Đang tải... (xem toàn văn)
PHẦN 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................. I I TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA ĐỀ TÀI Ở TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC .................................................................................. 1 1 Tổng quan về cây Cỏ ngọt .................................................................................... 1 1.1 Giới thiệu chung ............................................................................................ 1 1.2 Phân loại thực vật .......................................................................................... 1 1.3 Nguồn gốc lịch sử và phân bố ....................................................................... 1 1.4 Mô tả thực vật học ......................................................................................... 2 1.5 Thành phần hóa học trong Cỏ ngọt ............................................................... 2 1.6 Một số công dụng và hoạt tính sinh học của cây Cỏ ngọt ............................. 6 2 Tổng quan về nhóm chất steviol glycoside được chiết xuất từ cây Cỏ ngọt ........ 7 2.1 Giới thiệu chung ............................................................................................ 7 2.2 Cấu trúc hóa học của nhóm steviol glycoside ............................................... 7 2.3 Tính chất vật lý của các steviol glycoside. .................................................. 12 2.4 Một số công dụng và hoạt tính sinh học của steviol glycoside đã được nghiên cứu ......................................................................................................... 12 3 Tổng hợp các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước về nhóm chất steviol glycoside từ cây Cỏ ngọt ....................................................................................... 13 iii 3.1 Các nghiên cứu trong nước.......................................................................... 13 3.2 Các nghiên cứu ngoài nước ......................................................................... 13 II LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI ......................................................................................... 16 III MỤC TIÊU ĐỀ TÀI ............................................................................................. 17 IV PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................ 17 1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị ........................................................................ 18 1.1 Nguyên liệu ................................................................................................. 18 1.2 Hóa chất và thiết bị ...................................................................................... 18 2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 19 2.1 Chiết xuất steviol glycoside từ cây Cỏ ngọt ................................................ 19 2.2 Tinh chế steviol glycoside từ cao thô .......................................................... 19 2.3 Kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 20 2.4 Xác định một số hằng số vật lý của steviol glycoside ................................. 21 2.5 Xác định cấu trúc steviol glycoside đã tinh chế .......................................... 22 2.6 Khảo sát hoạt tính sinh học của steviol glycoside đã tinh chế .................... 22 2.7 Khảo sát điều kiện bảo quản dịch chiết steviol glycoside ...........................
BÁO CÁO MÔN HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CHỦ ĐỀ: DITERPENOID DITERPENE GLYCOSIDE – STEVIOSIDE, TRONG CÂY CỎ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA. BERTONI). I.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU. I.1 Giới thiệu và phân loại. Cỏ ngọt Stevia rebaudiana Bertoni là một trong khoảng 145 loài stevia. [1]. Cỏ ngọt Stevia rebaudiana Bertoni,tên thường gọi: cỏ đường, cỏ mật, cỏ cúc, trạch lan. Tên khoa học: stevia rebaudiana. Phân loại khoa học thuộc Giới Angiospermae Lớp: Cây hai lá mầm (Dicotyledons). Nhóm: Monochlamydae. Bộ: Asterales. Họ: Asteraceae. Phân họ: Eupatorieae. Chi: Stevia. Loài: rebaudiana [1]. I.2 Nguồn gốc. Các báo cáo về Cỏ ngọt ( Stevia rebaudiana) đã chỉ ra rằng Stevia rebaudiana đã được biết tới ở Tây Ban Nha từ thế kỷ 16. Nhưng các hiểu biết đó rất mờ nhạt cho đến khi M.S Bertoni phát hiện và đặt tên cho nó là Stevia rebaudiana Bertoni thì nó mới thật sự được chú ý tới [1] (139) . Hiện nay Stevia rebaudiana đã được trồng ở một số quốc gia trên thế giới như Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Indonesia [2] Cây Stevia rebaudiana bắt đầu được du nhập từ Nam Mỹ vào Việt Nam từ năm 1988. Hiện nay, đã có khá nhiều giống cỏ ngọt được trồng và phát triển trên nhiều vùng trong cả nước, từ các tỉnh phía Bắc như Hà Giang, Cao Bằng, Sơn La, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Hà Nội… cho đến các tỉnh phía Nam như Lâm Đồng, Đắc Lắc. Tuy nhiên, mới chỉ có rất ít nghiên cứu về loài cây này tại nước ta.[9] I.3 Đặc điểm thực vật học và thành phần. a. Đặc điểm thực vật. Cỏ ngọt được mô tả thông thường như một loại thảo dược sống lâu năm trong tự nhiên tại Paraguay. Là một cây bụi, chiều cao khoảng từ 50 – 60 cm đến 120 cm. . Phân cành cấp 1 nhiều, chỉ đến khi ra hoa mới phân cành cấp 2, cấp 3. Cành cấp 1 thường xuất hiện ở những nách lá cách mặt đất 10 cm trên thân chính, nhưng khi đốn cành có thể xuất hiện ở trên tất cả các đoạn trên thân. Lá Cỏ ngọt mọc đối theo từng cặp hình thập tự, phiến lá hình trứng ngược, có 12 - 16 răng cưa ở mép. Hoa Cỏ ngọt thuộc loại hoa đầu phức hợp, nhỏ, mọc ở đầu cành hay kẽ lá, ở cuống chùm hoa có hai lá chét nhỏ. [1] b.Thành phần trong Stevia rebaudiana. Thành phần Hàm lượng Protein 6,2 % Lipid 5,6 % Carbohydrate tổng số 52,8 % Stevioside 15% Các chất hòa tan trong nước 42% I.4 Ứng dụng. Stevia rebaudiana là một loài cây có nhiều đặc tính làm nó trở thành một nông sản có giá trị tiềm năng [1]. Nó được sử dụng như một nguồn chất làm ngọt không năng lượng, với độ ngọt cao ( khoảng 200 – 300 lần đường sucrose). Ngoài ra theo nhiều tài liệu Stevia rebaudiana còn có nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe như, kháng khuẩn, giúp cải thiện các bệnh về tim mạch. Nó đã được sử dụng như một cây thuốc dân gian tại Nam Mỹ và trong công nhiệp thực phẩm tại một số quôc gia như Nhật, Mỹ …. [1] II.STEVOL GLYCOSIDES. II.1 Giới thiệu chung về seviol glycosides. Steviol glycosides là các dẫn xuất glycosides của diterpenoid, chúng là một nhóm các chất có độ ngọt cao. Các steviol glycosides chỉ được phát hiện trong một số ít loài cỏ, phân bố chủ yếu ở Paraguay – cỏ Stevia rebaudiana.[4] Cấu trúc chung và công thức cấu tạo của các chất thường gặp trong nhóm Stevol glycosides: Câu trúc chung: [5] Công thức cấu tạo của các steviol glycoside. [5] Tên hợp chất R 1 R 2 Stevioside β-Glc β-Glc-β-Glc(2→1) Rebaudioside A β-Glc β-Glc-β-Glc(2→1) β-Glc(3→1) Rebaudioside B H β-Glc-β-Glc(2→1) β-Glc(3→1) Rebaudioside C β-Glc β-Glc-β-Glc(2→1) β-Glc(3→1) Rebaudioside D β-Glc-β-Glc(2→1) β-Glc-β-Glc(2→1) β-Glc(3→1) Rebaudioside F β-Glc β-Glc-β-Glc(2→1) β-Glc(3→1) Dulcoside A β-Glc β-Glc-α-Rha(2→1) Rubusoside β-Glc β-Glc Steviolbioside H β-Glc-β-Glc(2→1) Trong phạm vi bài báo cáo này xin phép chỉ khảo sát sâu về cấu trúc và thành phần của stevioside – loại diterpene glycoside có hàm lượng cao và được bắt gặp hầu hết trong các loại Stevia Rebaudiana đặc biệt là trên loài Stevia rebaudiana. Bertoni. II. 2 Giới thiệu về Stevioside. Tên theo danh pháp UIPAC: 13-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy] kaur-16-en-18-oic acid, β-D-glucopyranosyl ester.[5] Stevioside là một diterpene glycoside khung ent- kaurene là một thành viên trong nhóm chất Steviol glycosides được chiết từ cây Stevia rebaudiana Bertoni. [6] Stevioside tồn tại ở nhiệt độ phòng dưới dạng các tinh thể không màu, có nhiệt độ nóng chảy cao, tan trong nước ở nhiệt độ phòng, bền với nhiệt độ cao, và ít biến tính trong quá trình gia nhiệt như đun nấu. Một số hằng số hóa lý của Stevioside: [8] Tính chất Giá trị Khối lượng phân tử 840 u Điểm nóng chảy 196 – 198 o C Độ hòa tan trong nước 0.13 % Stevioside là một diterpene glycoside (stevioside và rebaudioside) không chứa năng lượng, dinh dưỡng, có tiềm năng làm chất làm ngọt cao [6] (ngọt hơn sucrose từ 250- 300 lần [7]). Stevioside cùng các chất khác trong nhóm chất Steviol glycoside còn được sử dụng trong chữa bệnh với các tác dụng: chống tăng huyết áp, kháng viêm, kháng ung thư, chống tiêu chảy và điều hòa miển dịch. [7] Công thức phân tử của Stevioside: β – Glc – β Glc (2-1) β – Glc Trong cây Stevia rebaudiana Bertoni, Stevioside chiếm một lượng khá lớn về khối lượng (khoảng 5 – 10 % khối lượng khô) [6]. II.3 Quy trình chiết tách Stevoside. [9] a. 1 kg lá khô Cỏ ngọt sau khi được xay nhuyễn đem trích với 5 lít nước nóng ở 75 o C trong 2 giờ, để tách được tất cả glycosides từ Cỏ ngọt ban đầu. Cô quay dịch chiết nước được 2 lít. (lưu ý: lượng nước đem trích ban đầu càng ít thì càng dễ thực hiện ở các bước sau.) b. Sau đó điều chỉnh pH tới 3 bằng cách thêm acid citric vào và khuấy đều trong 30 phút. Acit citric là một axit hữu cơ đa chức có Càng có khả năng tạo liên kết phối trí với kim loại, protein, chất màu, để loại các thành phần này ra khỏi dịch chiết sau lọc. giử nhiệt độ của dịch chiết không quá 40 o C vì ở nhiệt độ cao với sự có mặt của axit có thể làm thủy phân liên kết glycosid. c. Đem dịch chiết lọc qua Celite để loại màu. Điều chỉnh pH của dịch sau lọc đến 10.5 bằng cách thêm CaO vào vào dung dịch, đăt trong bể điều nhiệt ở 50 o C trong 1 giờ. Sau đó khuấy đều dung dịch và lọc qua Celite. Đến đây ta đã loại được hầu hết protein và chất màu thực vật. d. Dung dịch sau lọc lúc này có màu vàng cam được điều chỉnh pH tới 7.1 với acid citric để trung hòa lượng Ca(OH) 2, đem cô quay đến còn 250 ml. e. Đem dịch chiết đi chiết lỏng lỏng với n-butanol để loại màu và màu vàng của dịch chiết sẽ phân bố trên n-Butanol. Đem đi làm lạnh ở 0 o C qua đêm để thu tinh thể. II.4 Định lượng Stevioside bằng HPLC. [11] a. Mẩu chuẩn Stevioside có đọ tinh khiết trên 95%. b. Pha động : acetonitrile và nước (80:20). Điều chỉnh pH dung dịch tới 3 bằng acid phosphoric. Sau đó lọc qua phễu lọc mini(0.22 µm) c. Dung dịch chuẩn: cho 50mg Stevioside chuẩn vào bình 100ml, cho dung môi pha động vào cho đến vạch. d. Dung dịch mẫu: cho 60mg mẫu vào bình 100ml, cho dung môi pha động vào cho đến vạch. e. Điều kiện sắc ký: - Cột : LC –NH2 (length: 15-30cm; inner diameter: 3.9-4.6 mm) - Pha động : acetonitrile và nước (80:20) - Thể tích tiêm mẫu: 5-10 µL - Đầu dò :UV 210nm - Nhiệt độ cột : 40 o C f. Phổ đồ của Stevioside : ( điều kiện cột tương ứng ) II.5 Phổ NMR của Stevioside.[10] Dữ liêụ phổ NMR của Stevioside : Stevioside Vị trí C/H 13 C-NMR DMSO + d 6 – D 2 O, 75.2MHz 1 H-NMR DMSO + d 6 – D 2 O, 300MHz 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 1” 2” 3” 4” 5” 6” 1’” 2’” 3”’ 4’” 5”’ 6’” 39.95 18.75 37.51 43.34 56.6 21.2 41.1 42.03 53.30 39.13 20.02 35.79 84.8 43.59 47.05 153.51 103.96 28.6 175.62 15.23 96.4 82.58 76.4 70.47 76.23 61.2 104.53 75.24 76.23 69.99 76.92 61 94.2 72.66 77.65 69.8 77.01 60.75 5.09 và 4.77 (2H, m) 1.19 (3H, s) 0.92 (3H,s) 4.53 (1H, d, J 1’,2’ =7.7Hz) 3.30 (1H, t,J 2’3’ =7.7Hz) 3.55-3.45 ,3.70-3.60 (3H,m) 4.47 (1H, d, J 1’,2’ =7.7Hz) 3.09 (1H, t, J 2”,3” =7.7Hz) 3.55-3.45, 3.7-3.6 (3H, m) 5.37 (1H, d, J 1”’,2”’ =7.7Hz) 3.21 (1H, m) 3.55-3.45, 3.7-3.6 (3H, m) III. NHẬN XÉT. III.1 Phương pháp cô lập Quy trình tách chiết trên được chọn vì dễ thực hiện, ít sử dụng các loại dung môi đắt tiền, có khả năng thực hiện ở quy mô lớn với khả năng tách tốt nhóm chất stevioside mặc dù vẫn còn lẫn một số tạp chất nhất định. Sử dụng các phương pháp sắc ký cột để tách sẽ thu được các chất tinh khiết hơn nhưng mất thời gian lâu và hiệu suất không cao. III.2 Phổ MNR PHỔ 1 H-NMR của stevioside cho thấy: - Có hai mũi proton đơn ở δ = 1.19 và δ = 0.92 với cường độ tích phân gần bằng 3, đây là những proton của nhóm methyl mà có C gắn vào C bậc 4 trên khung. - Các mũi đa ở vùng δ < 2 là của proton liên kết với các C bậc 2 và 3 bão hòa của khung ent- kaurene. - Ở δ = 5.09 và δ = 4.77 có các mũi đa, đây là các mũi của 2 proton của nhóm methylene, hai proton cùng gắn trên 1C nối đôi ( vị trí gem) nên có độ dịch chuyển hóa học cao. - Vùng δ từ 3 đến 5.5 có các mũi đôi và ba hơi bầu, đây là các proton trên các nhánh hidroxy của các nhóm Glc, với các mũi đều có hằng số ghép 3 J = 7.7 Hz, vậy tất cả các nhóm thế Glc đều thuộc loại β-Glc ( vì β-Glc có 3 J từ 7 đến 9 Hz). PHỔ 13 C-NMR và DEPT của stevioside cho thấy: - Nhóm carbon hiện mũi vùng δ từ 18 đến 55 thường là các carbon bậc 1 bậc 2 bão hòa (lai hóa sp 3 ) tạo nên bộ khung ent- kaurene của stevioside. - Sự có mặt của 2 nhóm methyl tại δ = 28.6 và 15.23 (C18, C20), nhóm methylene không bão hòa (lai hóa sp 2 tại δ = 103.96 (C17) và nhóm methylene này gắn vào vị trí carbon bậc 4 trên vòng làm carbon này có δ tăng lên đến 153.51 (C16). - Nhóm các carbon bậc 3 và bậc 2 có δ từ 60 đến 105 là các C của các nhóm glycoside vì có nối với oxi dẫn đến tăng độ dịch chuyển hóa học. Ta thấy có 20 mũi tại vùng này, như vậy có 3 gốc Glc ( gồm 18C). - Một mũi C bậc 4 tại δ = 84.8 cho thấy C nối với nhóm thế rút điện tử ( ở đây cụ thể là C13 nối với 2 nhóm Glc liên tiếp bằng liên kết O-glycosidic. Ngoài ra còn 1 mũi C bậc 4 tại δ = 175.62 cho biết đây là carbon ester và đây cũng là C gắn nhóm Glc còn lại (C19). Kết hợp các thông tin, dữ kiện từ các loại phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, HMQC,HMBC, 1 H– 13 C COSY… có thể xác định cấu trúc của stevioside như hình dưới: III.3 Hóa lập thể và cấu hình của khung ent- kaurene: Xét bộ khung cơ bản ent- kaurene, vị trí tương đối của các nhóm thế methyl (C18 và C20) là trans với nhau, các nhóm thế gắn vào C4 và C13 là cis với nhau. Gọi các vòng cyclohexan là A, B, C như hình dưới, ta thấy các vòng A và B trans với nhau, các vòng B và C cis với nhau. Một số hình ảnh về cấu trúc khung ent- kaurene được vẽ bằng phần mềm ChemBio3D: III.4 Tính tan của stevioside Stevioside tan tốt trong các dung môi phân cực như nước, ethanol, methanol… do trên các nhóm thế Glc có nhiều nhóm hidroxy, khi trong các dung môi phân cực tốt, các nhóm hidroxy trên cùng một nhóm Glc có xu hướng xoay ra xa nhau do có thể tạo được liên kết hidro với các phân tử dung môi. Ngược lại, trong các dung môi hữu cơ kém phân cực như chloroform, các nhón hidroxy này có xu hướng quay vào nhau do không thể tạo được các liên kết hidro với dung môi. Hình ảnh các cấu trạng bền của stevioside trong dung môi nước (bên trái) và dung môi chloroform (bên phải)[10]: IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO. [1] K. Ramesh, Virendra Singh and Nima W. Megeji. Cultivation of stevia [Stevia rabaudiana (Bert). Bertoni] acomprehensive review. Advances in Agronomy, Volume 89. 2006, 138 – 148. [2] Venkata Sai Prakash Chaturvedula *, Mani Upreti and Indra Prakash. Diterpene Glycosides from Stevia rebaudiana. Molecules 2011,16, 3552-3562. [3] Sampath Kumar, Lincroft, NJ. Method for recovery of Stevioside. United States Patent. 1986. 8 pp. [4] Stijn Ceunen and Jan M. C. Geuns*. Steviol Glycosides: Chemical Diversity, Metabolism, and Function. Journal of Natural Products. 2013. 76, 1201−1228. [5] FAO. Steviol glycosides. Prepared at the 73 rd JECFA (2010) and published in FAO JECFA Monographs 10 (2010). [6] Akula Ramakrishna and Gokare Aswathanarayana Ravishankar. Diterpene Sweeteners (Steviosides). Natural Products. 2013, 103, 3194 – 3201. [7] Varanuj Chatsudthipong⁎, Chatchai Muanprasat. Stevioside and related compounds: Therapeutic benefits beyond sweetness. Pharmacology & Therapeutics. 2009, 121, 41 – 54. [8] De, Sirshendu; Mondal, Sourav; Banerjee, Suvrajit. Stevioside (Technology, Applications and Health) Introduction to stevioside. Journal of natural products. 2013, 24 pp. [9] Trương Hương Lan, Lại Quốc Phong, Nguyễn Thị Làn, Nguyễn Thị Việt Hà, Phạm Linh Kho, Lê Hồng Dũng. J. Sci. & Devel, 2014. Vol. 12, No. 1 : 73-77. [10] Giorgio Colombo, Sergio Riva, and Bruno Danieli. Remote control of enzyme selectivity: the case of stevioside and steviolbioside. Tetrahedron. 2004. 60, 741–746. [11] FAO. FAO JECFA Monographs 4 (2007). . BÁO CÁO MÔN HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CHỦ ĐỀ: DITERPENOID DITERPENE GLYCOSIDE – STEVIOSIDE, TRONG CÂY CỎ NGỌT. chứa năng lượng, dinh dưỡng, có tiềm năng làm chất làm ngọt cao [6] (ngọt hơn sucrose từ 250- 300 lần [7]). Stevioside cùng các chất khác trong nhóm chất Steviol glycoside còn được sử dụng trong. mô lớn với khả năng tách tốt nhóm chất stevioside mặc dù vẫn còn lẫn một số tạp chất nhất định. Sử dụng các phương pháp sắc ký cột để tách sẽ thu được các chất tinh khiết hơn nhưng mất thời