Pharbaco
2.1.2 Nguyên liệu và thiết bị
- Nguyên liệu:
+ Chất chuẩn:
Ciprofloxacin: hàm lượng: 99,4 % (tính theo chất khan), độ âm: 6 % (Viện
kiểm nghiệm thuốc trung ương)
+ Nước cất 2 lần đã lọc loại bỏ ion
+ Dung dịch CHạCOOH đặc œ 98 % khối lượng /khối lượng), dung địch H;PO¿ đặc (> 84 % khối lượng /khối lượng), dung dịch HCI đặc (tỉ trọng ở 20°C = 1,18, nồng độ khoảng 11,5 M)
+ Nước tiêu của người khỏe mạnh
Trang 2314 + Bình định muc: 25 ml (15 chiéc), 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml + Cốc cĩ mỏ: 100 ml và 250 ml + Pipet: 5ml, I0 ml, 10 — 1000 ul + Phễu lọc, giấy lọc, bộ chày cối - Máy mĩc thiết bị:
+ Máy cực phố Computrate 797 VA với phần mềm chuyên dụng 797 VA
Computrace Software 1.3 (Metrohm AG, Thuy Si) được chạy trên hệ diéu
hành Windows XP Hệ 3 điện cực của máy gồm cĩ: Điện cực cơng tác: cực giọt Hg treo (HDME) Điện đực so sánh: Ag|AøgCI|KC]
Điện cực bố trợ: Pt
Loại O; hịa tan băng N; 99,99 %
+ Máy đo pH: EUTECH INSTRUMENTS pH 510 + Máy lọc nước: Maxima Ultra pure water (ELGA) + May siéu 4m: Ultrasonic LC 60H
+ Cân phân tích Sartorius
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Nghiên cứu cơ chế phản ứng khử cực Ciprofloxacin với cực giọt thúy ngân treo
2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng Ciprofloxacin bằng phương pháp cực phố xung vi phan trong dung dịch đệm và nước tiểu
- Tối ưu hĩa điều kiện phân tích
- Chọn khoảng nồng độ cĩ sự phụ thuộc tuyến tính giữa các nồng độ và các giá trị cường độ dịng điện tương ứng
- Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống
Trang 2415
- Kiém tra giới hạn định lượng dưới trong nước tiêu
2.2.3 Ứng dụng phương pháp cực phố xung vi phân đã nêu để định lượng Ciprofloxacin trong các chế phẩm và mẫu nước tiểu tự tạo
- Định lượng Ciprofloxacin trong các chế phẩm trong cùng một mẫu bằng các phương pháp:
+ Cực phổ xung vi phân
+ Sắc ký lỏng hiệu năng cao theo qui định của dược điển Việt Nam IV [2]
+ So sánh kết quả của phương pháp cực phơ với phương pháp HPLC - Định lượng ciprofloxacin trong mẫu nước tiểu tự tạo
2.2.4 Xử lý kết quả thực nghiệm [4]
Trang 2516
CHUONG 3:
THUC NGHIEM, KET QUA VA BAN LUAN 3.1 KET QUA THUC NGHIEM VA NHAN XET
3.1.1 Chuẩn bị hĩa chất
l1) Pha đệm vạn năng (Đệm Britton-Robinson)
Hỗn hợp gồm 3 acid: CH;COOH 0,04 M + H;BO; 0,04 M + H3PO, 0,04 M
- Lay 0,24 ml dung dich CH;COOH dac hoa tan vao khoang 100 ml nudc cat dugc dung dich CH;COOH 0,04 M
- Lay 0,25 ml dung dịch H;PO¿ đặc hịa tan vào khoảng 100 ml nước cất được dung dịch HạPO¿ 0,04 M
-_ Cân 0,27 g H3BO; hoa tan vao khoang 100 ml nước cất được dung dịch HạBO; 0,04M Dung dịch NaOH 0,2 M: can 0,8 g NaOH hịa tan vào khoảng 100 mÌ nước cất - _ Trộn hỗn hợp 3 acid với dung dịch NaOH 0,2 M theo các tỉ lệ thích hợp để được các pH khác nhau 2) Pha đệm acetat pH = 3,5
- Pha dung dich CH;COOH 2 M: Lay 3 ml dung dich acid CH;COOH đặc
hịa tan vào khoảng 25 mÌ nước cất được dung dich CH;COOH 2 M
- Tron céc dung dich CH;COOH 2 M va NaOH 0,2 M theo mot ti 1é thich
hợp để được các dung dịch đệm pH 3,5 ở các nồng độ khác nhau 3) Pha dém phosphat pH = 3,5
- Can 0,54 g KH,PO, hoa tan vao khoang 100 ml nudéc cat được dung dịch
KH;PO¿ 0,04 M
Trang 2617
4) Pha dém Citrat — HCl, pH = 3,5
- Dung dich acid citric 0,1 M: Can 0,77 g acid citric khan hoa tan vao khoảng 100 ml nước cất được dung dịch acid citric 0,1M
- Dung dịch HCl 1 M: Từ dung dịch acid HCI đặc, lẫy 8,5 ml pha vào khoảng 100 ml nước cất được dung dịch HCI 1 M
- - Trộn dung dịch acid citric 0,1 M với dung dịch HCT 1 M theo tỉ lệ thích
hợp để được dung dịch đệm pH 3,5
3.1.2 Chuẩn bị mẫu
Pha mẫu chuẩn:
Pha dung dịch chuẩn gốc Ciprofloxacin 500 ppm:
- Cân chính xác khoảng 0,055 ø chất chuẩn Ciprofloxacin định mức với nước cất thành 100 ml Bảo quản dung dịch này trong lọ tối màu trong tủ lạnh trong khoảng một tuân
Các dung dịch Ciprofloxacin làm việc được pha lỗng từ dung dịch chuẩn gốc trong bình định mức 50 mI
3.1.3 Nghiên cứu cơ chế phần ứng khử cực Ciprofloxacin với điện cực giọt thủy ngân treo
Trang 2718
Kích cỡ giọt 4
- Kết quả cho thây khi pH tăng, peak ngày càng tù hơn va dịch chuyền dan
theo chiều âm của thế (Hình 3.1a) Với pH > ĩ6, khơng cĩ peak xuất hiện trên đường cong von - ampe của dung dịch Ciprofloxacin 0,05 ppm (Hình 3.1a) Sự phụ thuộc của vị trí xuất hiện peak vào pH được biểu diễn bằng phương
trình hồi quy tuyến tính E = — 0,067 pH -— 1,237 (Hình 3 1b) 5 E (V) -1.10 -1.20 -1.30 -1.40 -1.50 -1.60 -1.70
Trang 2819 -1.4- y = -0.067x - 1.237 1.45 - R? = 0.994 = 1.55 w -1.55 - H -† 6 T pr T 1 2 3 4 5 6
Hinh 3.1b: Dé thị sự phụ thuộc vị trí xuất hiện peak trên đường cong von -
ampe vong Ciprofloxacin 0,05 ppm vao pH cua dém van nang
3.1.4 Xây dựng phương pháp định lượng Ciprofloxacin bằng phương pháp cực phố xung vi phan trong dung dịch đệm và nước tiểu
3.1.4.1 Tối ưu hĩa điều kiện phân tích
1) Khảo sát các loại đệm
Trang 2920 -3.00 -2.90 - -2.00 - | (HA) -1.50 - -1.00 - -0.50 - 0.00 1 | ! ! -1.1 1.2 -1.3 -14 -15 -16 © -1.7 Hinh 3.2a: Cuc pho do xung vi phan cua dung dich Ciprofloxacin 0,1 ppm trong nén dém phosphat pH 3,5 -2.50 -2.00 + -1.50 - | (WA) -1.00 - -0.50 - 0.00 1 1 | | -1.20 -1.30 -1.40 -1.50 -1.60 -1.70
Trang 3021 -1.10 -1.30 -1.50 -1.70
Hình 3.2c: Cực phổ đồ xung vi phân của dung dịch Ciprofloxacin 0,1 ppm trong nên đêm acetat pH 3,5
Qua khảo sát sơ bộ, đệm acetat được lựa chọn cho các khảo sát sau này
2) Tơi ưu hĩa điều kiện phân tích
Qua khảo sát sơ bộ, 4 yếu tố cĩ ảnh hưởng nhiều nhất tới cường độ dịng do
được là nồng độ đệm (0,06 + 0,1 M), pH đệm (3 + 4), thế tích gĩp (0,9 + 1,3
V), thời gian tích gĩp (50 + 100 s) 4 yếu tổ này được lựa chọn để khảo sát
điều kiện tối ưu theo mơ hình thiết kế nhân tố tồn phân với sự hỗ trợ phân
mềm Modde 5.0 (Bảng 3.3)
Trang 3122
Bang 3.3: Kết quả đo cực phố xung vì phân
Ciprofloxacin 0,1 ppm theo mơ hình thiết kế nhân tơ tồn phân Sơ pH Nơngđộđệm Thêtíchgĩp Thời giantíchgĩp Cường độ dịng thứ tự (M) (V) (s) (HÀ) 1 3 0,06 — 1,3 50 — 5,102 2 4 0,06 — 1,3 50 — 5,203 3 3 0,1 - 1.3 50 — 4,987 4 4 0,1 - 1,3 50 — 5,121 5 3 0,06 — 0,9 50 — 4,890 6 4 0,06 — 0,9 50 — 5,090 7 3 0,1 — 0,9 50 — 4,923 8 4 0,1 — 0,9 50 — 4,914 9 3 0,06 —1,3 100 — 4,201 10 4 0,06 — 1,3 100 — 3,462 11 3 0,1 — 1,3 100 — 3,382 12 4 0,1 — 1,3 100 — 3,402 13 3 0,06 — 0,9 100 — 4,103 14 4 0,06 — 0,9 100 — 3,301 15 3 0,1 — 0,9 100 — 3,421 16 4 0,1 — 0,9 100 — 3,918 17 3 0,06 —1,1 75 — 4,563 18 4 0,06 —1,1 75 — 4,569 19 3,5 0,06 —1,1 75 — 4,890 20 3,5 0,1 —1,1 75 — 4,872 21 3,5 0,08 - 1,3 75 — 4,456 22 3,5 0,08 — 0,9 75 — 4,472 23 3,5 0,08 —1,1 50 — 6,102 24 3,5 0,08 —1,1 100 — 4,113 25 3,5 0,08 —1,1 75 — 4,324 26 3,5 0,08 —1,1 75 — 4,432 27 3,5 0,08 —1,1 75 — 4,351
Đề đạt được cường độ dịng lớn nhất, điều kiện tối ưu được xác định cho các yếu tố khảo sát lần lượt là: nơng độ đệm 0,08 M, pH đệm 3,6 thế tích gdp — 1,1 V và thời gian tich gép 50 s Hinh 3.3a va 3.3b biéu dién anh hung cia
các yếu tố khảo sát đối với cường độ dịng đo được khi điện phân
Trang 3223
Hình 3.3a: Mặt đáp ứng biểu diễn ảnh hưởng của pH và nơng độ đệm đối với cường độ dịng ẩo được (thể tích gĩp — 1,1 V và thời gian tích gĩp 50 s)
Trang 33
24
3.1.4.2 Tính thích hợp của hệ thống
Tính thích hợp của hệ thống được xác định dựa trên kết quả 6 phép thử song
song trên cùng một dung dịch chuẩn Ciprofloxacin 0,1 ppm trong cùng điều kiện Kết quả được trình bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4: Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống Sơthứtự Vitrípeak(V) I (uA) 1 — 1,342 — 2,86 2 — 1,342 — 2,85 3 — 1,336 — 2,76 4 — 1,342 —2,77 5 — 1,336 — 2,80 6 — 1,342 — 2,78 Trung binh — 1,339 — 2,80 SD 0,002 0,04 RSD 0,2 % 0,2 %
3.1.4.3 Khao sat khoang tuyén tinh
Trang 3425 -4.00 x 2 Mau trang -3.50 Ciprofloxacin -3.00 -2.50 WA) -2.00 -1.50 -1.00 -0.50 0.00 100 -1.10 -1.20 -130 -140 -1.50 -1.60 -1.70
Trang 3526
3.1.4.4 Định lượng dưới Ciprofloxacin trong nước tiểu
-_ Lấy chính xác V ml dung dịch Ciprofloxacin chuân 5 ppm, 0,1 ml dung
dịch đệm acetat pH 3,5, định mức thành 25 ml với dung dịch nước tiểu đã
pha lỗng 1250 lần, đem đo cực phơ xung vi phân trong cùng điều kiện (bảng 3.6a)
Bảng 3.6c: Kết quả khảo sát giới hạn định lượng dưới trong nước tiểu
C(ppm V(ml) VỊ trí peak I(uA) C (ppm) Tim lại
Trang 3627 -6.00 ¬ -5.00 ¬ oe og Mau trang Ciprofloxacin -4.00 - -3.00 - -2.00 - -1.00 ¬ 0.00 -1.10 -1.20 -1.30 -1.40 -1.50 -1.60 -1.70
Trang 3728 Bang 3.6d: Kết quả định lượng Ciprofloxacimtrong 4 mẫu kiểm sốt chất lượng (n=6) C(ppm) V (ml) Vitripeak I(uA) C(ppm)tmlại % tìm lại E(V) 0,01 0,002 — 1,29 -134 0,011+0,004 107,4+4,0 0,025 0,005 _ 1,32 ~1,58 0024+0001 966+1,0 0,10 0,02 - 1,41 —2,98 0/097+0001 967+1,0 0,16 0,032 _ 1,44 -425 0,167+0,001 1044+2/0 Bảng 3.6e: Độ thu hồi tuyệt đối Ciprofloxacintrong 4 mẫu kiểm sốt chất lượng (n=6)
C (ppm) I (uA) (trong nước l(uA) (khơng cĩ nước Độ thu hơi tuyệt
Trang 3829
3.2 UNG DUNG PHUONG PHAP CUC PHO XUNG VI PHAN DE DINH LUQNG CIPROFLOXACIN TRONG CAC CHE PHAM VA MAU NUOC TIEU TU TAO
3.2.1 Xử lý mẫu và chuẩn bị dung dịch thử
- Viên nén Ciprobay 500 mg:
Cân 20 viên thuốc bằng cân phân tích, nghiền mịn Cân chính xác một lượng
bột thuốc tương ứng với 400 mg Ciprofloxacin cho vào bình định mức 50 mị, thêm 25 ml nước cất, lắc, siêu âm khoảng 20 phút, thêm nước cất vừa đủ
Lọc, loại bỏ 10 - 20 ml dich loc đầu Lây 5 ml dịch lọc, cho vào bình định
mức 50 ml Lấy 0,5 ml dung dịch này cho vào bình định mức 50 ml, thêm nước vừa đủ
- Thuốc nhỏ mắt Quindrops 3 mg/ml: Lắc đều, lẫy chính xác 0,27 ml thuốc nhỏ mắt vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất vừa đủ
- Mẫu tự tạo dịch truyền của cơng ty cơ phần được phẩm TW1: Cân chính xác lượng bột CiprofloxacIn tương ứng khoang 400 mg Ciprofloxacin vao binh
định mức 100 ml, thêm nước cất vừa đủ, lắc đều Lẫy chính xác 0,5 ml dung
dịch trên cho vào bình định mức 50 ml, thêm nước cất vừa đủ
- Với chế phẩm thuốc tiêm Ciprofloxacin của cơng ty cơ phần TWI
(trước và sau khi hấp tiệt trùng): trộn đều 5 chai dịch truyên, lây 0,27 ml cho
vào bình định mức 100 mi, thêm nước cất vừa đủ
3.2.2 Kết quả định lượng
Tiến hành định lượng bằng phương pháp đường chuẩn, lây 0,25 ml dung dịch
Trang 3930 Thê tích gĩp —1.1V Thời gian tích gĩp 50 s Thời gian cân bằng 15 s Biên độ xung 0,1 V Tân số 50 Hz Bước thế 0,005 V Tốc độ khuấy 2000 vịng/ phút Khoảng thế -1,1— -1,6V Thời gian sục khí 50 s Kích cỡ giọt 4
Kết quả định lượng được trình bày ở hình 3.7a, 3.7b, 3.7c và bảng 3.7 So
sánh với kết quả định lượng các chế phẩm viên nén, dịch truyền và thuốc nhỏ
mắt đã khảo sát bằng cực phơ xung vi phân và HPLC bằng kiểm định t ghép
Trang 4031 3 - Quindrops 5 Mau trang -2.5 -2 xc aids 455 = 14 -0.5 + E(V) O [ T | -1.10 -1.30 -1.50 -1.70 Hình 3.7b: Cực phổ đồ xung vì phân của Ciprofloxacin trong chế phẩm Quindrops 3° Dich truyén Mau trang -2.5 -2 + 1515 +1 3 -0.5 ¬ E(V) 0 Ĩ T 1 -1.10 -1.30 -1.50 -1.70
Hình 3.7c: Cực phổ đồ xung vi phân của Ciprofloxacin trong dich truyén Ciprofloxacin