Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC

Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC

Trang 1

a

DUC VA DAO TAO BO Y TE

TRUONG DAI HOC DUOC HA NOI

-000

VŨ ĐỨC LỢI

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ETORICOXIB TRONG CHE PHAM

VA TRONG HUYET TUONG BANG PHUONG PHAP HPLC

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

CHUYEN NGANH: KIEM NGHIEM THUOC - BOC CHAT | MA SO: 60 73 15 NGƯỜI HUGNG DAN KHOA HOC: TS BOAN CAO SON HÀ NỘI - 2010 | ) TRUONG DH DU OC HA NOL SL Ty WIEN 4

a Ngày 3 thang lễ năm 20

Trang 2

LOI CAM ON

Lời đâu tiên tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Đoàn Cao Sơn là người thây đã trực tiếp, tận tình hướng dân, tạo mọi điêu kiện giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thây PGS.TS Trần Đức Hậu là

người đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các cản bộ Phòng Dược lý - Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Uơng, cùng các cán bộ Bộ môn Hóa Dược- Trường ĐH Dược Hà Nội đã tạo điễu kiện giúp đỡ tôi trong quá trình tôi làm thực nghiệm tại đây

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn khích lệ, động viên, giúp đỡ

tôi trong thời gian qua

Hà Nội ngày 8 thang 09 nam 2010

Học viên

Trang 3

MUC LUC Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng số liệu Danh mục các hình vẽ TT eeeeeeeeeisecesdboaaeuaoesondbsorsesh 1

CHƯƠNG LL FONG QUAN easiscccssstccrcsccssnscansssdesnsniercsonssncrsbcasamvaammnestecaess 3

[1L Tông GS hs ce staccctcsscsnnsssasincccicasinacs rastcpramcstonscaeoanmaumnd

1.1.1 Công thức cấu tạo của Elorieoxib - - s2 s: s++E+xe ec+vexxz set 3

1.122 THHỊ GIẢI lỡ HơN uôeaisiedsienekiidisemnasreiemeorseemersersmasesasserE

1.13 Dc động học XávšSv96EE Sốc tóc C6(Gsg600264093u00401328G2013uSXsagiiieyisxat9A4vs0e3 3

LIA, Tite nh tồi oũ GIIẾ Kât đ_NE tua ssaueanokehahifldlbikbdigiigtlaskseagloadsssl 4 hd iS 5 CO GiN ucavianuonrdirdanioibgrtavidiishiusigrsvopirk69VEI110083/616x00901894858360/1600005A4 4

BE CR IG HE sa ceccbuckraniedreotietnntecsirubiinoieiesidgDEcageteransuuei 4

LD, Tele me: Khổng tong NHẪN ssi cwniccrsconnccrsnsnnninareaiunnnsannnoansvenescnsdene 4

Na 1g 1n ng ố eẶ.a 3

ET OE HH Ea ai ago gui n bà hi ghGi0iaEtayGG%2Saá688660166 0606 5

1.2 Một số phương pháp định lượng etgidooxib XeysVztugfEÿ/00»Miozbl03GÀdNGGAG4% ÿqgui 5

1.2.1 Định lượng Etoricoxib bằng phương pháp HPLC - 3

1.2.2 Định lượng Etoricoxib trong huyết trơng bằng phương pháp

LỆ | GÌ -N causxscningiitt55i11016156400660048003060540054421380GG120/800L810a3604/88g0/8-488u40134/ 80023000080 6

1.2.3 Phuong pháp đo quang để định lượng etoricoxib trong chế phẩm

Vi ñ (Ga no cis00dseasliieaceGslEWsiatdis1t0iA0GRSepaisditeqebisuaoee 7

1.2.4 Phương pháp điện đi mao quản vùng (C2ZEÈ) định lượng etoricoxib

trong chế phẩm iliac i wR Ran THEA si ONCE REET aaa maa ENTE 7

1.3 Tổng quan về HPLC _ GIÁO

1.3.1 Khái niệm về sắc tý lỏng hiệu n PHENS CUD sca sscaxccsunssmasenesnasreantaiers 8

12 Neaven the của quả ti ve KĨ ueseesaessansnsnmdniiihpiiiesasdsane ổ

1.3.3 Cơ sở lý thuyết của quá trình sắc ký ¿ c-©c<<c++t+evre2 9

{.34' Cấu tạo của hệ Điễng HĐ LŨ sess ciscx cscs sascavasnupsannsperrsveesnenernasances 9

1.3.5 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc Ký -. - 10

Trang 4

UBF Tee ie CU TH Ea tiaiaasSdsegtansesissobseskiceokiasosasso 14 1.4 Phương pháp xử lý mẫu huyết tương -c<ces«<e<e.e.s v Tổ

LG PHAROS DUG HẦU DEGIEĂcosseisviiiiisoititesiiGivbei850cu833s488060656sã g.e 16 14.2 Phuong phitp chidt tong= IGANG: ccccccsscsscsssccsessvsvinsssvsessanvsssvesensnsass 16

1.5 Tham định phương pháp phân tích =— swstwseaxss:E 1.5.1 Thẩm định phương pháp phân tích thuắc dang chế ie enna 16 1.5.2 Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong huyết tương 18

CHƯƠNG 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1, Ninh 0b 00 T00 T0 Đa aácdgcddieeakseiesaedsoeasauesoLÐg

kT RN TH uc ca66i 00214000 02000101361G4 5360303011008 20

2.1.2 Trang thiết bị, dụng Cụ ¿+ S5 scxeSt SE cerrrkereg 20

2.2 Nội dung nghiên cứu seni sre

2.2.L Xây dựng phương pháp định lượng BloHooudb —— mr wide va

trong huyét NHÍ trưa tdtradtocgotoqgaglisnesagsgstuosvassvsotgaassa 21

2.2.2 Thẩm định phương pháp vừa xây dựng -.-« 2e c 21

2.23 Ung dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng Etoricoxib

tHDNG Chỗ DHĨNM NIÊN NIÌ ¡dua cicng h2 ga 14 dang 8kg bón 2229 00ả654á0k.ểndbskdde 2!

2.3 Phương pháp nghiên cứu fiWiwvloitiufi39305930/0)01656Ắ0180968000146007/ECL

CHUONG 3 KET QUA NGHIEN CUU | ate pCR —=

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng Etoricoxib trong chế phẩm bằng

HÀ ad dgrdibitiiciiosiivvi4ai4046460)88839440i0L6000804563434440446456200A60144 23

3.ä.1 Lụaa chọn bước sóng thÍCh BOD wccnssesscsvesavssstorsseenivecvontivanaswisonncsos 23 3.1.2 Khảo sát chọn thành phần pha động - -c- 5s esvservra 24 3.1.3 Lựa chọn tốc độ KT bu nyredecliionvirigdilitiigtlldtitoijbyfeevguga 25

3.2 Thâm định phương pháp định lượng etoricoxib trong chế phẩm 25

Trang 5

BB PU HH TI issue tcc chi GGg2kuntuasse 47

3.3.3 Giới hạn A: len Qa csssesisicnss spss seine as EE 48 5.010 GORE VA 00 10P Ue ccna 49 TH HH Ea Ýn an Ÿ nh CŸeonoo=l 52 3.5.6 Độ ổn định, - 55 251112151 1121111221121111115111511112111121 E1 cty 53 HƯƠNG BẠN IN ssciecscsssiscrcssserssanecssacionss eetnsncnuaneiaeananiea 59 NI NV KHÍ ŸÝngaaweasssasd 63

THÊ ca evssvoceavioreoeosdi6Esebiosoltksrecpagiuglluipcg0ss in irseyee 63 KT 1 ccna cesta elt tsa ea aa as 64

Trang 6

ACN AUC COX- 2 Crnax Eto FDA HD HPLC HOC HT IS KNTTW LC/MS - LOQ LQC MeOH MQC NSX NSAIDS PA QC RSD : Cục quản lý thuốc và thực phẩm DANH MUC CAC CHU VIET TAT : Acetonitril :_ Diện tích đưới đường cong nông độ - thời gian : Cyclooxygenase- 2 : Nông độ cực đại : Etoricoxib (Food and Drug Administration) : Hạn dùng : Sắc ký lỏng hiéu nang cao (High performance liquid chromatography) : Mẫu kiểm soát có nồng độ cao (Hight Quanlity Control Sample) : Huyét tuong

: Chất chuẩn nội (Internal standard) : Kiểm nghiệm thuốc trung ương

: Sắc ký lỏng khối phổ

: Gới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

: Mẫu kiểm soát có nồng độ thấp (Lower Quanlity Control Sample) : Methanol : Mẫu kiểm soát có nồng độ trung bình (Middle Quanlity Control Sample) : Ngày sản xuât

: Thuốc chống viêm giảm đau hạ sốt không steroid

: Tinh khiết phân tích

: Mẫu kiểm soát (Quanlity Control Sample)

Trang 7

SD SDK tin TB ULOQ UV-VIS : BO léch chuan (Relative standard) : Số đăng ký

: Thời gian bán thải của thuốc (half— lif&)

: Thời gian thuốc đạt nồng độ cực đại trong máu

: Trung bình

: Gidi han dinh lugng trén (upper limit of quantification)

Trang 8

DANH MUC CAC BANG SO LIEU ‘Trang

Bang 1.1 Cac chuong trinh HPLC 5

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thông sắc ký 26 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độ tuyến tính 29 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ chính xác 31 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ đúng 32

Bảng 3.5 Kết quả định lượng etoricoxib trong viên nén Etotab-60 34

Bảng 3.6 Cách pha các mẫu huyết tương 37

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của Etoricoxib trongHT | 47

Bảng 3.8 Kết quả xác định LLOQ 49

Bảng 3.9 Kết quả xác định độ đúng độ lặp lại trong ngày 49 Bảng 3.10 Kết quả xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày 51 Bảng 3.11 Kết quả xác định hiệu suất chiết etoricoxib 52 Bảng 3.12 Kết quả xác định hiệu suât chiết aspirin (IS) 53

Bang 3.13 Két qua x4c dinh dé 6n dinh dung dich chuan géc va

nội chuẩn gốc 54

Bảng 3.14 Kết quả xác định độ ỗn định mẫu huyết tương qua 3

chu kỳ đông — ra dong 55

Bảng 3.15 Kết quả xác định độ ôn định dài ngày của mẫu huyêt| 56 tương

Bảng 3.16 Kết quả xác định độ ôn định autosampler 57 Bảng 3.17 Kết quả xác định độ ôn định trong thời gian ngăn của

mẫu huyết tương 58

Trang 9

DANH MUC CAC HINH VE Trang Hình 3.1 Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch Etoricoxib 10 \ig/ml 24 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu trắng (pha động) 21 Hình 3.3 Săc ký đô mẫu chuẩn Etoricoxib = Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu thử Etoricoxib 28

Hình 3.5 Săc ký đô mẫu thử Etoricoxib có thêm Etoricoxib chuẩn 28

Hình 3.6 Đồ thị biêu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và | ›o

điện tích pic

Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Etoricoxib định lượng 33 Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu thử Etorieoxib định lượng 34

Hình 3.9 Sắc ký đô dung dịch hỗn hợp Celecoxib va Etoricoxib 3

Hình 3.10 Sắc ký đồ dung dịch hén hop Paracetamol va Etoricoxib| 36 Hình 3.11 Sắc ký đồ dung dịch hỗn hợp Aspirin và Etoricoxib 36

Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu huyết tương có etoricoxib và IS được| 39

acid hoá

Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu huyết tương có etoricoxib và IS khơng| 39

được acid hố

Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu huyết tương có etoricoxib và IS được| 40

acid hoá và cô cạn

Trang 10

Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu huyết tương cé etoricoxib va IS được| 41

acid hố và cơ cạn

Hình 3.16 Sắc ký đồ mẫu huyết tương etoricoxib và IS 4] Hình 3.17 Sắc ký đồ mẫu huyết tương etoricoxib va IS, chiết bằng | 42

ethylacetat

Hinh 3.18 Sac ky đỗ mẫu huyết tương etoricoxib và IS, chiết băng 43 điethylether/dichloromethane

Hình 3.19 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng của người 44 Hình 3.20 Sắc ký đồ mẫu huyết tương có chuẩn Eto 100ng/ml 44 Hình 3.21 Sắc ký đồ mẫu huyết tương có chuẩn nội aspirin| 45

1000ng/ml

Hình 3.22 Sắc ký đồ mau huyét tuwong cé ca chudn Eto va chuaén| 45

nội aspirin

Hình 3.23 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng của chó 46 Hình 3.24 Sắc ký đồ mẫu huyết tương thử của chó 46 Hình 3.25 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyên tính giữa nông độ 7

và tỷ lệ diện tích pic Eto/IS

Trang 11

DAT VAN DE

Nhóm thuốc NSAID là một nhóm thuốc hiện nay đang được sử dụng khá

phổ biến ở Việt Nam cũng như trên thé giới Nhóm thuốc được dùng với tác

dụng chống viêm, giảm đau, hạ sốt rất hiệu quả và không gây nghiện như

nhóm thuốc Opiat, những tác dụng này đã được biết đến chính thức ngay từ

những năm 1838 khi Raffaelle Piria (Italia) tinh ché dugc acid acetylsalicylic

từ vỏ cây liễu Hiện nay nhiều nước đã đưa một só thuốc thuộc nhém NSAID

vào danh mục thuốc thiết yếu của quốc gia Tuy nhiên nhóm thuốc này cũng

có tác dụng phụ nguy hiểm trên tiêu hoá như gây loét đạ dày, xuất huyết tiêu

hoá do cơ chế tác đụng của thuốc gây ra Do đó các nhà khoa học đã và đang

tiếp tục nghiên cứu để tìm ra những thuốc mới có tác dụng tốt hơn nhưng hạn chế tối đa các tác dụng phụ này Đó là các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 như

nhóm coxib và phải kể đến thuốc gần đây nhất là etoricoxib

Etoricoxib được nghiên cứu thành công và đưa vào sử dụng trong điều trị

vài năm gần đây nhưng hiện nay thuốc đã có mặt trên 60 quốc gia trong đó có

Việt Nam và ngày càng được sử dụng rộng rãi hơn Vì vậy, việc kiểm soát

chất lượng của thuốc nhập khấu và tiến tới là thuốc sản xuất trong nước là điều quan trọng Mặt khác bên cạnh những ưu điểm của thuốc trên đường tiêu hoá thì thuốc lại có những nhược điểm trên một số cơ quan khác như tim

mạch Vì thế để hạn chế tác dụng phụ và tăng cường hiệu quả sử dụng thuốc

Trang 12

Hiện nay, trong và ngoài nước mới chỉ có một vài nghiên cứu về định

lượng etoricoxib, Dược điển các nước như Dược điển Anh, Mỹ, Việt Nam

cũng chưa có chuyên luận về etorieoxib Một số tác giả có nghiên cứu định

lượng etoricoxib băng phương phap LC/MS, HPLC, CZE, quang phé UV-VIS

[6], [17], [18], [24] [30] Tuy nhiên các phương pháp này sử dụng dung mỗi

đắt tiền hoặc khó áp dụng với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam

Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu định lượng

etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC”

với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng và thẳm định phương pháp định lượng etoricoxib trong chế

phẩm bằng HPLC

2 Áp dụng phương pháp vừa xây dựng dé định lượng chế phẩm chứa

etoricoxib trên thị trường

3 Xây dựng và thấm định phương pháp định lượng eforicoxib trong

Trang 13

CHUONG 1 TONG QUAN Ld Téng quan vé etoricoxib [7], [8], [11], [19], [26] 1.1.1 Công thức cấu tạo của Etoricoxib & O45: O 4.C N Ne NN cl Tén khoa hoc: 5-chloro -2-(6-methylpyridin-3-yl)-3-(4-methylsulfonylphenyl)pyridine Công thức phan tur: CigH,sCIN202S Phán tứ lượng: 358.8 1.1.2 Tính chất lý hoá

Bột mịn, màu trắng Tan ít trong nước và tan tốt trong dung môi hữu cơ

phân cực như methanol, acetonitril, hấp thụ ánh sáng tử ngoại 1.1.3 Dược động học

- Hấp thu: Thuốc hấp thu tốt qua đường tiêu hoá, sinh khả dụng theo đường

uống xấp xỉ 100% Sau khi uống liều 60mg/lần/ngày đạt nồng độ tối đa trong

huyết tương là C„a„ ~1,36 tug/ml với T„ax 1h, nếu uống liều 120mg/lần/ ngày

nông độ tối đa trong huyết tương C„„„2,2big/ml với Tmạ„= 1-1,5h

- Phân bố: Thuốc liên kết với protein huyết tương là 92%, thuốc phân bó rộng

qua được nhau thai và hàng rào máu não

- Chuyển hoá: Thuốc chuyển hoá chủ yếu ở gan tạo thành dẫn xuất 6-

Trang 14

enzym CYP (chu yếu là CYP3A4) và chỉ một phần nhỏ (<1%) của liều đùng được thải trừ ở dạng không chuyên hoá

- Thải trừ: Thuốc thải trừ qua nước tiểu khoảng 70% và qua phân khoảng

20%, thời gian bản thai la ty, ~ 22h

1.1.4 Tac dung va co ché tac dung

- Tac dung: giam dau, chéng viêm

- Cơ chế tác dụng: do thuốc ức chế chọn lọc enzym COX-2, ngăn cản

tổng hợp prostaglandin là chất trung gian hóa học gây viêm, do đó làm giảm

quá trình viêm Do thuốc không ức chế COX-1 nên không gây ra các tác dụng

phụ trên đường tiêu hoá

1.1.5 Chỉ định

- Viêm xương khớp 60mg/ngày

- Cơn gout cấp 120mg/ngày

- Viêm khớp dạng thấp 90mg/ngày

- Đau cấp do phẫu thuật răng 120mg/ngày

- Thống kinh nguyên phát 60mg/ngày

- Đau cơ xương mãn tính 60mg/ngày, liều 120mg/ngày chỉ dùng trong

giai đoạn cấp

1.1.6 Chồng chỉ định

Quá mẫn với các thành phần của thuốc, suy gan nặng, suy thận Cl,; <

30ml/phút, phụ nữ có thai hoặc cho con bú, tiền sử hen, viêm mũi cấp

1.1.7 Tác dụng không mong muốn

- Chóng mặt, đau đầu, rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy, khó tiêu, đau thượng

Trang 15

- Không thường gặp: Phù, tăng trọng, lo lắng, tram cảm, mất ngủ, đị

cảm, ngủ gà, nhìn mờ, ù tai, suy tim, tăng huyết áp

1.1.8 Tương tác thuốc: Tương tác với các thuốc chống đông, lợi tiểu, thuốc

ức chế men chuyển như: acetazolamid, furosemid

1.1.9 Một số chế phẩm

- Lykarecox: viên bao film chứa 120mg etoricoxib, nhà sản xuất: Lyka Labs,

Ltd - An D6

- Etorica: viên nén bao film chứa 60mg, 90mg, 120mg etoricoxib, nha san xuất: Micro Labs, Ltd - Án Độ

- Etotab: viên nén bao film chứa 60mg, 90mg, 120mg etoricoxib, nha san

xuất: Micro Labs, Ltd - An Dé

- Arcoxia: vién nén chita 60mg, 90mg, 120mg etoricoxib, nha san xuat Merck

(Mỹ)

- Tauxib; Algix; Nucoxia: vién nén chứa 60mg, 90mg, 120mg etoricoxib, nhà sản xuât Zydus

1.2 Một số phương pháp định lượng etorieoxib

1.2.1 Định lượng Etoricoxib bằng phương pháp HPLC

Danh mục các chương trình HPLC tham khảo được trình bày ở bảng 1.1 Bảng 1.1 Cac chương trình HPLC Tài | Mẫu liệu | thử Cột sắcký | Điều kiện sắc ký - Pha động: acetomitrile: methanol: dung dịch [29 ] Cột đệm KH;PO¿ 10 mM, pH 3,0 (35:35:30 v/v) Kromasil - Tốc độ dòng: 1 ml/phút Chế 100 Cys - Detector UV ở bước sóng 234 nm phẩm | (250x4,6 mm, | - Thể tích tiém: 20 ul

viên 5um) - Nhiệt độ cột: 250C

nền - Chất chuẩn nội: rofeeoxib - Nồng độ làm việc là: 10 uig/ml

Trang 16

Cột Phenomenex [6] |Ché Luna Cis phẩm | (250x4,6 mm, viên Sum) nén - Pha d6ng: acetonitrile: amoni acetat 0,05 mM, (50: 50 v/v) - Tốc độ dong: 1,5 ml/phut - Detector UV ở bước sóng 235 nm - Thể tích tiêm: 20 pl : Cột Kromasil (20] |Huyết |KR 100-5C;; tương |(46 x 250 mm, 5.1m) - Pha déng: acid formic 0,05 M (pH3)- acetonitrile-methanol- nước (10: 60: 20 : 10, v/v) chay theo chuong trinh gradient - time - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Detector UV ở bước sóng 235 nm - Thể tích tiêm: 100 pl

- Chuan nội la DRF-4367 (2-Hydroxymethyl-4-[5- (4-methox yphenyl)-3-trifluoromethyl-1H-1-pyrazol yl]-1- benzenesulfonamide)

- Mẫu huyết tương xử lý bằng phương pháp

tủa protein với dung môi ACN và cô cạn

đưới dòng khi nito ở dưới 40°C Cột Waters [34] | Huyét | symmetry® tương | Cis (150 x 4,6 mm, 5um) - Pha động: nước/acetomtrile (S8/42, v/v) - Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút - Detector UV ở bước sóng 2§4 nm - Thể tích tiém: 100 ul - Nhiệt độ cột: 25C - Chuẩn nội là Zelaplon

- Mẫu huyết tương được chiết bằng dung

môi diethyl ether/dichloromethane (70/30, v/v) Cột Hypersil BDS Cj (150 [27] | Huyét |x 4,6 mm, 5 tương | um) - Pha động: acetonitril: dung dịch amoni acetat 10mM, pH 4,0 ( 65: 35, v/v) - Tốc độ dòng: 1 ml / phút - Detector UV ở bước sóng 235 nm - Thể tích tiêm: 20 pl - Nhiệt độ cột: 30C

- Chuẩn nội là valdecoxib D

- Mẫu huyết tương được chiết bằng dung

Trang 17

- C6t phonomenex Luna Cj, (50 x 3 mm, 3pm) - Pha động: acetonitril: dung dich amoni acetat 10mM, pH 4,0 ( 95: 5, v/v) - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút - Thẻ tích tiêm: 20 4] - Nhiệt độ cột: 25°C

Điều kiện khối phỗ:

lon hoá bằng hoá học ở áp suất thường (APCI): dùng luồng khí nitơ

- Điện áp dién hoa: 2,5 kV; dién 4p RF: 0,5V

- Nhiét d6 nguén APCI Ia: 120 va 450°C

- Điện áp đỉnh là 65V và năng lượng bắn phá là 35eV - Phân tích dữ liệu băng phần mềm Masslynx

1.2.3 Phương pháp đo quang để định lượng eforicoxib trong chế phẩm

viên nén [24], [35]

Pha dung địch chuẩn và dung dịch thử trong dung dịch HCI 0,1N [35]

hoặc methanol [24], lọc qua giấy lọc rồi đem đo quang Dung địch đem đo

quang có nồng độ khoảng 6 ng/ml, đo ở bước sóng cực đại là À = 233nm

[35] trén may Shimadzu UV-Visible Spectrophotometer (UV-1700), hoặc hax

= 284nm trên máy UV 1601 [24], xây dựng đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ của etoricoxib trong dãy nồng độ từ: 2-

24ug/ml Căn cứ vào đồ thị và độ hấp thụ đo được để tính kết quả hàm lượng

etoricoxib trong chế phẩm

1.2.4 Phương pháp điện đi mao quản vùng (CZE) định lượng eforicoxib

trong chế phẩm [18]

- Sử dụng mao quản chiều đài 40cm, đường kính trong 504m - Hệ đệm: dung dịch tris - phosphat 25mM, pH 2,5

Trang 18

- Điện thế đặt vào 2 đầu mao quan: 25kV - Tiêm mẫu 50mbar trong thời gian 5s

- Bước sóng phát hiện: 234nm với detector PDA

Nhận xét: Phương pháp định lượng etorieoxib bằng sắc ký lỏng khối phổ khá

phức tạp, tốn kém và chưa phù hợp với đa số phòng kiểm nghiệm của Việt

Nam Phương pháp đo quang và điện di mao quản vùng có độ chính xác

không cao và mới áp dụng định lượng etoricoxib dạng chế phẩm, chưa có

nghiên cứu áp dụng phương pháp này để định lượng etoricoxib trong huyết

tương Phương pháp HPLC ở trên sử dụng hệ dung môi còn phức tạp và đắt

tiền Vì vậy chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng HPLC đơn giản,

có độ đúng, chính xác cao và kinh tế, phù hợp với đa số điều kiện của các phòng kiểm nghiệm ở Việt Nam

1.3 Tổng quan vé HPLC [2], [3], [4], [5], [10], [22], [31]

1.3.1 Khai niém về sắc ký lông hiệu năng cao

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di

chuyển của pha động lỏng đưới áp suất cao Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp

phụ, phân bố, trao đồi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tinh sit dụng

1.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký

Pha tĩnh được nhôi vào cột theo một kỹ thuật nhất định Pha tĩnh là yếu

tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký:

- Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay

pha đảo

Trang 19

1.3.3 Cơ sở lý thuyết của quá trình sắc ký

Quá trình phân tách trong phương pháp HPLC là do quá trình vận

chuyển và phân bó chất tan giữa hai pha khác nhau Khi pha động di chuyển

với một tốc độ nhất định sẽ đây các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ trong cột ra

khỏi cột Tuỳ theo bản chất pha động, pha tĩnh, chất tan mà quá trình rửa giải

tách được các chất ra khỏi cột Khi ra khỏi cột mỗi chất sẽ được phát hiện và

ghi lại dưới dạng pic Tín hiệu của cả quá trình sắc ký cho chúng ta sắc ký đồ

Một sắc ký đồ có một hay nhiều pic phụ thuộc vào mẫu có một hay nhiều

thành phân

1.3.4 Cấu tạo của hệ thống HPLC

1.3.4.1 Hệ thống bơm

Bơm có tác dụng đây pha động qua hệ thông với một tốc độ nhất định Có hai loại bơm: - Một là bơm áp suất hằng định, ít được áp dụng

- Hai là bơm tốc độ dòng hằng định, loại bơm này

được áp dụng cho phân tích HPLC thông thường

1.3.4.2 Bình chứa dung môi và hệ thông xử lý dung môi

Bình chứa dung môi thường bằng thuỷ tinh, đôi khi bằng thép không gi

Dung môi cần được lọc loại các hạt (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45 um) va

đuổi khí hoà tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí) Trong

phương pháp thông thường chỉ cần một bình dung môi, trong phương pháp

Trang 20

Để đưa mẫu phân tích vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ thống tiêm mẫu tự động Thẻ tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa

mẫu (tiêm tay) hay microsyringe tiêm trong hệ tiêm mẫu tự động

1.3.4.4 Cột sắc ký

Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký vì ở cột xảy ra quá trình phân tách các chất Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hoá chất, chịu được áp suất cao tới vài trăm bar Trong cột nhồi pha

tĩnh của hệ sắc ký Cột tách có nhiều cỡ khác nhau, tuỳ theo mức độ và mục

đích của quá trình sắc ký Một cột phân tích thông thường dai 10-30cm, đường kính trong 2-5mm

1.3.4.5 Bộ phận phát hiện (Detector)

Là bộ phận phát hiện chất phân tách Tuỳ theo bản chất của các chất

cần phân tách mà sử dụng detector thích hợp Thường có các loại sau:

Detector hấp thụ UV-VIS; Detector khối phổ; Detector huỳnh quang:

Detector điện hoá; Detector tắn xạ bay hơi; Detector đo chỉ số khúc xạ:

Detector đo độ dẫn điện

1.3.4.6 Bộ phận hiến thị kết quả: Computer

1.3.5 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

1.3.5.1 Thời gian lưu tạ và thể tích lưu Vụ

- tạ là thời gian cần để một chất di chuyên từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc

ký tới detector và cho pic trên sắc ký đồ

Trang 21

- Vp la thé tich dung môi đi qua cột cần để di chuyển chất từ nơi tiêm

mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc ký đồ Vp = tex F,

F, là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian 1.3.5.2 Hệ số phân bố K

Là tỷ số giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh và nồng độ của nó trong pha động, thê hiện tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh

C, va Cụ là nồng độ chất tan ở pha tĩnh và pha động tương ứng K phụ thuộc vào: bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ

Trị số K càng lớn thì sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm

1,3.5,3 Hệ số dung lượng k'

Hệ số dung lượng k’ là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyên của

một chất qua cột

k' phụ thuộc : bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc điểm cột, thê tích của pha động và pha tĩnh

Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích

sao cho: l< k`< 8

1.3.5.4 Hệ số chọn lọc ơ: là biểu hiện về mức độ tách giữa hai đỉnh

Trang 22

Để tách riêng hai chất thường chọn ơ = 1,05- 2,0

1.3.5.5 Độ phân giải R,: Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một

cột sắc ký (ví dụ A và B)

Re — 222 —fa.) _ LI8Œm —fm,) _ nha k,

W, +W, Wire +i 4 a l+k',

R, phụ thuộc vào: hiệu lực cột, hệ số chọn lọc a, hé sé dung lượng k'n

Yéu cau R, > 1 Giá trị tối ưu R„= 1,5 1.3.5.6 Hệ số bất đối của pie (AF)

AF= W120

2a

Trong đó: W¡¿o: là chiều rộng của pic được đo ở 1/20 chiều cao của pic a : là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép

đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic

Yêu cầu AF năm trong khoảng 0,9 - 2 1.3.5.7 Số đĩa lý thuyết Ñ 2 2 N=16| | hay N= s44| te | W Ww 1/2 Trong đó:

W: là chiều rộng đo ở đáy pic

W¡„: là chiều rộng đo ở 1/2 chiều cao pic

Số đĩa lý thuyết cho biết hiệu lực tách của cột sắc ký

Trang 23

1.3.6.1 Lwa chon cot (pha tinh)

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhỏi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có nhiều thành phần Pha tĩnh có bản chat là chất rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ

và đường kính cỡ hạt từ 3-10 uum Quá trình sắc ký có thể được thực hiện bởi

nhiều kỹ thuật khác nhau như: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi

ion

Yêu cau ctia pha tinh: phai tro và bền vững với môi trường sắc ký, có

khả năng tách trong điều kiện nhất định, tính chất bề mặt ổn định, cân bằng

động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt, cỡ hạt phải đồng nhát

Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền silica (SiO;), nền oxyd nhôm (Al,O3), nén hop chat cao phan tir (cellulose) hay trén nén mach cacbon Pha

tĩnh trên nên silica có nhiều ưu điểm và được sử dụng nhiều nhất

1.3.6.2 Lua chon pha dong cho HPLC

Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất cần phân tích ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký Pha động là yếu tố thứ hai quyết định

hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp Pha động có thể là nước, dung môi

hữu cơ hay hỗn hợp đung môi theo tỷ lệ nhất định

Yêu cầu: phải trơ đối với pha tĩnh, phải hòa tan được chất mẫu, ôn định

theo thời gian, có độ tinh khiết cao, nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

Trong sắc ký pha thuận thì pha động thường là các dung môi hữu cơ ít

phân cực như: n- hexan, n-heptan, benzen

Trong sắc ký pha đảo thì pha động thường là hệ dung môi phân cực

như: nước, methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng

Trang 24

1.3.6.3 Chon hé dém

Trong sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất

tan có tính acid hay base thường phải cho thêm đệm vào pha động để ồn định

pH cho quá trình sắc ký Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách

Thông thường với các chất tan là acid hữu cơ thì phải dùng đệm pH acid

nhưng cũng có những trường hợp ngoại lệ, còn sắc ký tạo cặp ion thì pH tùy từng trường hợp

1.3.6.4 Tốc độ dòng

Sau khi có pha động, pha tĩnh, pH thích hợp thì cần phải lựa chọn tốc

độ dòng cho pha động để quá trình tách tốt hơn

13.7 Ung dung cia HPLC

Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính:

1.3.7.1 Định tính

Thời gian lưu của chất thử trên sắc ký đồ phải tương ứng với thời gian

lưu của chất chuẩn đối chiếu trên sắc ký đồ

1.3.7.2 Sắc ký điều chế

Trong quá trình sắc ký các chất được tách ra và dịch rửa giải được hứng

riêng rồi bốc hơi dung môi thu lấy chat 1.3.7.3 Định lượng và xác định tạp chất

Trong sắc ký chất muốn phân tích được tách riêng ra khỏi hỗn hợp và

được định lượng dựa vào chiêu cao hay diện tích pic so với chất chuẩn Một

Trang 25

- Phương pháp chuẩn ngoại: cả hai mẫu thử và chuẩn đều được tiến hành sắc ký trong cùng một điều kiện Sau đó so sánh trực trực tiếp chiều cao hay diện tích pic của mẫu thử với mẫu chuẩn Kết quả có thể tính theo cách

chuẩn hóa một điểm hay từ đường chuẩn tuyến tính Công thức tính theo cách

chuẩn hố 1 điểm: Cx=§x C° s

Trong do: Cg, Cx la nong độ mẫu chuẩn và mẫu thử

Ss, Sx là điện tích pic mẫu chuẩn và mẫu thử

- Phương pháp chuẩn nội: là phương pháp cho thêm những lượng giống

nhau của chất chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuân và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký Chất chuẩn thứ hai gọi là

chuân nội

‹ Phương pháp thêm chuẩn: dùng trong HPLC khi có ảnh hưởng của

chất hấp phụ hay quá trình xử lý mẫu phức tạp Mẫu thử được thêm một

lượng chính xác chất chuẩn Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa

trên sự chênh lệch nồng độ và độ tăng của diện tích Với phương pháp thêm

nhiều lần ta có phương pháp thêm chuân ‹ Phương pháp chuẩn hóa diện tich pic:

Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều

cấu tử được tính bằng tỉ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của các pic thành phản

1.4 Phương pháp xử lý mẫu huyết tương [1], [27], [30]

Để xử lý mẫu huyết tương, thường sử dụng Ï trong 3 phương pháp là: chiết

pha rắn, kết tủa protein và chiết lỏng - lỏng Tuy nhiên phương pháp chiết pha rắn thường phức tạp, tốn thời gian và không kinh tế so với 2 phương pháp còn

Trang 26

lại nên trong luận văn chúng tôi khảo sát với 2 phương pháp là kết tủa protein

và chiết lỏng - lỏng

1.4.1 Phương pháp tủa protein

- Tủa bằng acid: thường dùng các acid: percloric, tricloacetic, trifloacetic với

nòng độ khoảng 5-10 %

- Tủa bằng dung môi hữu cơ như: methanol, acetonitril

- Tủa bằng muỗi: hay dùng muối amonisulfat khan

1.4.2 Phương pháp chiết lỏng- lỏng

Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi với những ưu điểm như có thể cô đặc mẫu, địch chiết phù hợp với hệ thống sắc ký và dễ thay đổi dung môi

để có độ chọn lọc cao, hiệu suất chiết cao Tuy nhiên, phương pháp này cũng

có những nhược điểm như các dung môi thường độc hại, bay hơi, đễ cháy nổ

và có thể tạo ra nhũ địch khó xử lý

- Cơ chế chiết lỏng - lỏng: là quá trình phân bó hay hoà tan đồng thời một chất ở 2 pha lỏng không trộn lẫn khi tiếp xúc với nhau Có 3 yếu tố chính

tác động đến quá trình chiết là:

+ Luc Van der waals + Qua trinh solvat hoa + Tuong tac hoa hoc

Sau khi khảo sát, căn cứ vào hiệu suất chiết hoạt chất, độ lặp lại giữa các

lần chiết, thời gian chiết, tính kinh tế để lựa chọn quy trình xử lý mẫu

huyết tương tối ưu nhất

Trang 27

Tiến hành thực hiện với các tiêu chí: tính đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng,

độ chính xác Nội dung thâm định:

1.5.1.1 Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu của một phương pháp phân tích là khả năng xác định duy chỉ chất phân tích trong sự có mặt của các chất khác như: tạp chất, sản phẩm phân

huỷ, chất chuyển hoá Với phương pháp HPLC xác định thông qua sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử

1.5.1.2 Độ tuyến tính và khoảng nồng độ tuyến tính

Là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ đã biết

(x) của chất phân tích trong một khoảng nồng độ xác định Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax + b và hệ số tương quan

tuyến tính r Đường hồi quy phải có dạng đường thăng và giả trị hệ số r phải

nằm trong khoảng 0,99 <r < 1

1.5.1.3 Độ đúng

Độ đúng của một phương pháp phân tích là 1 mức độ gần sát của kết quả

phân tích thu được bởi phương pháp so với giá trị thực Độ đúng phải xác định trên suốt giới hạn nồng độ của nó Cách xác định với trường hợp định

lượng thành phẩm: áp dụng phương pháp phân tích để định lượng hỗn hợp tự

tạo gồm tất cả các thành phần có trong công thức pha chế thuốc (trừ hoạt

chất) Hoạt chất được thêm vào với số lượng đã biết trong toàn bộ khoảng

nồng độ khảo sát Nếu không thể tạo được mẫu thử có đủ các thành phan thi có thể chấp nhận thêm một lượng đã biết của chất phân tích vào thuốc thành

phẩm Độ đúng được xác định bằng phần trăm tìm lại được khi định lượng

Trang 28

từ 98- 102% (với phương pháp phân tích dịch sinh học giá trị trung bình thu được cho phép sai lệch không quá 15% so với giá trị thực)

1.5.1.4 Độ chính xác

Độ chính xác của phương pháp phân tích chế phẩm được đánh giá bằng độ

lệch chuẩn tương đối (RSD) của 6 phép thử song song ở nông độ làm việc

Yêu cầu RSD < 2%

1.5.2 Thắm định phương pháp phân tích thuốc trong huyết tương

Ngoài các tiêu chí độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác tương

tự như trong phân tích chế phẩm thì thầm định thêm các tiêu chí là: độ ỗn định, giới hạn định lượng, hiệu suất chiết

1.5.2.1 Độ ốn định

Độ ổn định của chất phân tích được khảo sát cả trong dung dịch chuẩn gốc

và trong mẫu sinh học, trong điều kiện lấy mẫu, xử lý mẫu và bảo quản mẫu

- Xác định độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc ở điều kiện

nhiệt độ phòng và bảo quản đài ngày trong tủ lạnh sâu

- Xác định độ ồn định của mẫu huyết tương bao gồm:

+ Độ ổn định sau 3 chu kỳ đông - rã đông Một chu kỳ đông - rã đông được

tính kể từ khi để mẫu đông lạnh ở nhiệt độ dự kiến (- 40°C) trong 24h và rã

đông tự nhiên hoàn toàn ở nhiệt độ phòng lặp lại chu kỳ tiếp theo bằng cách

để mẫu đông lại trong vòng 12-24h

Trang 29

+ Độ ổn định thời gian dài, bảo quản mẫu trong tủ lạnh sâu

1.5.2.2 Giới hạn định lượng dưới

Là nòng độ thấp nhất của chất phân tích có thế định lượng được với độ

đúng và độ chính xác cho phép LLOQ được chấp nhận nếu đạt các điều kiện:

Đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 5 lần đáp ứng của mẫu trắng: pic

của chất phân tích phải thấy rõ, riêng biệt và giá trị đáp ứng với độ đúng từ

80-120% và độ chính xác < 20% 1.5.2.3 Hiệu suất chiết

Hiệu suất chiết biểu thị khả năng thu hồi chất cần phân tích khi áp dụng

một kỹ thuật xử lý mẫu trong phương pháp phân tích và được tính bằng tỷ lệ

phần trăm đáp ứng (diện tích pic) chất cần phân tích có trong mẫu qua chiết

tách so với mẫu không qua chiết tách Hiệu suất chiết được xác định trên mức nồng độ (LỌC, MỌC, HQC) với 3 mẫu độc lập ở mỗi nồng độ Hiệu suất

chiết không nhất thiết phải đạt mức cao (100%) nhưng kết quả giữa các lần

chiết phải có độ lặp lại tốt (khác nhau không quá 15%) Không nên sử dụng

phương pháp có hiệu suất chiết thấp hơn 30% hoặc cao hơn 110%

Trang 30

CHƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

- Chất chuẩn etoricoxib hàm lượng 98,06% do Viện KNTTW cung cấp

- Chất chuẩn aspirin hàm lượng 100,08% do Viện KNTTW cung cấp

- Mẫu thử: viên nén Etotab-60, chứa 60mg etoricoxib, nhà sản xuất Micro

Labs., Ltd - Ân Độ, số đăng ký: VN-6743-08

- Huyết tương người do viện huyết học truyền máu trung ương cung cấp - Huyết tương chó (mẫu trắng và mẫu thử) do phòng Dược lý- Viện KNTTW

cung cap

- Methanol, acetonitril dung cho HPLC, acid acetic, acid percloric

- Nước cắt 2 lần dùng cho HPLC 2.1.2 Trang thiết bị, dụng cụ

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX - detector UV — PDA

- Máy quang phổ UV-VIS Lambda EZ210

- Máy siêu âm Sonorex

- May do pH Meter 3305- Jenway

- May loc chan khéng Satorius

- May ly tam Hettich EBA 20

- Máy lắc xoay điện Velp- Zx3

- Can phan tich Mettler 240

- Bình định mức, cốc có mỏ, pipet, đũa thủy tinh, màng lọc 0,45um,

bơm tiêm, lọ đựng mẫu

Trang 31

2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng Etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương

Lựa chọn điều kiện sắc ký: cột sắc ký, bước sóng phát hiện, thành phần và

tỉ lệ pha động, tốc độ dòng, thể tích tiêm, phương pháp xử lý mẫu huyết tương, lựa chọn chuẩn nội

2.2.2 Thắm định phương pháp vừa xây dựng

- Đối với phương pháp định lượng etoricoxib trong chế phẩm cần thẩm định với các tiêu chí sau: độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng

- Đối với phương pháp định lượng etoricoxib trong huyết tương cần thẩm

định các tiêu chí: độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, độ ôn

định, hiệu suất chiết, giới hạn định lượng

2.2.3.Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng Etorieoxib trong chế phẩm viên nén

Tiến hành định lượng mẫu chế phẩm viên nén Etotab-60 để xác định hàm

lượng etoricoxib trong mỗi viên nén này

2.3 Phương pháp nghiên cứu

- Tham khảo các tài liệu liên quan đến phương pháp định lượng Etoricoxib,

đặc biệt là các phương pháp định lượng Etoricoxib bằng HPLC đã công bó - Dựa vào công thức cấu tạo, tính chất hóa lý của Etoricoxib, bằng thực

nghiệm nghiên cứu các điều kiện của chương trình sắc ký và phương pháp xử

lý mẫu đề xây dựng phương pháp định lượng etoricoxib

- Dựa vào tài liệu hướng dẫn về thâm định phương pháp phân tích để thâm

định phương pháp vừa xây dựng

Trang 32

- Phương pháp xử lý số liệu: Các số liệu thực nghiệm thu được xử lý theo

phương pháp xử lý số liệu thống kê

Trang 33

CHUONG 3 KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng Etorieoxib trong chế phẩm bằng

HPLC

Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của Etoricoxib, kết hợp với các tài liệu tham khảo và điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn kiểu

sắc ky HPLC pha đảo, sử dụng cột Nucleosil C18 Trong quá trình thực

nghiệm, chúng tôi đã tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký như: lựa chọn bước sóng, pha động, tốc độ dòng

4.11, Lựa chọn bước sóng thích hợp

Để xác định bước sóng thích hợp phát hiện etoricoxib, chúng tôi tiễn

hành quét phô UV trên máy quang phổ UV-VIS Lambda EZ210

Tiến hành: Cân khoảng 20,0 mg etoricoxib chuẩn cho vào bình định mức 100,0 ml Hoà tan pha loãng bằng methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều Lấy chính xác 1,0 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 20,0 ml, thêm methanol : nước (tỷ lệ 70:30) vừa đủ đến vạch, lắc đều được dung dịch etoricoxib chuẩn có nồng độ khoảng 10 tig/ml

Quét phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch này với dải sóng từ 200-500

nm, cuvet thạch anh dày lem, mẫu trắng là dung môi methanol : nước (tỷ lệ

70:30) Kết quả ghi ở hình 3.1

Trang 34

Abs 0.5 0.0 a | : nm 200 300 400 500

Hình 3.1 Phố hấp thụ tử ngoại của dung dịch Etoricoxib 10 ug/ml

Nhận xét: Phổ hấp thụ của dung dịch etorieoxib chuẩn 10 pg/ml cho

cực đại hấp thụ ở bước sóng 203,5; 234,0; 284,5 nm Để giảm ảnh hưởng của

dung môi và tạp chất nhưng vẫn đảm bảo độ nhạy của phương pháp chúng tôi

chọn bước sóng đo là 234 nm

3.1.2 Khao sat chon thành phần pha động

N

~ ~

Trong phương pháp HPLC pha động hay dùng nhất là methanol,

acetonitril, nước hay hỗn hợp của chúng Chúng tôi đã tiến hành chạy sắc ký

với một số hệ dung môi như: Methanol:nước; Methanol:acetonitri;

Methanol:acetonitril:nước; Acetonitril:nước Chúng tôi nhận thấy hệ dung

môi: methanol:nước và acetonitril:nước cho pic cân đối hơn so với các hệ dung môi còn lại và sử dụng methanol kinh tê hơn acetonitril nên chúng tôi chọn hệ dung môi là methanol:nước Sau khi chọn được hệ dung môi, để cho

pic được sắc nhọn, cân đối hơn nữa, chúng tôi tiễn hành khảo sát pH của pha

động bằng cách chạy sắc ký với hệ dung môi methanol và nước được điều

chỉnh về pH 2,5; 3,0; 3,5 Sau khi tìm được pH thích hợp (pH3), có định pH

Trang 35

đó đẻ khảo sát tỷ lệ giữa các thành phần trong pha động bằng cách phối hợp

methanol và nước với tỷ lệ thay đổi là 60:40; 70:30; 80:20

Kết quả khảo sát cho thấy hệ dung môi methanol: nước (điều chỉnh về

pH 3,0 bằng acid acetic) (tỷ lệ 70:30) là hệ dung môi cho thời gian lưu thích

hợp, pic cân xứng nhất Do đó, chúng tôi chọn hệ dung môi này trong các

nghiên cứu tiếp theo

3.1.3 Lựa chọn tốc độ đòng

Tiếp tục tiễn hành sắc ký với các điều kiện đã chọn ở trên nhưng tốc độ

dòng thay đổi 0,8 ml/phút; 1,0 ml/phút; 1,2 ml/phút nhằm chọn được tốc độ

dòng thích hợp đảm bảo việc phân tách tốt và định lượng Etoricoxib đồng thời rút ngắn được thời gian phân tích

Qua kết quả thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy tốc độ dòng là 1,0 ml/phút cho pic gọn, khá cân đối, thời gian lưu thích hợp nhất Vì vậy, chúng

tôi quyết định chọn tốc độ dòng là 1,0 ml/phút để tiễn hành sắc ký

Vậy từ các kết quả khảo sát trên, điều kiện sắc ký được lựa chọn là: - C6t sic ky Nucleosil C18 (250x4mm, 5pm) - Detector UV: A = 234 nm - Pha d6ng: Methanol : nước (điều chỉnh vé pH 3 bang acid acetic) (70: 30) - Thể tích tiém: 20 pL - Tốc độ đòng: 1,0 ml/phút

- Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng thí nghiệm

(3.2, Thâm định phương pháp định lượng etoricoxib trong chế phẩm

Chúng tôi tiến hành đánh giá phương pháp định lượng Etoricoxib vừa

xây dựng với các chỉ tiêu sau:

Trang 36

- Độ thích hợp của hệ thống sắc ký - Độ đặc hiệu - Độ tuyến tính - Độ chính xác - Độ đúng 3.2.1 Độ thích hợp của hệ thống

Nguyên tắc: Tiến hành tiêm lặp lại 5 lần cùng một dung dịch chuẩn

Etoricoxib vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn Độ thích hợp của

hệ thống HPLC được biểu thị qua hệ số bất đối xứng, độ lệch chuẩn tương đói

RSD (%) của thời gian lưu và diện tích p¡c

Tiến hành: Cân chính xác khoảng 20,0mg chất chuẩn etoricoxib cho

vào bình định mức dung tích 100ml, thêm khoảng 70 ml MeOH, lắc sau đó

thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều Lấy chính xác 1,0ml dung dịch trên

pha loãng với pha động vừa đủ 50,0 ml, lắc đều được dung dịch có nồng độ 4 ug/ml Loc qua mang lọc 0,45 wm được dung dịch chuẩn để tiến hành phân

tích

Tiêm 5 lần mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn Ghi kết quả: thời gian lưu, diện tích và hệ số bất đối của pic tạo bởi Etoricoxib Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký

Thời gian lưu Diện tích pic Hệ số bât đôi

Trang 37

5 5,851 7,461 1,82 TB 5,850 7,383 1,86 RSD(%) 0,16 1,47

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy giá trị RSD(%) của thời gian lưu và diện tích pic Etoricoxib đều nhỏ hơn 2%, các giá trị của hệ số bất đối xứng nằm

trong khoảng cho phép Điều này chứng tỏ hệ thống HPLC này phù hợp cho

phép phân tích định lượng etoricoxIb

3.2.2 Độ đặc hiệu

—

Mục đích: Chứng minh sự có mặt của chất khác hay dung môi pha động không ảnh hưởng đến việc định lượng Etoricoxib

Thực tế khơng có sẵn tồn bộ thành phần viên để khảo sát vì các tá

được trong viên khá nhiều và không có tỷ lệ các tá được trong viên nên chúng tôi tiền hành sắc ký và ghi sắc ký đồ của mẫu trắng (dung môi pha động), mẫu

Trang 39

- Sắc ký đồ của mẫu trắng (dung môi pha động) không xuất hiện pic trong khoảng thời gian phân tích 10 phút

- Sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử có chứa etoricoxib, mẫu thử có

thêm chất chuẩn etoricoxib đều cho Ipic ở thời gian lưu tạ = 5,84 phút

Điều này chứng tỏ phương pháp có độ đặc hiệu cao

3.2.3 Độ tuyến tính

Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với diện tích pic

của etoricoxib bằng cách pha một đãy dung dịch chuẩn etoricoxib có nồng độ

tir 2,6ug/ml dén 5,6ug/ml Sau đó tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chon

Ghi các giá trị diện tích pic đo được ứng với các nồng độ của các dung dịch

trên Kết quả khảo sát độ tuyến tính được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.6

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độ tuyến tính STT l 2 3 4 5

Nong d6 dung dich Eto(ug/ml) | 2,6 | 3,2 | 4,0 4,8 5,6

Trang 40

Nhận xét: Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ Etoricoxib đã khảo sát

(2,6- 5,6ug/m]), có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và

nồng độ của chúng, với hệ số tương quan r = 0,9996 và hầu hết các điểm đều

năm trên đường chuẩn

3.2.4 Độ chính xác

Nguyên tắc: Độ chính xác của phương pháp được đánh giá bằng độ lệch

chuẩn tương đối của 6 phép thử song song (6 lần định lượng 6 mẫu) Xác định ở nông độ làm việc của Etoricoxib là 4,0 ig/ml

Tiến hành:

* Pha mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 20mg chat chuan etoricoxib cho vao bình định mức dung tích 100ml, thêm khoảng 70 ml MeOH, lac sau đó thêm

MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều Lấy chính xác 1,0ml dung dịch trên pha

loãng với pha động vừa đủ 50,0 ml, lắc đều được dung dịch có nồng độ 4

ug/ml Lọc qua màng lọc 0,45m được mẫu chuẩn để tiền hành phân tích

* Pha mẫu thử: Cân xác định khối lượng trung bình của 20 viên chế phẩm, nghiền thành bột mịn Cân chính xác một lượng bột viên đã nghiền mịn tương

ứng với khoảng 20 mg etoricoxib rồi đem pha như với mẫu chuẩn được mẫu

thử nồng độ etorieoxib khoảng 4Iig/ml

Tiến hành sắc ký và ghi sắc ký đồ của 6 mẫu thử đó và mẫu chuẩn

Mẫu chuẩn có hàm lượng: 98,06%; S, = 7,521 (mAU.min)