Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI • • • • — oOo— v ũ ĐỨC LỢI NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ETORICOXIB TRONG CHÉ PHẨM VÀ TRONG HUYỂT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC LUẶN VÃN THẠC SỸ D ợc HỌC • • • • CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60 73 15 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐOÀN CAO SƠN HÀ NỘI - 2010 TRƯỜNG ĐH ĐƯỢC HÀ NỘI T H Ư VS ỆN , 10 {QJuUQý\ỹuym Qffimcj' ĨQÁu Ngày Số tháng năm 20 J l LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Đoàn Cao Sơn người thầy trực tiếp, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt trình thực ỉuận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy PGS TS Trần Đức Hậu người tận tình giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến cán Phòng D ược lý - Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương, cản Bộ mơn Hóa Dược- Trường Đ H Dược Hà N ội tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình tơi làm thực nghiệm Cuối tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè ln khích lệ, động viên, giúp đỡ thời gian qua Hà Nội ngày tháng 09 năm 2010 Học viên Vũ Đức Lọi MỤC LỤC Danh muc chữ viết tắt Danh mục bảng số liệu Danh mục hình vẽ ĐẶT VẤN Đ È CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan etoricoxib 1.1.1 Công thức cấu tạo Etoricoxib 1.1.2 1.1.3 1.1.4 1.1.5 1.1.6 Tính chất lý hóa Dược động h ọ c Tác dụng chế tác dụng .4 Chỉ định Chống định 1.1.7 Tác dụng không mong muốn .4 1.1.8 Tương tác thuốc 1.1.9 Chế phẩm 1.2 Một số phương pháp định lượng etoricoxib 1.2.1 Định lượng Etoricoxib phương pháp HPLC 1.2.2 Định lượng Etoricoxib huyết tương phương pháp L C/MS/M S 1.2.3 Phương pháp đo quang để định lượng etoricoxib chế phẩm viên nén 1.2.4 Phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) định lượng etorỉcoxib chế phẩm 1.3 Tổng quan HPLC 1.3.1 Khái niệm sắc ký lỏng hiệu c a o 1.3.2 Nguyên tắc trình sắc k ý 1.3.3 Cơ sở ỉý thuyết trình sắc k ỷ 1.3.4 Cấu tạo hệ thống HPL C .9 1.3.5 Các thơng số đặc trưng q trình sắc k ý 10 1.3.6 Cơ sở lý thuyết việc lựa chọn điều kiện sắc ký 12 1.3.7 ửng dụng H PLC .14 1.4 Phương pháp xử lý mẫu huyết tương 15 1.4.1 Phương pháp tủa protein 16 1.4.2 Phương pháp chiết lỏng- lỏng 16 1.5 Thẩm định phương pháp phân tíc h 16 1.5.1 Thẩm định phương pháp phân tích thuốc dạng chế phẩm 16 1.5.2 Thẩm định phương pháp phân tích thuốc huyết tương 18 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 20 2.1 Nguyên vật liệu thiết b ị 20 2.1.1 Nguyên vật liệu 20 2.1.2 Trang thiết bị, dụng cụ 20 2.2 Nội dung nghiên u 20 2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng Etoricoxib chế phẩm huyết tương .21 2.2.2 Thẩm định phương pháp vừa xây dựng 21 2.2.3 ửng dụng phương pháp xây dựng để định lượng Etoricoxib chế phẩm viên nén 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 CHƯƠNG KỂT QUẢ NGHIÊN c ứ u .23 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng Etoricoxib chế phẩm HPLC .7 23 3.1.1 Lựa chọn bước sóng thích hợp 23 3.1.2 Khảo sát chọn thành phần pha động 24 3.1.3 Lựa chọn tốc độ dòng 25 3.2 Thẩm định phương pháp định lượng etoricoxib chế phẩm 25 3.2.1 Độ thích hợp hệ thống 26 3.2.2 Độ đặc hiệu 27 3.2.3 Độ tuyến tính 29 3.2.4 Độ xác 30 3.2.5 Độ 31 3.3 ứ ng dụng định lượng etoricoxib chế phẩm 32 3.4 Xây dựng phương pháp định lượng etoricoxib huyết tương 34 3.4.1 Chọn chuẩn nội điều kiện sắc k ý .34 3.5.2 Độ tuyến tỉnh 47 3.5.3 Giới hạn định lượng .48 3.5.4 Độ độ lặp lại 49 3.5.5 Hiệu suất chiết 52 3.5.6 Độ ổn định 53 CHƯƠNG BÀN LUẬN 59 KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 63 Kết luận 63 Kiến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN : Acetonitril A ưc : Diện tích đường cong nồng độ - thời gian COX- : Cyclooxygenase- Ctnax : Nồng độ cực đại Eto : Etoricoxib FDA : Cục quản lý thuốc thực phẩm Administration) : Hạn dùng HD HPLC (Food and Drug HT : Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) : Mầu kiểm sốt có nồng độ cao (Hight Quanlity Control Sample) : Huyết tương IS : Chất chuẩn nội (Internal Standard) KNTTW : Kiểm nghiệm thuốc trung ương LC/MS : Sắc ký lỏng khối phổ LOQ : Gới hạn định lượng (Limit of Quantitation) LQC : Mau kiểm soát có nồng độ thấp (Lower Quanlity Control Sample) : Methanol HQC MeOH MQC NSX : Mầu kiểm sốt có nồng độ trung bình (Middle Quanlity Control Sample) : Ngày sản xuất NSAIDS : Thuốc chống viêm giảm đau hạ sốt khơng steroid PA : Tinh khiết phân tích QC : Mầu kiểm soát (Quanlity Control Sample) RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard deviation), s : Diện tích pic SD : Độ lệch chuẩn (Relative Standard) SDK : Số đăng ký ti /2 : Thời gian bán thải thuốc (h a lf- life) tmax : Thời gian thuốc đạt nồng độ cực đại máu TB : Trung bình ULOQ: Giới hạn định lượng (upper limit of quantification) ƯV-VIS : Tử ngoại - khả kiến DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU Trang Bảng 1.1 Các chương trình HPLC Bảng 3.1 Kêt khảo sát độ thích hợp hệ thơng săc ký 26 Bảng 3.2 Kêt khảo sát độ tuyên tính 29 Bảng 3.3 Kêt khảo sát độ xác 31 Bảng 3.4 Kêt khảo sát độ 32 Bảng 3.5 Kêt định lượng etoricoxib viên nén Etotab-60 34 Bảng 3.6 Cách pha mẫu huyết tương 37 Bảng 3.7 Kêt khảo sát độ tuyên tính Etoricoxib HT 47 Bảng 3.8 Kêt xác định LLOQ 49 Bảng 3.9 Kêt xác định độ độ lặp lại ngày 49 Bảng 3.10 Kết xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày 51 Bảng 3.11 Kết xác định hiệu suất chiết etoricoxib 52 Bảng 3.12 Kết xác định hiệu suất chiết aspirin (IS) 53 Bảng 3.13 Kết xác định độ ổn định dung dịch chuẩn gốc nội chuẩn gốc 54 Bảng 3.14 Kết xác định độ ổn định mẫu huyết tương qua chu kỳ đông - rã đông 55 Bảng 3.15 Kết xác định độ ổn định dài ngày mẫu huyết 56 tương Bảng 3.16 Kết xác định độ ổn định autosampler 57 Bảng 3.17 Kết xác định độ ổn định thời gian ngắn mẫu huyết tương 58 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 3.1 Phổ hấp thụ tử ngoại dung dịch Etoricoxib 10 |ig/ml 24 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu trắng (pha động) 27 Hình 3.3 Săc ký mâu chn Etoricoxib Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu thử Etoricoxib Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu thử Etoricoxib có thêm Etoricoxib chuẩn Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính nồng độ 28 28 28 29 diện tích pic Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Etoricoxib định lượng 33 Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu thử Etoricoxib định lượng 34 Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch hỗn hợp Celecoxib Etoricoxib 35 Hình 3.10 Sắc ký đồ dung dịch hỗn họp Paracetamol Etoricoxib 36 Hình 3.11 Sắc ký đồ dung dịch hỗn họp Aspirin Etoricoxib 36 Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu huyết tương có etoricoxib IS 39 acid hố Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu huyết tương có etoricoxib IS khơng 39 acid hố Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu huyết tương có etoricoxib IS acid hố cạn 40 Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu huyết tương có etoricoxib IS 41 acid hố cạn Hình 3.16 Sắc ký đồ mẫu huyết tương etoricoxib IS 41 Hình 3.17 Sắc ký đồ mẫu huyết tương etoricoxib IS, chiết 42 ethylacetat Hình 3.18 Sắc ký đồ mẫu huyểt tương etoricoxib IS, chiết 43 diethylether/dichloromethane Hình 3.19 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng người 44 Hình 3.20 sắc ký đồ mẫu huyết tương có chuẩn Eto 100ng/ml 44 Hình 3.21 Sắc ký đồ mẫu huyết tương có chuẩn nội aspirin 45 1000ng/ml Hình 3.22 sắc ký đồ mẫu huyết tương có chuẩn Eto chuẩn 45 nội aspirin Hình 3.23 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng chó 46 Hình 3.24 sắc ký đồ mẫu huyết tương thử chó 46 Hình 3.25 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính nồng độ tỷ lệ diện tích pic Eto/IS 47 Bảng 3.15 Kết xác định độ ổn định dài ngày mẫu huyết tương Mau STT Mầu ban đầu Sau 10 ngày Sau 20 ngày Sau 30 ngày 183,5 179,4 175,9 172,8 189,7 176,8 173,8 169,9 172,5 180,3 182,0 163,8 175,1 171,9 174,7 179,1 178,7 188,5 172,1 180,5 TB 179,9 179,3 175,7 173,2 RSD% 3,81 3,37 2,15 3,95 Tỷ lệ so với mẫu ban đầu (%) 99,6 97,6 96,2 1772,4 1759,3 1736,8 1723,1 1793,7 1772,5 1728,7 1725,4 1761,9 1769,8 1758,9 1733,2 1778,3 1789,7 1773,6 1766,4 1742,6 1790,2 1792,5 1719,9 TB 1769,8 1776,3 1758,1 1733,6 RSD% 1,08 0,75 1,49 1,09 100,4 99,3 97,9 LQC 181,8 ng/ml HQC 1767,5 ng/ml Tỷ lệ so với mẫu ban đầu (%) Nhận xét: Kết cho thấy nồng độ Eto mẫu huyết tương bảo quản 30 ngày điều kiện - 40°c chênh lệch không 15% so với mẫu ban đầu Chứng tỏ mẫu huyết tương ổn định điều kiện bảo quản 30 ngày nhiệt độ - 40°c c, Độ ổn định autosampler 56 Trong nghiên cứu đánh giá SKD TĐSH số lượng mẫu cần xác định nồng độ hoạt chất thường nhiều, sau xử lý mẫu (chiết tách hoạt chất) phân tích mẫu mà khơng thể phân tích đồng thời Do càn phải đánh giá độ ổn định autosampler (độ ổn định hoạt chất dung dịch mẫu xử lý chờ sắc ký) để có kế hoạch xử lý mẫu phân tích phù họp Pha mẫu LQC, HQC So sánh kết sắc ký mẫu phân tích sau xử lý với mẫu xử lý xong để thêm phân tích Kết trình bày bảng 3.16 Bảng 3.16 Kết xác định độ ổn định autosampler > Nông độ Etoricoxib (ng/ml) STT LQC (181,8ng/ml) Tiêm HQC (1767,5ng/ml) Tiêm Sau 8h autosampler Nồng độ IS (ng/ml) («1000ng/ml Sau 8h Tiêm autosampler Sau 8h autosampler 174,6 182,5 1778,5 1769,2 1023,6 1031,1 185,2 173,2 1750,2 1732,8 1012,4 1029,3 186,7 175,8 1798,9 1780,9 992,9 989,6 176,3 177,4 1780,6 1779,2 1019,6 1016,8 179,8 180,5 1785,4 1787,1 1006,9 1010,6 180,5 177,9 1778,7 1769,8 1011,0 1015,5 RSD% 3,62 Tỷ lệ so với tiêm (%) 2,70 1,38 1,43 1,53 2,31 TB 99,4 98,5 100,4 Nhận xét: Kết cho thấy mẫu huyết tương có Etoricoxib IS sau xử lý, chờ tiêm sắc ký, ổn định sau autosampler d, Độ ổn định thời gian ngắn (trong trình xử lý mẫu) 57 Pha lô mẫu LQC, HQC lô mẫu, sau để đơng tủ lạnh sâu Xác định nồng độ etoricoxib mẫu phân tích sau để rã đông mẫu rã đông để thêm nhiệt độ phòng đem phân tích Kết trình bày bảng 3.17 Bảng 3.17 Kết xác định độ ổn định thời gian ngắn mẫu huyết tương Nồng độ etoricoxib (ng/ml) SST Mầu LQC (181,8ng/ml) Mầu HQC (1 767,5ng/ml) Ban đầu Sau Ban đầu Sau 183,5 187,6 1747,3 1782,3 189,7 178,5 1758,9 1773,5 175,7 186,4 1779,6 1786,4 178,4 169,9 1787,8 1722,8 172,5 173,7 1804,8 1725,7 TB 179,9 179,2 1775,7 1758,1 RSD% 3,76 4,32 1,29 1,78 Tỷ lệ so với ban đàu (%) 99,6 99,0 Nhận xét: Kết cho thấy nồng độ LQC HQC: nồng độ Eto mẫu huyết tương phân tích sau để rã đơng nhiệt độ phòng chênh lệch khơng q 5% so với mẫu phân tích sau rã đông Chứng tỏ mẫu huyết tương sau rã đông ổn định nhiệt độ phòng 58 CHƯƠNG BÀN LUẬN Phương pháp HPLC phương pháp phân tích đại Tuy có số nhược điểm giá thành trang thiết bị cao, dung mơi, hóa chất đắt tiền HPLC có ưu điểm bật có ổn định, độ chọn lọc, tính xác cao định tính, định lượng đồng thời nhiều hoạt chất mà không cần phân tách trước phương pháp định lượng etoricoxib chế phẩm: + Xây dựng phương pháp: So với phương pháp HPLC tham khảo, phương pháp sử dụng dung môi acetonitril chủ yếu, dung môi đắt nhiều so với dung môi methanol mà sử dụng Phương pháp mà xây dựng đơn giản, đặc hiệu có độ đúng, xác cao So với phương pháp đo quang phương pháp đơn giản, dễ thực phương pháp HPLC độ xác khơng cao So với phương pháp điện di mao quản vùng phương pháp có độ xác so với phương pháp HPLC Việt Nam máy điện di phổ biến sử dụng máy HPLC + Thẩm định phương pháp: Kết nghiên cứu cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu cao mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu thử thêm chuẩn sắc ký đồ cho pic thời gian lưu 5,8 phút mẫu trắng khơng xuất pic vị trí Khoảng nồng độ tuyến tính từ 2,6 - 5,6 I^g/ml rộng cho phép phân tích chế phẩm có hàm lượng sai khác lớn (60- 140%) Độ phương pháp xác định với khả tìm lại khoảng 98,3100,2% (yêu cầu khả tìm lại từ 98-102%) RSD = 0,77% (yêu cầu RSD < 2%) Như phương pháp có độ cao 59 độ xác, qua khảo sát cho thấy phương pháp có độ xác cao với giá trị RSD = 0,48% *về phương pháp định lượng etoricoxib huyết tương: + Xây dựng phương pháp: Chúng xây phương pháp định lượng thực đơn giản nhanh, có độ đặc hiệu, độ đúng, độ xác cao Đặc biệt xử lý mẫu phương pháp tủa protein với dung môi MeOH nhanh, đơn giản mà hiệu suất chiết độ lặp lại cao Ở kết hợp phương pháp kết tủa protein với biện pháp bốc dung mơi có khả đặc mẫu, làm tăng độ nhạy phương pháp Xử lý mẫu huyết tương phương pháp chiết lỏng - lỏng thường tốn nhiều dung môi thời gian hơn, phức tạp Phương pháp xây dựng sử dụng detecter uv loại phổ biến rẻ tiền so với detecter khối phổ phương pháp LC/MS Mặt khác, phương pháp LC/ MS thực phức tạp không thông dụng phương pháp HPLC Chúng sử dụng loại cột phân tích Nucleosil Ci8 chuẩn nội aspirin rẻ tiền, dễ mua, phù hơp với điều kiện Việt Nam, khơng đắt tiền khó mua loại cột (Kromasil KR100-5Ci8; Waters symmetry® Ci8; Hypersil BDS Cig) chất chuẩn nội (DRF-4367, Zelaplon, Valdecoxib) chương trình HPLC tham khảo Phương pháp xây dựng thời gian chạy sắc ký ngắn (