Kĩ THUẬT DNA sinh học phân tử

Sinh học phân tử là môn Sinh học hiện đại, được giảng dạy ở nhiều trường đại học và đang có những đóng góp nhất định trong đào tạo lớp người có tri thức về Công nghệ sinh học góp phần và

TS CHU HOÀNG MẬU

CƠ SỞ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

Lời nói đầu 4

Chương 1: HỆ GENE 5

§1 KHÁI NIỆM HỆ GENE (GENOME) 5

§2 AXIT NUCLEIC 9

§3 ADN VÀ TÁI BẢN ADN 11

§4 ARN VÀ CƠ CHẾ PHIÊN MÃ 19

THẢO LUẬN 23

Chương 2: ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GENE CỦA SINH VẬT PROKARYOT VÀ EUKARYOT 25

§1 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GENE Ở PROKARYOT 25

§2 CẤU TRÚC PHÂN ĐOẠN GENE Ở EUKARYOT 25

§3 MỘT SỐ TRÌNH TỰ ADN 27

THẢO LUẬN 32

Chương 3: MỐI LIÊN HỆ GIỮA ADN, ARN, PROTEIN 33

§1 THÔNG TIN DI TRUYỀN VÀ MẬT MÃ DI TRUYỀN 33

§2 PROTEIN 39

§3 QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEIN 42

§4 ĐIỀU HOÀ BIỂU HIỆN GENE 45

THẢO LUẬN 49

Chương 4: ENZYME SỬ DỤNG TRONG KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ 50

§1 ENYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME HOẶC ENZYME CẮT HẠN CHẾ (RESTRICTION ENDONUCLEASE - RE) 50

§2 CÁC NHÓM ENZYME KHÁC 57

§3 ENZYME NUCLEASE 60

THẢO LUẬN 61

Chương 5: XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA PROTEIN VÀ ĐẶC TÍNH Ở SINH VẬT 62

§1 MỘT SỐ LOẠI PROTEIN CHỨC NĂNG 62

§2 QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ PROTEIN 66

§3 KĨ THUẬT PHÂN TÍCH PROTEIN 67

§4 KĨ THUẬT PHÂN TÍCH ENZYME 74

§5 NGHIÊN CỨU RIPS BẰNG WESTERN BLOT 77

THẢO LUẬN 78

Chương 6: KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH HỆ GENE SINH VẬT 79

§1 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ADN 79

§2 LAI PHÂN TỬ 83

§3 XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA ADN 85

§4 RFLP TECHNOLOGY (Kĩ thuật phân tích hiện tượng đa hình của độ dài các phân đoạn ADN) 87

THẢO LUẬN 91

Chương 7: PHẢN ỨNG CHUỖI POLIMERASE (POLIMERASE CHAIN REACTION - PCR) 92

§1 PHẢN ỨNG CHUỖI POLIMERASE (PCR) 92

§2 PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CỦA ADN ĐƯỢC NHÂN BẢN NGẪU NHIÊN (RANDQM AMPLIFIED PQLIMORPHIC DAN - RAPD) 99

§4 PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CHIỀU DÀI CÁC PHÂN ĐOẠN ADN ĐƯỢC NHÂN BẢN CÓ CHỌN LỌC 106

THẢO LUẬN 108

Chương 8: TẾ BÀO CHỦ VÀ VECTOR 109

§1 TẾ BÀO CHỦ 109

§2 VECTOR 111

§3 PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN VECTOR TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ 122

THẢO LUẬN 125

Chương 9: PHÂN LẬP GENE TÁCH DÒNG PHÂN TỬ VÀ BIỂU HIỆN GENE 126

§1 PHÂN LẬP GENE 126

§2 TÁCH DÒNG GENE 127

§3 BIỂU HIỆN GENE 139

THẢO LUẬN 151

Tài liệu tham khảo chính 152

những công trình của tác giả cùng các cộng tác viên đã công bố 155

CƠ SỞ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ 162

Lời nói đầu

Sinh học phân tử hiện đại đang phát triển mạnh và đã trở thành nòng cốt của Công nghệ sinh học Ở Việt Nam, thành tựu nghiên cứu Sinh học phân tử và

áp dụng kĩ thuật phân tử trong nghiên cứu Khoa học sự sốngvà Công nghệ sinh học đã có nhiều đóng góg trong việc chăm sóc, bảo vệ sức khoẻ con người; trong đánh giá tài nguyên sinh vật; trong chọn giống và sản xuất nông lâm ngư nghiệp

Sinh học phân tử là môn Sinh học hiện đại, được giảng dạy ở nhiều trường đại học và đang có những đóng góp nhất định trong đào tạo lớp người có tri thức về Công nghệ sinh học góp phần vào sự nghiệp Công nghiệp hoá, hiện

đại hoá Cơ sở và phương pháp Sinh học phân tử được biên soạn từ nhiều tài

liệu, bài giảng và công trình nghiêm cứu mới về Sinh học phân tử hiện đại của các tác giả trong và ngoài nước, nhằm cung cấp những kiến thức cơ bản về nguyên lí và ứng dụng của Sinh học phân tử, làm tài liệu cho nghiên cứu, giảng dạy và học tập môn này ở trường đại học

Cuốn Cơ sở và phương pháp Sinh học phân tử được cấu trúc bởi 9

chương:

Chương 1 Hệ gene

Chương 2 Đặc điểm cấu trúc gene của sinh vật Prokaryot và Eukryot

Chương 3 Mối liên hệ giữa ADN, ARN, Protein

Chương 4 Enzyme sử dụng trong kĩ thuật sinh học phân tử

Chương 5 Xác định mối liên quan giữa protein và đặc tính ở sinh vật

Chương 6 Kĩ thuật sinh học phân tử trong tích hệ gene ở sinh vật

Chương 7 Phản ứng chuỗi polimerase (PCR)

Chương 8 Tế bào chủ và Vector

Chương 9 Phân lập gene, tách dòng phân tử và biểu hiện gene

Tác giả trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Trọng Lạng, TS Lương Thị Hồng Vân đã đọc và góp ý cho bản thảo, xin cảm ơn những đóng góp của Hội đồng nghiệm thu đánh giá giáo trình của trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và cảm ơn các ý kiến đóng góp quý báu của đông đảo các nhà khoa học

Trong quá trình biên soạn chắc chắn có những sai sót, tác giả rất mong nhận được những góp ý của bạn đọc Mọi đóng góp xin gửi về Khoa Sinh - Kĩ thuật Nông nghiệp trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Tác giả

Chương 1: HỆ GENE

Tóm tắt: Sự ra đời của sinh học phân tử được đánh dấu bằng thời điểm mà

Oatsơn và Cric (1953) phát hiện ra cấu trúc ADN Trải qua hơn 40 năm (1953 - 2000) sinh học phân tử đã đạt được những thành tựu vĩ đại mà đỉnh cao của sự phát triển này là những khám phá bản chất sinh học của sự sống ở cấp độ phân

tử và xây dựng các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng váo thực tiễn Geneomics

và Proteomics là vấn đề đang được đặc biệt quan tâm hiện nay mà cơ sở của các lĩnh vực này là những phát hiện về cấu trúc và chức năng của axit nucleic,

về đặc điểm của genome nhân, genome ti thể, genome lạp thể Những điểm khác nhau về cấu trúc và chức năng của các hệ gene cho phép ứng dụng vào thực tế chọn giống và nghiên cứu ở người Cùng với cấu trúc ADN và ARN còn có đặc điểm của quá trình tái bản ADN và phiên mã cũng được quan tâm, vì nó là cơ sở của những kĩ thuật sinh học phân tử - các thao tác ở ADN và ARN Nội dung cơ bản của chương đề cập đến những cơ sở của sinh học phân tử

Nội dung của chương gồm 4 vấn đề cơ bản: (1) Khái niệm hệ gene; (2) Axit

nucleic; (3) ADN vá tái bản ADN, (4) ARN và cơ chế phân mã

§1 KHÁI NIỆM HỆ GENE (GENOME)

Quá trình sinh trưởng và phát triển của sinh vật trải qua rất nhiều giai đoạn và tất cả quá trình đó đều phụ thuộc vào sự điều khiển của các gene Cấu

trúc, chức năng của tế bào được quyết định trực tiếp bởi protein, đó là sản phẩm cuối cùng của sự biểu hiện gene Quá trình thể hiện hoạt động của gene qua

protein, bị ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố ngoại cảnh như ánh sáng, chế độ dinh dưỡng, sự cộng sinh và sự tương tác của các gene trong hệ gene của tế bào Như vậy, giữa các thành phần của hệ gene trong tế bào sống có sự tương tác với nhau và có mối quan hệ với các yếu tố của môi trường Trong tế bào, bên cạnh genome trong nhân, hệ thống di truyền còn phân bố trong lục lạp, ti thể và plasmid (vi khuẩn) Các cơ quan tử này cùng tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein của tế bào Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của các cơ thể sống, tế bào còn là đơn vị của sự di truyền

Hệ gene là toàn hộ các gene trong tế bào của cơ thể sinh vật, hệ gene hứa toàn bộ thông tin di truyền đặc trưng cho từng loài, cho từng cá thể trong loài Ở sinh vật Prokaryot hệ gene gồm toàn bộ các gene trong tế bào; còn ở Eukaryot

hệ gene gồm toàn bộ các gene trong tế bào đơn bội (n) Tế bào đơn bội có một

hệ gene, các sinh vật hoặc tế bào lưỡng bội có hai hệ gene, sinh vật đa bội có nhiều hệ gene Hệ gene của sinh vật Eukaryot bao gồm hệ gene nhân (genome nhân), hệ gene ti thể (genome ti thể), hệ gene lục lạp (genome lục lạp) Hệ gene

ở Prokaryot chỉ có một thành phần gồm các đoạn ADN không giống nhau; còn

hệ gene ở Eukaryot có ba thành phần ADN không giống nhau: Các đoạn ADN lặp lại nhiều (chiếm khoảng 25%), các đoạn ADN lặp lại ít (30%) và các đoạn ADN không lặp lại (45%)

1.1 Hệ gene nhân

Hệ gene nhân là genome lớn nhất trong tế bào xét về mặt khối lượng cũng như số lượng gene mã hoá ADN nhân được sắp xếp gọn trong nhiễm sắc thể trong sự liên kết với protein chứa histone và không chứa histone ADN có vai trò mã hoá thông tin di truyền, còn protein thì bảo vệ và tham gia điều khiển sự sao chép, phiên mã được chính xác Quá trình cơ bản trong phát triển động, thực vật là sự nhân đôi vật chất di truyền và phân đều cho các tế bào con khi tế bào phân chia Tế bào thực vật chứa một lượng lớn ADN, khối lượng này thay đổi

theo loài Arabidosis thaliana có lượng ADN nhỏ nhất (0.07 picogram) Allium cepa có lượng ADN nhiều hơn 33,5 pg/ haploid genome (hệ gene đơn bội)

1.2 Hệ gene lục lạp

Cho đến năm 1962, người ta mới khám phá ra ADN và ribosom có trong lục lạp Như vậy, lục lạp hoặc trong lạp thể chứa tất cả bộ máy cần thiết để tự mình biểu hiện hoạt động gene Hệ gene lục lạp là toàn bộ các gene trong lục lạp hay toàn bộ lượng thông tin di truyền chứa trong ADN của lục lạp

Lượng ADN trong lục lạp rất lớn, chiếm tới 15% tổng lượng ADN cơ thể thực vật, ribosom chiếm 60% lượng ribosom của tế bào, ADN lục lạp được cấu tạo bởi các phân tử có cấu trúc mạch vòng, có trọng lượng phân tử 83 - 128 x

106, trong đó gần 85% phân tử ADN là mạch đơn

ADN lục lạp làm khuôn phiên mã tổng hợp mARN chloroplast Ở đây các phân tử mARN chỉ có khoảng 20 nucleotit, chúng thực hiện sự tổng hợp protein tại chỗ trong chloroplast Ribosom trong chloroplast là 70S bao gồm 30S và 50S Sau khi tổng hợp xong protein được vận chuyển đến nơi mà lục lạp cần thiết

Về cơ bản hệ thống di truyền trong lục lạp tương tự với hệ thống di truyền của sinh vật Prokaryot Do vậy đã có nhiều cuộc tranh luận, có phải vật liệu di truyền của sinh vật tiền nhân là nguồn gốc của ADN lục lạp? Ngoài ra ADN của lục lạp không chứa một số gene đặc trưng cho những sinh vật có nhân thật Điều này đã tìm thấy trong ADN ở thuốc lá và ngô Ribosom của lục lạp cũng giống

ribosom của sinh vật Procariot: 70S được cấu tạo bởi 2 tiểu phần 50S và 30S

Ribosom của E coli và lục lạp thực vật có đặc tính miễn dịch giống nhau

Thông qua việc nghiên cứu sản phẩm biểu hiện gene là protein, người ta

đã phát hiện giữa hệ gene lục lạp và hệ gene nhân trong tế bào thực vật có mối quan hệ chặt chẽ

- Genome của lục lạp không có khả năng tổng hợp tất cả các protein có trong chúng

- Phần lớn polipeptid của lục lạp được tổng hợp do genome trong nhân tế bào

- Những polipeptid này được chuyển vào lục lạp theo cơ chế sau dịch mã thực hiện qua vỏ lục lạp

- Hệ thống di truyền lục lạp điều khiển tổng hợp các protein cần cho sự phát triển của chúng với số lượng khoảng 100 polipeptid

Bảng 1.1 Kích thước một số ADN lục lạp (ct ADN), ADN nhân và vi khuẩn

AND Kích thước (bp) Kích thước vòng (μm)

Trực khuẩn E-coli (chromosome) 3,8 x 106 -

Trùng roi (Euglena) (ct ADN) 1,4 x 105 44 - 44

Thuốc lá (Tabaco) (ct ADN) 1,6 x 105 -

Đậu xanh (mungbean) (ct ADN) 1,21 x 105 39

- Polipeptid được mã hoá tổng hợp và ARN trong lục lạp đảm nhiệm chức năng của cơ quan tử liên quan đến quá trình quang hợp Ở lúa người ta đã xác định được vị trí của các gene quan trọng điều khiển quá trình quang hợp như rbcl, atpBE, pSbA, pstA, psbA Các gene này đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp protein ở hệ thống quang hoá II

1.3 Hệ gene ti thể (Mitochondria Genome)

Để nghiên cứu hệ gene ti thể điều quan trọng đầu tiên là thu được ADN ti thể Có thể lấy ví dụ ở cây lúa theo Salech và cộng sự (1989), phương pháp phân tích ADN trong ti thể gồm các bước sau:

- Li tâm với tốc độ chậm để loại bỏ nhân, lục lạp và các thành phần khác của tế bào

- Li tâm với tốc độ nhanh để tách ti thể

- Li tâm với tốc độ chậm để lấy nhân, lục lạp và các thành phần khác

- Xử lí ADN- ase I để phân giải các chất ADN nhân dính trong ti thể

- Làm sạch ti thể

- Tách chiết mtADN từ ti thể (mtADN)

Như vậy người ta có thể thu được ADN của mitochondria tinh sạch phục

vụ cho các công tác nghiên cứu tiếp theo

mtADN thể hiện một sự khác biệt rất lớn về mặt kích thước và hình dạng Đối với động vật, mtADN có dạng vòng và kích thước xấp xỉ 15 - 20kb Ngược lại mtADN của thực vật có nhiều dạng (vòng.,thẳng vaà(cc dạng khác), cũng như có kích thước lớn hơn nhiều: ở cây bắp cải là 200kb, hoặc ở một loại dưa là

2500 kb Do vậy genome ti thể thực vật tương đối lớn và gồm một vài phân tử ADN Lượng mtADN trong thực vật chiếm khoảng 0,5 - 1% lượng ADN của tế bào nhưng nó đóng vai trò sống còn cho sự phát triển và sinh sản thực vật

Chức năng của mtADN giống như ctADN Nó có khả năng mã hoóatổng hợp một số lượng nhỏ pohlieptid nhưng rất quan trọng.,phục vụ cho những hoạt động của chính nó

Những sản phẩm chính mà mtADN điều khiển tổng hợp là 3 tiểu phần của cytochromoxydaza, 2 tiểu phần của phức chất cytochrom bc và một số thành phần khác (Andre, 1991) Ngoài ra mtADN còn đóng vai trò quan trọng trong hiện tượng bất dục đực tế bào chất (CMS) Đây là một đặc tính được khai thác trong sản xuất các dòng lai ở nhiều cây trồng như lúa, ngô Spruill và cộng sự (1981) đã chỉ ra ở cây ngô có sự khác nhau giữa mtADN trong tế bào cây thường và trong tế bào cây có hiện tượng CMS Khi phân tích sản phẩm protein thì những mtADN ở cây CMS có khả năng tổng hợp chuỗi peptid 130000 MW, nhưng nó mất khả năng tổng hợp chuỗi polipeptid 21000 MW ở nguyên sinh chất tế bào cây bình thường

Mặt khác người ta còn thấy hiện tượng bất dục tế bào chất còn liên quan đến những phân tử ADN giống như plasmid tìm thấy trong ti thể

Chẳng hạn ở ngô trong tế bào chất của cây CMS có mang hai phân tử AND mạch thẳng với kích thước 6,2 kb và 5,2 kb Việc sử dụng code mã hóa tổng hợp protein của mtADN có những điểm cần lưu ý: trong hệ thống hoạt động mã di truyền thông thường code UGA cung cấp tín hiệu kết thúc quá trình tổng hợp một chuỗi polipeptid, nhưng ở ADN của ti thể nó lại là code của tryptophan Ngược lại ở ADN nhân code CGG mã hoá cho tryptophan thì ở ti thể nó lại mã hoá arginin Ngoài ra người ta đã phát hiện một dạng mới của mARN trong genome ti thể cây trồng và nó được gọi là ARN - Editing Đây là một vấn đề thể hiện sự tiến hoá của thực vật bậc cao, giúp cho nó có khả năng

thích nghi hơn với điều kiện ngoại cảnh

§2 AXIT NUCLEIC

2.1 Axit nucleic là vật chất di truyền

Axit nucleic bao gồm axit deoxyribonucleie (ADN) hoặc axit ribonucleic (ARN) đều đáp ứng tiêu chuẩn của vật chất di truyền Có rất nhiều bằng chứng

đã chứng tỏ ra axit nucleic là một vật chất di truyền ở cấp độ phân tử

Axit nucleic hấp thụ tia tử ngoại cực đại ở bước sóng 260nm và điều này phù hợp một cách chính xác với bước sóng mà tia tử ngoại có thể gây đột biến tối đa ở tế bào, trong khi đó protein ở bước sóng 280nm

- Năm 1928 F Grifflth phát hiện thấy nòi phế cầu khuẩn S, khuẩn lạc nhẵn do có vỏ bọc polisaccharid (vi khuẩn gây viêm phổi) của vi khuẩn

Diplococus pneumoniae làm chuột chết khi tiêm vào cơ thể chuột Trong khi đó

khuẩn lạc R (khuẩn lạc không có vỏ bọc polisaccharid) không gây độc hại gì Hỗn hợp các phế cầu khuẩn R còn sống và phế cầu khuẩn S đã chết thì làm cho chuột bị viêm phổi, chết và từ máu của chúng đã phân lập được vi khuẩn S sống Như vậy tác nhân nào đó từ phế cầu khuẩn đã biến nạp và làm cho phế cầu khuẩn R thành S Người ta đã chứng minh được rằng: ADN tách từ vi khuẩn

S nếu được đưa vào vi khuẩn R thì gây nên sự biến đổi kiểu R → S, phát hiện này được khẳng định ADN là vật chất di truyền

Năm 1944 O T Avery, Mc Leod và Mc Carti đã chứng minh được rằng tác nhân biến nạp là ADN Phế cầu khuẩn S bị xử lí bằng protease hoặc ARN-aza thì hoạt tính biến nạp vẫn còn: những nếu phế cầu khuẩn S bị xử lí bởi ADN-aza thì hoạt tính biến nạp không còn nữa

Hình 1.1 Sơ đồ chứng minh vật chất di truyền là ARN

Năm 1957, H Fraen Kel - Conrat và B Singer công bố thí nghiệm ở virut đốm thuốc lá có lõi ARN và vỏ protein, có hai dạng a và b Các thí nghiệm lắp ráp lõi ARN của dạng này với protein của dạng kia và ngược lại đã thành công tạo ra virut có vỏ và lõi thuộc hai dạng khác nhau Sau đó đem gây nhiễm vào

thuốc lá, kết quả các virut con phân lập được từ vết đốm đều mang cả vỏ protein

và lõi ARN thuộc cùng một dạng là dạng của lõi ARN mang nhiễm chứ không phải của vỏ protein Như vậy thông tin di truyền được chứa đựng trong ARN chứ không phải trong protein

2.2 Axit nucleic ở virut, Prokaryot và Eukaryot

Virut là vật chất sống được cấu tạo rất đơn giản, gồm lõi là axit nucleic và

vỏ là protein Vật chất di truyền của virut có hai loại: ADN và ARN Đa số các loài virut đều sống kí sinh, khi xâm nhập vào tế bào vật chủ (có thì toàn bộ virut

hay chỉ A nucleic) Virut sống kí sinh ở tế bào Prokaryot được gọi là phage hay bacteriophage (thực khuẩn thể) Một số virut có lõi là ARN chủ yếu kí sinh ở

thực vật, còn các virut kí sinh ở động vật và tế bào Prokarvot đa số có lõi là ADN

NST phải tạo ra môi trường vật lí để cho phân tử ADN hoạt động, tác động qua lại với các hệ thống trao đổi chất trong tế bào Hệ thống sắp xếp cách

tổ chức, bố trí ADN trong NST ở những tổ chức sinh vật chưa có nhân chính thức và sinh vật nhân chuẩn có sự khác nhau như thế nào? Người ta đã sử dụng

ba hướng chính để nghiên cứu tổ chức ADN trong các đối tượng sinh vật khác nhau, đó là việc sử dụng các thiết bị và kĩ thuật như kính hiển vi điện tử, nhiễu

xạ tia X, xử lí bởi enzyme biến đổi cấu trúc NST

Đối với sinh vật Prokaryot, tổ chức ADN trong NST ở dạng nucleoid (vùng nhân) Vùng nhân chứa ADN và ADN được gấp và cuộn thành nhiều vòng xoắn: ADN ở dạng siêu xoắn, tính chất siêu xoắn chịu sự kiểm soát của

enzyme topoisomerase Ví dụ ở E coli ADN có kích thước 300μ m khi co ngắn kích thước dài 25μm và tiếp tục co ngắn thì kích thước chỉ còn 1,5μm Cách sắp xếp này được phát hiện nhờ enzyme ribonuclease và deoxyribonuclease Prokaryot chứa ADN trần, chuỗi kép, dạng vòng, ngoài ra vật chất di truyền còn

ở plasmid (chiếm l-2%) E coli chỉ có 1 phân tử ADN dạng vòng chứa

H3, H4 Trong đó có 2 phân tử H3, 2 phân tử H4 liên kết với ở vùng trung tâm;

2 phân tử H2A, 2 phân tử H2B liên kết ở vùng ngoài

Các nucleosome nối với nhau bằng một đoạn nucleotit (ADN) dài 15 -

100 cặp nucleotit NST có cấu trúc xoắn theo nhiều bậc: tập hợp nhiều nucleosome thành sợi cơ bản có cấu trúc xoắn (100Å), sợi cơ bản tiếp tục xoắn thành solenoit (sợi nhiễm sắc) có đường kính là: 250Å: solenoit cuộn xoắn lần nữa tạo nên ống rỗng có đường kính 2000Å; ống rỗng này cuộn xoắn một lần nữa thành sợi chromatit có đường kính bằng 6000Å

§3 ADN VÀ TÁI BẢN ADN

3.1 Đặc điểm cấu trúc của phân tử ADN

Hàm lượng ADN trong nhân tế bào đặc trưng cho từng loài và phụ thuộc

và số lượng nhiễm sắc thể trong nhân ADN là đại phân tử, có khối lượng và chiều dài rất lớn Ở sinh vật Prokaryot mỗi nhiễm sắc thể có thểcó nhiều phân tử ADN, còn ở sinh vật Eukaryt mỗi nhiễm sắc thể chỉ có một phân tử ADN

Bảng 1.2 Hàm lượng ADN của một số loài sinh vật

1 picogram (pg) ADN = 0,965 10 9 bp = 6,1.10 11 dalton = 29cm

Người ta đã phân biệt các dạng ADN là B, A Z, C, D Các dạng AND

khác nhau bởi chiều xoắn, chiều cao một chu kì xoắn, số cặp nucleotit trong một chu kì

Bảng 1.3 So sánh đặc điểm của một số loại AND

Dạng

AND

Chiều xoắn

Số cặp nucleotit chu kì

Góc xoắn (0)

Đường kính (Å)

Chiều cao một chu kì xoắn

Dạng thiết điện

Oatsơn và Cric (1953) đã xây dựng mô hình B-ADN (phổ biến nhất), đó

là chuỗi xoắn kép gồm 2 mạch polinucleotit xoắn theo chiều từ trái sang phải

Mô hình của Oatsơn và Crick đã lí giải được những chức năng cơ bản của ADN

là bảo đảm cho việc tái sinh trong quá trình tự sao chép ở gian kì và điều chỉnh

việc tổng hợp các enzyme và các protein Đây là mốc thời gian đánh dấu sự ra

đời của ngành sinh học phân tử

ADN và ARN đều là những polime gồm nhiều monomer nối với nhau,

mỗi monomer gọi là nucleotit (ở ADN gọi là deoxynucleotit, còn ở ARN là

ribonucleotit) Mỗi deoxynucleotit và ribonucleotit gồm 3 thành phần bazơ nitơ (

purin và pirimidin) đường pentose và axit photphoric

Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo phân tử đường deoxyribose và ribose

Các bazơ purin (kích thước khoảng 7Å) gồm Adeine (A); Guanine (G);

còn các bazơ pirimidin (kích thước khoảng 5Å) gồm Thymine (T); Cytosine (C);

Uracil (U)

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc của các loại bazơ nitơ

Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo các deoxynucleotit

Kết quả nghiên cứu của Chargaff về phân tích hàm lượng bazơ purin và pirimidin trong ADN thấy rằng tỉ lệ Adenine bằng Thymine và tỉ lệ Guanine bằng Cytosine (A = T; G = C)

ADN gồm hai chuỗi polinucleotil, mỗi mạch polinucleotit có nhiều nucleotit liên kết với nhau bằng mối liên kết phosphodieste Các bazơ đối diện trên hai mạch đơn liên kết với nhau bằng mối liên kết hydro theo nguyên tắc bổ sung (A - T; G - C) Hai mạch polinucleotit của ADN có chiều ngược nhau:

3'OH ⎯ ⎯→ 5'P

5'P ⎯ ⎯→ 3'OH

Tính đặc trưng của phân tử ADN phụ thuộc vào 3 yếu tố: số lượng, thành phần và trình tự sắp xếp các nucleotit trong ADN, trong đó phụ thuộc nghiêm ngặt vào trình tự các nucleotit

Kích thước của phân tử ADN được tính bằng bp (base pair- cặp bazơ) hoặc kb (kilobase - kb = 1000 bp), vì tính đặc hiệu của nucleotit là do bazơ, cho nên khi nói đến axit nucleic thì bazơ thường được dùng thay cho nucleotit

Hình 1.5 Sơ đồ chuỗi polinucleotit của B-ADN 3.2 Tái bản ADN

3.2.1 Các kiểu tái bản ADN

Người ta đưa ra 3 giả thuyết về các kiểutái bản ADN:

Kiểu bảo toàn: Chuỗi ADN mẹ giữ nguyên, ADN mới được tổng hợp từ

nguyên liệu (chưa có bằng chứng trong tự nhiên)

Kiểu phân tán: ADN ban đầu đứt ra từng đoạn nhỏ, mỗi đoạn nhỏ làm

khuôn để tổng hợp các đoạn nhỏ khác Các đoạn nhỏ nối lại với nhau thành ADN

Kiểu bán bảo tồn: Meselson và Stahl chứng minh 1958 ở E coli sử dụng

đồng vị phóng xạ N15

Mathew Meselson và Franklin Stahl (Mỹ - California) tiến hành thí

nghiệm nuôi E Coli với nguồn N15, đã chứng minh được cơ chế tái bản ADN

3.2.2 Hệ enzyme tái bản ADN

• Ba loại enzyme ADN-polimerase ở E Coli

- ADN-poIimerase I: giữ vai trò trong tái bản ADN, có thể dễ sửa chữa

- ADN-poIimerase II: xác định sự bắt đầu tổng hợp ADN

- ADN-poIimerase III: điều khiển tổng hợp ADN, thực hiện nhiệm vụ chủ yếu gia tăng chiều dài của một sợi mới

• Ba loại enzyme ADN - polimerase ở Eukaryot

- ADN-polimerase (120.000 - 300.000 dalton) có chức năng tái bản ADN của nhân

α

- ADN-polimerase β (30.000 - 50.000 dalton) sửa đổi ADN

- ADN-polimerase γ (150.000 - 300.000 dalton) tái bản hệ gene ti thể

3.2.3 Cơ chế tái bản ADN theo Okazaki -Tái bản nửa gián đoạn

(Semidiscontinous replication )

3.2.3.1 Hiện tượng duỗi xoắn

Hiện tượng trên có sự tham gia của một loại protein là SSB (Single Strand Binding) bám vào sợi đơn ADN luôn ở trạng thái mở xoắn, mỗi SSB bám vào 8 bazơ và mỗi chạc tái bản có 250 SSB

3.2.3.2 Khởi đầu tái bản bằng ARN mồi (primer)

ARN polimerase hoạt động tổng hợp đoạn ARN mồi ngắn tạo ra đầu

3'OH tự do, sau đó ADN polimerase III hoạt động tái bản Đối với E coli primer

được tạo ra bởi enzyme primase

3.2.3.3 Kéo dài, loại bỏ mồi và hình thành các phân đoạn Okazaki

Sau khi ARN mồi được tổng hợp, thì ADN-polimerase I hoạt động loại

bỏ mồi nhờ cắt từ (5' - 3') và thay vào đó là một đoạn ADN mới (hình thành phân đoạn Okazaki) Mỗi phân đoạn Okazaki có 1000 - 2500 bazơ Các phân đoạn Okazaki nối với nhau bằng ADN-ligase Sợi ADN mới được tổng hợp bằng cách nối các phân đoạn okazaki được gọi là sợi ra chậm (lagging strand) là sợi được tổng hợp không liên tục (gián đoạn); sợi kia được tổng hợp liên tục trên khuôn của sợi ADN có chiều 3' - 5' Cơ chế tái bản ADN có một sợi được tổng hợp liên tục và một sợi được tổng hợp gián đoạn được gọi là tái bản nửa gián đoạn

- Mạch ADN mới được tổng hợp theo chiều 5' - 3', một mạch polinucleotit được tổng hợp liên tục và một mạch được tổng hợp gián đoạn- Mỗi bước của

quá trình tái bản đều có sự tham gia của các loại enzyme tương ứng

- Quá trình liên kết với các nucleotit thực hiện theo nguyên Ltc bổ sung (A - T, G - C )

- Có sự tham gia của primer (ARN mồi)

- Mỗi ADN con được tạo thành đều chứa một mạch cũ và một mạch mới (bán bảo tồn)

Hình 1.6 Tái bản ADN theo Okazaki

3.2.4 Tái bản ADN của virut

- Các phage (virut kí sinh ở vi khuẩn) mang ADN 1 sợi hoặc 2 sợi, virut ARN có loại ARN 1 sợi và cũng có thể mang ARN 2 sợi

- Cơ chế tái bản ADN 1 sợi ở virut Φ x 174 (nghiên cứu nhiều nhất) kí sinh ở vi khuẩn E coli (hình 1.7)

Hình 1.7 Tái bản ở virut Φ174

Chỉ có sợi (+) được tái bản và chỉ có 1 trong 2 sợi trong RF làm khuôn tổng hợp ra sợi (+)

3.2.5 Tái bản ADN ở tế bào của sinh vật Prokaryot

3.2.5.1 Tái bản ADN vòng ở Prokaryot

Ở E coli, quá trình tái bản xuất phát từ một điểm ori (origine) được gọi là điểm xuất phát và triển khai ra cả hai phía Ở E coli chỉ có một điểm xuất phát

sao chép ori nên cả ADN thành một đơn vị sao chép (replicon) Prokaryot thường chỉ có một replicon (hình 1.8)

Hình 1.8 Đơn vị tái bản (replicon) ở Prokaryot

3.2.5.2 Tái bản kiểu lăn đai thùng (Rolling circle )

- E coli F+ và F- tiếp hợp Yếu tố F được truyền từ F+ sang F- và F- biến thành F+, ADN vòng plasmid được tái bản theo kiểu lăn đai thùng tạo thành ADN vòng mới ở tế bào nhận F-

Hình 1.9 Tái bản kiểu lăn đai thùng (rolling circle)

3.2.6 Tái bản ở tế bào của sinh vật Eukaryot

Ở sinh vật Eukaryot sự sinh sản của tế bào là một quá trình sinh trưởng phân nhân và phân bào mang tính chu kì, quá trình đó được gọi là chu kì tế bào

(cell cycle) Chu kì tế bào gồm 4 pha:

Pha G1 (Gap 1) tiếp sau pha phân chia, nhiễm sắc thể tháo xoắn trở về

dạng sợi mánh và xảy ra quá trình tổng hợp các chất cho sự nhân đôi ADN và diễn ra hàng loạt các biến đổi dẫn đến khởi đầu cho sự sao chép ADN

Pha S (Synthesis): vật chất di truyền của chất nhiễm sắc được nhân đôi,

đó là quá trình tái bản ADN, các bằng chứng đã chứng tỏ rằng sao chép ADN của sinh vật nhân chuẩn cũng diễn ra theo kiểu nửa gián đoạn như ở sinh vật nhân sơ Các enzyme cần thiết cho sự sao chép ADN của sinh vật nhân chuẩn bao gồm nhóm ADN-polimerase có ADN polimerase α, ADN-polimerase và ADN-polimerase Theo quan niệm hiện nay, ở các sinh vật nhân chuẩn bậc cao nói chung - polimerase được sử dụng sao chép ADN của nhân, β-polimerase hoạt động như enzyme sửa chữa,

β γ

α

γ-polimerase chuyên trách sao chép ADN ti thể

Hình 1.10 Các sự kiện diễn ra ở mức phân tử trong chu kì tế bào

M Pha phân chia

G1: Pha sau phân chia, chuẩn bị tổng hợp các chất, chuẩn bị tổng hợp ADN

S: Pha tổng hợp trong đó diễn ra quá trình tái bản ADN

G2: Pha trước khi phân chia tế bào, trong đó diễn ra tổng hợp tubulin và cubuin

1 Bắt đầu phân chia; 2 Kết thúc phân chia;3 Xuất hiện nhân tố cảm ứng tổng hợp ADN

Ở sinh vật nhân chuẩn, mỗi NST có nhiều đơn vị sao chép (Replication Unit) còn gọi là replicon, mỗi replicon có một điểm khởi đầu và hai điểm kết thúc quá trình sao chép Các NST của sinh vật nhân chuẩn bao gồm ADN và histon cùng nằm trong thể nhân Những bằng chứng cho thấy các gene mã hoá histon sao mã tạo ra các bản sao để tổng hợp số lượng histon cần thiết cho sự hình thành các thể nhân mới trong pha S

Pha G2 (Gap 2): các nhiễm sắc thể chuẩn bị cho nguyên phân Một sự kiện quan trọng trong G2 là nơi tổng hợp protein tubulin, cubulin được trùng hợp hoá

để tạo ra các vi ống của bộ máy thoi sắc để phân li các NST trong nguyên phân

Pha M (Mitosis): Diễn ra quá trình nguyên phân của tế bào, đặc điểm cơ bản của nguyên phân là có những biến đổi lớn về chức năng và cấu trúc của tế bào

Ở Eukaryot có số lượng ADN lớn, tái bản ADN phức tạp hơn và tốc độ chậm (50 nucleotit/giây) Tái bản của Eukaryot có nhiều replicon và nhiều điểm ori

3.2.7 Sửa sai trong tái bản

Hướng sao chép ADN thực hiện theo chiều từ 5'-3' và hướng sửa chữa sai sót trong tái bản lại diễn ra theo chiều từ 3'-5' Enzyme ADN-polimerase I, III có hoạt tính của exonuclease (enzyme có hoạt tính cắt nucleotit ở đầu tự do của ADN), nếu có nucleotit lắp sai thì ADN-polimerase sẽ cắt bỏ nucleotit sai đó theo hướng 3'-5'

Hình 1.11 Tái bản ở Eukaryot (nhiều replicon)

Trong trường hợp ADN ở trạng thái không tái bản thì có xấp xỉ 20 loại enzyme rà soát dọc các NST để tìm ADN có biến đổi cấu trúc, 5 enzyme kiểm soát sự sai sót của liên kết hoá trị, một số enzyme khác phát hiện sai sót bắt cặp giữa các bazơ không bổ sung Tổng số có xấp xỉ 50 enzyme chuyên phát hiện và sửa các sai sót trong ADN

§4 ARN VÀ CƠ CHẾ PHIÊN MÃ

4.1 Cấu trúc và chức năng của ARN

ARN tổng số trong tế bào

ARN vận chuyển - ARN hoà tan (tARN; sARN): Cấu tạo từ một mạch poliribonucleotit, có khoảng 75-100 ribonucleotit, khối lượng phân tử 26000 dalton Hàm lượng tARN chiếm khoảng 10-20% ARN tổng số Phân tử tARN

có cấu trúc xoắn tạo ra các thùy tròn, một thùy mang bộ ba đối mã, một thùy nhận biết enzyme gắn với axit amin ở một đầu tARN Một đầu mút mang axit amin kết thúc là ACC, còn đầu mút kia là GGG Chức năng của tARN là kết hợp với axit amin để tổng hợp protein Phân tử tARN có 2 chức năng trong sự tham gia tổng hợp protein là tiếp nhận và liên kết

Hình 1.12 Mô hình cấu trúc không gian và cấu trúc phân tử của tARN

ARN ribosom chiếm phần lớn trong tế bào, khoảng 80% hàm lượng ARN tổng số Các phân tử rARN cùng với protein cấu tạo nên các ribosome Bản chất hoá học của ribosome là nucleoprotein, gần 36% protein và 64% rARN

4.1.2 Cấu trúc của ARN

Các loại ARN đều chỉ có một chuỗi poliribonucleotit, mỗi ribonucleotit gồm 3 thành phần (H3PO4; C5H10O5; bazơ nitơ: A, U, G, C) Các ribonucleotit liên kết với nhau bằng mối liên kết phosphodieste, để tạo thành chuỗi poliribonucleotit, có chiều 5' 3' →

Tất cả các loại ARN đều được tổng hợp từ khuôn mẫu của ADN và chỉ có cấu tạo sợi đơn Phân tử ARN của virut là genome của chúng, có chức năng duy trì và truyền đạt thông tin di truyền Riêng các retrovirut mang ARN sợi kép

4.2 Cơ chế phiên mã

4.2.1 Phiên mã ở sinh vật nhân sơ

4.2.1.1 ARN-polimerase của sinh vật nhân sơ

Ở E coli, ARN-polimerase có hệ số lắng 11S - 13S và khối lượng phân tử

500.000 dalton; từ enzyme ARN polimerase nhân tố sigma ( ) có thể kết hợp σ

với enzyme lõi khác

Hình 1.13 Enzyme ARN -polimerase

Nhân tố σ đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp ARN, nó giúp cho

enzyme lõi có thể khởi đầu tổng hợp ARN tại những điểm đặc thù - gọi là điểm khởi đầu (promotor), nếu thiếu nhân tố ơ thì quá trình tổng hợp ARN sẽ xảy ra ở

điểm ngẫu nhiên trên phân tử ADN

Đoạn nhận biết (recognition sequence) gồm 35 cặp bazơ nằm trước điểm khởi đầu promotor Đoạn để ARN-polimerase nhận biết là đoạn gồm 7 nucleotit được gọi prinow, nằm cách điểm phiên mã 5 - 6 bazơ Hộp prinow trên sợi đối khuôn (antitemplate) có công thức chung là: 5' TAT phun AT purin 3'

4.2.1.2 Các giai đoạn của quá trình phiên mã

Quá trình phiên mã của Prokaryot bao gồm 3 bước: khởi đầu, kéo dài và kết thúc

1) ARN-polimerase lõi cùng nhân tố ơ nhận biết và bám vào trình tự khởi động (promotor) ADN polimerase trượt dọc gene (3' - 5') xúc tác biến tính cục bộ 2 sợi ADN lộ ra sợi khuôn tổng hợp ARN

2) Quá trình tổng hợp ARN bắt đầu và sợi ARN được sinh ra theo chiều 5' - 3'

3) Đoạn kết thúc ra tín hiệu cho ARN-polimerase dừng phiên mã Đoạn kết thúc gồm 2 phần: phần có tỉ lệ GC cao và một loại bazơ T trên sợi antitemplate

4.2.1.3 Đặc điểm

Sản phẩm của quá trình phiên mã là sợi đơn ARN

ADN dãn xoắn cục bộ, chỉ có 1 sợi làm khuôn tổng hợp ARN và được gọi

là sợi có ý nghĩa (strand sense)

Nguyên liệu là các ribonucleotit triphotphat : ATP, GTP, CTP, UTP gọi chung là NTP, enzyme xúc tác là ARN-polimerase

ARN được tổng hợp theo chiều 5' - 3', enzyme ARN-polimerase di chuyển theo chiều 3' - 5' trên sợi strand sense

4.2.2 Phiên mã ở sinh vật Eukaryot

4.2.2.1 ARN polimerase

• ARN-poIimerase I: enzyme không bị ức chế bởi a-amanitin (chất ức chế tổng hợp ARN), chuyên trách việc phiên mã các gene để tổng hợp rARN (28S, 58S và 18S)

• ARN-polimerase II: enzyme bị ức chế bởi α - amanitin, nó cần cho tổng hợp mARN

• ARN-polimerase III: enzyme bị ức chế bởi α - amanitin ở nồng độ cao, phiên mã tổng hợp các tARN 4S, rARN 5S

4.2.2.2 Các đoạn kiểm soát phiên mã

Hộp TATA hoặc hộp Goldberg - Hogness ở vị trí cách cặp bazơ đầu tiên

được phiên mã khoảng 30 cặp bazơ về phía trước được coi là đoạn khởi đầu Đoạn kết thúc còn nghiên cứu ít, đoạn kết thúc không dài hơn 21 bazơ, ở nấm men có trình tự là: TTTTATA

4.2.2.3 Các giai đoạn của quá trình phiên mã ở Eukaryot

• Giai đoạn khởi động: chịu sự kiểm tra của một trình tự đặc biệt đó là "hộp TATA" (TATA box) nằm trước vị trí bắt đầu phiên mã khoảng 25 - 35 nucleotit ARN-polimerase II hoạt động phiên mã nhờ nhiều nhân tố TF

có bản chất là protein (trascription factor) cho phép khởi động sự phiên

mã

• Giai đoạn kéo dài: phân tử ARN được tổng hợp từ mạch khuôn ADN Quá trình này nhờ nhân tố TF IIS

• Giai đoạn kết thúc: phiên mã kết thúc trước điểm gắn đuôi poli A rất xa

Kết thúc phiên mã có liên quan đến cấu trúc kẹp tóc tiếp ngay sau trình tự

giàu GC

4.2.2.4 Diễn biến quá trình phiên mã

1) Gắn chóp: khi pre mARN đang tạo ra dài 20 - 30 bazơ thì ở đầu 5'P nối thêm 7-methylguanosine liên kết 5'P - 5'P Bản phiên mã đầu tiên là tiền mARN gồm cả exon và intron

2) Thêm đuôi poli A: một đoạn ngắn của mARN bị cắt ra và các bazơ adenine nối vào thành đuôi poli A

3) Splicing: cắt rời các intron và nối các exon nhờ phức hợp ribonucleoprotein (SnRNP) của nhân, tạo cấu trúc không gian thuận tiện cho các đầu exon gần nhau và xúc tác phản ứng cắt nối hình thành ARN trưởng thành

Hình 1.14 Sơ đồ các giai đoạn của quá trình phiên mã ở Eukayot

4.2.2.5 Đặc điểm của sự phiên mã ở Eukaryot

• ARN-polimerase II chịu trách nhiệm tổng hợp mARN, còn 2 loại enzyme khác tổng hợp rARN và tARN

• mARN, rARN và tARN chứa thông tin ở dạng bản sao của một gene

• Quá trình phiên mã phức tạp, ở đầu 5' của mARN có gắn thêm 1 "chóp" (cap: chóp, chụp đèn) là 7-methylguanosine, còn cuối mARN có "đuôi" poliadenine dài 100 - 200 A Chóp - Methylguanosine và đuôi poliA có tác dụng bảo vệ ARN, ngoài ra đuôi poliA còn là tín hiệu nhận biết mã kết thúc trong quá trình dịch mã

Bản phiên mã đầu tiên là tiền mARN (premessager ARN-Pre-ARN) bao gồm cả các đoạn intron và exon, sau đó sau đó các intron bị cắt bỏ tạo thành mARN trưởng thành

THẢO LUẬN

1 Phân biệt các khái niệm: genome, genome nhân, genome ti thể, genome

lạp thể

2 Đặc điểm về vật chất di truyền của Virut, Prokaryot, Eukaryot

3 Vấn đề cấu trúc của hệ gene ti thể Những ứng dụng nghiên cứu hệ gene ti

thể ở cây trồng và ở người

4 Đặc điểm cấu trúc và chức năng của ADN và ARN

5 Cơ chế tái bản của ADN Tái bản ADN ở Virut, Prokaryot, Eukaryot Tái

bản ADN và tại sao trong tái bản ADN lại cần phải có primer? Tại sao primer là một trình tự ARN?

6 Đặc điểm của cơ chế phiên mã ở Prokaryot, Eukaryot Vấn đề phiên mã

ngược và ứng dụng trong thực tiễn

Chương 2: ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GENE CỦA SINH VẬT

PROKARYOT VÀ EUKARYOT

Tóm tắt: Những thao tác trên gene được dựa trên cơ sở những hiểu biết về đặc

điểm cấu trúc của gene Gene ở nhóm sinh vật Prokaryot và nhóm Eukaryot có những đặc điểm cấu trúc đặc trưng Gene của đa số sinh vật Prokaryot có cấu trúc liên tục, bao gồm các trình tự mã hoá axit amin; gene của sinh vật Eukaryot

có cấu trúc gián đoạn (gene phân mảnh) gồm các intron và exon xen kẽ nhau Đặc điểm cấu trúc này đã quyết định sự khác nhau giữa quá trình phiên mã ở Prokaryot và Eukaryot Các trình tự như promotor, operator, enhancer, yếu tố

di truyền vận động (TGE), đoạn xen (IS), trình tự lặp lại CEN, TEL có cấu trúc

và chức năng xác định trong hệ thống di truyền của tế bào Hiện tượng biến tính, hồi tính của ADN, nhiệt độ chảy Tm cũng là cơ sở của một số kĩ thuật di truyền như lai phân tử, PCR, và một số kĩ thuật khác

Nội dung của chương gồm 3 vấn đề cơ bản : (1) Đặc điểm cấu trúc gene của

sinh vật Prokaryot; (2) Cấu trúc phân đoạn gene của sinh vật Eukaryot; (3) Một

số trình tự ADN

§1 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GENE Ở PROKARYOT

Gene của đa số sinh vật Prokaryol gồm nhiều cistron (đa cistron), trình tự promotor, operator Gene cấu trúc của Prokaryot có cấu trúc liên tục, bao gồm những đoạn mã hoá axit amin Promotor là trình tự trên phân tử ADN có ái lực với enzyme ARN-polimerase, có chức năng khởi động quá trình phiên mã Operator là trình tự có ái lực với protein ức chế, nếu operator gắn với protein ức chế sẽ ngăn cản hoạt động của ARN-polimerase và ức chế quá trình phiên mã Mỗi cistron chứa thông tin của một loại chuỗi polipeptit và cũng là nhân tố điều khiển quá trình tổng hợp chuỗi polipeptit thông qua quá trình phiên mã và dịch

mã

§2 CẤU TRÚC PHÂN ĐOẠN GENE Ở EUKARYOT

2.1 Cấu trúc gene phân đoạn (gene phân mảnh)

Một gene ở Eukaryot có cấu trúc bao gồm đoạn tăng cường (enhancer) đoạn khởi động (promotor), intron và kẽ nhau, cuối cùng là đoạn kết thúc hoá (Noncoding Sequences) được gọi là intron hay gọi là đoạn xen (Intervening

Sequences) (IS) xen vào và làm gián đoạn các đoạn mã hoá (Coding Sequences) được gọi là exon

Hình 2.1 Cấu trúc gene phân đoạn ở Eukaryot

Những gene có cấu trúc gồm exo được gọi là gene khảm (mosaic gene) Hiện nay, chưa rõ chức năng của intron, tuy nhiên có giả thuyết rằng, intron có vai trò như là các khoảng trống xen giữa các exon tạo thuận lợi cho sự tái tổ hợp giữa các exon

Thí nghiệm của Pierre Chambon (Pháp) phát hiện cấu trúc của exon - intron của gene ovalbumine gà Ovalbumine là protein lòng trắng trứng gồm một chuỗi polipeptit có 386 axit amin (tập hợp trong ống dẫn trứng ở thời kì gà mái đẻ trứng)

Ngoài việc tách mARN của ovalbumine, sử dụng enzyme sao mã ngược tạo ra các bản sao của mARN sợi đơn được gọi là cADN và tạo thành cADN sợi kép So sánh ADN hệ gene nhân với cADN khi giải trình tự cho phép phát hiện

ra intron và exon Kết quả ovalbumine trứng gà có 7 intron, 8 exon

2.2 Phương pháp phát hiện các đoạn intron và exon

2.2.1 Phương pháp so sánh trình tự gene và trình tự cADN

Bước 1:

1 Tách chiết ADN hệ gene

2 Phân lập gene bằng kĩ thuật PCR hay enzyme cắt hạn chế

3 Tạo dòng ADN tái tổ hợp, nhân dòng và tách dòng gene

Bước 3: So sánh trình tự ADN hệ gene với trình tự cADN xác định được

các đoạn intron và exon

2.2.2 Phương pháp lai phân tử

Phát hiện intron và exon còn được tiến hành theo phương pháp lai phân tử

và kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử

1 Tách ADN hệ gene và mARN tế bào chất

2 Phân lập gene

3 Lai phân tử giữa ADN và mARN sẽ xác định được intron và exon Vấn đề đặt ra là khi phiên mã tổng hợp mARN thì các đoạn không mã hoá intron có được sao không ? Người ta thấy bản sao của ADN có cả exon và intron

đó chính là tiền mARN (Pre-mARN), còn gọi là ARN không đồng nhất trong nhân (hn-ARN: heteroge nevusnucliar ARN) Loại hn-ARN chỉ được phát hiện

ở sinh vật nhân chuẩn

§3 MỘT SỐ TRÌNH TỰ ADN

3.1 Promotor

Thực chất của khởi đầu phiên mã là quan hệ tương tác giữa polimerase với trình tự promotor Khi ARN-polimease gắn vào promotor thì quá trình phiên mã được thực hiện và kết quả sẽ tạo phân tử mARN

ARN-• Phần lớn các promotor ở E coli về căn bản có cùng một cấu trúc theo sơ

đồ sau:

ADN sao mã hn-ARN

tiền mARN

processing cắt nối

mARN

Nếu bazơ đầu tiên được phiên mã ra mARN (thường là A) được đánh số +1 và tất cả các bazơ phía 5' hay phía trước nó không được phiên mã được ghi là (-) Ngay trước +l có 6 bazơ thường là trình tự TATAAT ở xung quanh -10, gọi

là trình tự nhất trí (consensus sequense), có thể gọi pribnow box Xung quanh trình tự -35 có trình tự nhất trí TTGACA Cả hai trình tự phối hợp với nhau cho phép ARN-polimerase gắn vào promotor và quá trình phiên mã và dịch mã bắt đầu

Promotor ở Eukaryot nằm phía trước điểm xuất phát của mARN Hộp TATA, định hướng cho ARN-polimerase bắt đầu phiên mã, nằm khoảng dưới

30 bp (động vật có vú) và 6-120 bp (nấm men) Trước hộp TATA có hai trình tự tương ứng phía trước khoảng 40 bp là CCAAT và 110 bp là trình tự giàu GC

-110 bp -40 bp -30 bp +1

Sự thay đổi hộp TATA làm giảm tốc độ phiên mã Hiệu quả của tốt độ phiên mã đo bằng sự thay đổi từng bazơ trong promotor Hộp TATA và các trình tự phía trước phải được nhận biết bởi các protein điều hoà, chính các protein này gắn với các điểm nhất định trên chúng và hoạt hoá sụ phiên mã

3.2 Enhancer (trình tự tăng cường)

Enhancer là trình tự có tác động cis (đều phía) có chức năng làm tăng tốc

độ phiên mã, enhancer có hiệu quả ngay cả khi cách xa vài nghìn cặp bazơ và chúng hoạt động bất kì ở hướng nào, dù là ở trước hay sau promotor

Trình tự tham gia điều hoà - cis có cấu trúc gồm 2 phần đối xứng nhau:

AGGTCA TGACCT TCCAGT ACTGGA

Enhancer được tổ chức gồm một dãy các trình tự có tác động cis để nhận biến các nhân tố trans - nhân tốprotein tham gia điều hoà biểu hiện gene Nhân

tố trans gồm 2 vùng cấu trúc chức năng: vùng gắn trans với ADN và vùng tác

động lên phiên mã Các nhân tố trans có 4 kiểu tác động như:

"Ngón tay kẽm" (zine-finger)

"Xoắn-vòng-xoắn" (hehx-turn-hehx)

"Xoắn-nút-xoắn" (hehx-loop-helix)

"Dây kéo leucine" (leucine-zipper)

Giữa trình tự cis và nhân tố trans thường có các tương tác đặc hiệu do

những liên kết yếu hình thành giữa các phân tử của nhân tố trans với các bazơ của trình tự cis Các trình tự cis thường tiếp nhận protein điều hoà (nhân tố trans) gồm 2 tiểu đơn vị (dimer) Nhân tố trans có thể có 4 nhóm cấu trúc, chúng luôn gắn lên cis

Điều hoà bằng cách biến đổi nhiễm sắc chất hay ADN Nhiễm sắc thể tồn tại những vùng "nhạy cảm" tương ứng với các gene hoạt động Các vùng nhạy cảm này dễ tiếp xúc với enzyme sao mã

Tóm lại, các gene của Eukaryot được hoạt hoá bởi hai trình tự ADN có tác động cis là promotor và enhancer Chúng được nhận biết các nhân tố protein

có Lác động trans Các nhân tố trans này cho phép ARN-polimerase khởi động phiên mã và đạt tốc độ phiên mã tối đa

3.3 Yếu tố di truyền vận động (Transposable Genetic Element-TGE) Gene

nhảy (Jumping genes -JG)

Gene nhảy (Jumping genes) còn dược gọi là yếu tố di truyền vận động (TGE) lần đầu tiên được phát hiện bởi Barbara Mc Clintock khi nghiên cứu ở ngô vào những năm 40 của thế kỉ XX và bà đã được nhận giải thưởng Nobel

Người ta đã phát hiện được ở E coli một đoạn xen IS1 chứa 720 bp (base

pair), nằm giữa đoạn đảo ngược IR (24 bp)

Hình 2.2 Đoạn xen IS1 ở E coli

Ở E coli còn phát hiện ra gene nhảy mang tên Tn 1681 (Transposase)

gồm 2 đoạn xen IS1 ở hai đầu và 1 gene khác dài 552 bp quy định độc tố chịu nhiệt gây ỉa chảy

Hình 2.3 Gene nhảy Tn 1681 ở E coli

Gene nhảy Tn ở E coli có thể chuyển vị trí và xen vào một nhiễm sắc thể

khác theo cơ chế được biểu diễn bằng mô hình ở hình 2.4

3.4 Biến tính và hồi tính

Hai mạch ADN liên kết với nhau bằng những liên kết hyđro Khi nhiệt độ lên tới 80-950C thì hai mạch ADN tách nhau, được gọi là hiện tượng biến tính của ADN

Nhiệt độ làm 2 mạch ADN tách rời nhau được gọi là điểm chảy (melting point) Điểm chảy được tính ở giữa đường cong OD hình Sigma Điểm chảy kí hiệu Tm ADN có hàm lượng G-C cao thì điểm chảy cao hơn ADN có 60% là G- C thì Tm = 950C

Hình 2.4 Cơ chế xen của gene nhảy Tn 1681 ở E coli

Khi nhiệt độ hạ xuống và trở lại bình thường, thì hai mạch đơn lại liên kết với nhau tạo thành ADN mạch kép Hiện tượng này được gọi là hồi tính (Renaturation)

• ADN bị cắt nhỏ bởi enzyme giới hạn

• ADN được biến tính

• Hồi tính: Các trình tự bổ sung dễ tái tổ hợp với nhau, từ đó nhận biết được các trình tự lặp lại

- Trình tự 11 cặp bazơ ở đầu 3': TGATTTCCGAA

• Trình tự TEL (Telomere - đầu mút NST)

Trình tự TEL có tính lặp lại cao, giàu A và C: CCCCACACACCA (nấm men) và CCCTAA (người) Đầu mút NST giàu G gập lại thành những hình kẹp tóc có cấu trúc bậc IV Cấu trúc này bảo vệ đầu mút NST có thể bị cắt bởi nuclease, giữ cho đầu mút khỏi mất các trình tự mã hoá

3.5.2.Ứng dụng nghiên cứu trình tự nucleotit lặp lại

Gần đây một loại chỉ thị phân tử mới được gọi là vi vệ tinh - microsatehtte (Litt and Luti, 1989) hoặc trình tự nucleotit lặp lại đơn giản - Simple sequence repeat (Tautz 1989, Weber and May, 1989) đã được mô tả sau khi tiến hành phản ứng tổng hợp ADN nhờ polimeraza và điện li trên gel poliacrylamit người

ta có thể phát hiện loại đa hình này Trình tự hai nucleotit lặp lại rất phong phú trong bộ gene của người cũng như động thực vật

Tanksley và cộng sự, 1993 khi nghiên cứu hiện tượng đa hình của cá( vi

vệ tinh ở lúa cho thấy 2 nucleotit lặp lại (GA)n hoặc (GT)n xuất hiện sau mỗi một đoạn ADN dài 150 Kb, tổng số 2 nucleotit này chừng 3000 Đây là nguồn phân tử ADN đa hình phong phú đối với việc lập bản đồ gene ở loại cây trồng này

Yanagisawa và cộng sự (1994) đã nghiên cứu dấu vân ADN của 47 giống

đậu tương thông qua chất dò Oligonucleotit nhằm phát hiện trình tự ADN lặp lại đơn giản và cho biết hiện trạng đa hình thể hiện rõ nhất là khi dùng Oligolucleotit (AAT)6 làm đoạn dò ADN tất cả giống đậu tương thử nghiệm đều phân biệt với nhau bởi đoạn dò đó Khi sử dụng ba đoạn dò ADN khác nhau như (CT)8, (GAA)5 và (AAGG)4 thì không phát hiện được các băng ADN đa hình

từ các giống đậu tương thuộc Subgeneus Soja (Glicine max và Glicine Soja), trái

lại các băng ADN đa hình xuất hiện trong số các giống thuộc Subgeneus,

Glicine Kết quả nghiên cứu đã chứng tỏ G max và G Soja gần gũi nhau về cấu

trúc bộ gene

THẢO LUẬN

1 Phân biệt cấu trúc của gene ở sinh vật Prokaryot và Eukaryot Vấn đề về

đặc điểm của gene ở sinh vật Eukaryot

2 Phương pháp xác định các đoạn intron và exon trong gene của sinh vật

Eukaryot Cho ví dụ

3 Phân biệt khái niệm về gene nhảy và đoạn xen Cơ chế xen của gene nhảy

4 Trình bày các khái niệm: trình tự lặp lại, biến tính và hồi tính

Ứng dụng của các kĩ thuật này trong phân tích sinh học phân tử

Chương 3: MỐI LIÊN HỆ GIỮA ADN, ARN, PROTEIN

Tóm tắt: Thông tin cấu trúc của phân tử protein, tARN, rARN được mã hoá

trong gene bằng trình tự các nucleotit Trình tự nucleotit trong gene mã hoá cho chuỗi polipeptit đã được xác lập bằng thực nghiệm và thể hiện trong bảng mã di truyền Mã di truyền là mã bộ ba nucleotit (codon), sự thay đổi trong codon có thể dẫn đến sự thay đổi trong chuỗi polipeptit và đột biến ở tính trạng Những đặc điểm về cấu trúc vá chức năng của protein và mối liên hệ giữa ADN, ARN, protein và sự điều hoà biểu hiện gene cũng là cơ sở quan trọng để xây dựng kĩ thuật biểu hiện gene

Nội dung của chương gồm 4 vấn đề cơ bản: (1) Thông tin sinh học và mật mã

di truyền; (2) Protein; (3) Tổng hợp protein; (4) Điều hoà biểu hiện gene

§1 THÔNG TIN DI TRUYỀN VÀ MẬT MÃ DI TRUYỀN

Thông tin quy định cấu trúc một loại protein, một loại tARN, rARN được

gọi thông tin di truyền Thông tin di truyền được chứa đựng và được mã hoá

trong phân tử ADN bởi trình tự các nucleotit Hiện tượng 3 nucleotit kế tiếp nhau trong gene quy định một axit amin trong chuỗi polipeptit được gọi là sự mã hoá bộ ba Còn một bộ ba cụ thể xác định cho một axit amin cụ thể ( ví dụ: UGU: serine) được gọi là bộ ba mã hoá (codon - code) Phân tử tARN có một bộ

ba bổ sung với bộ ba mã sao của mARN được gọi là bộ ba đối mã (anticodon) ADN chứa thông tin di truyền, đó là thông tin quy định cấu trúc một loại protein, rARN và tARN Trình tự của các bazơ trong ADN quyết định trình tự của axit amin trên protein tương ứng

Phân tử ADN được cấu tạo từ 4 loại nucleotit, và protein lại được cấu tạo

từ 20 loại axit amin, nếu, một nucleotit quy định 1 loại axit amin sẽ tạo ra 4 tổ hợp mã; còn hai nucleotit quy định 1 loại axit amin sẽ tạo ra 42 = 16 tổ hợp mã

bộ 2, như vậy vẫn còn thiếu 4 loại axit amin chưa được xác định bởi các mã bộ hai Và ba nucleotit quy định 1 loại axit amin sẽ tạo ra 43 = 64 tổ hợp mã bộ 3 Người ta đã chứng minh bằng thực nghiệm: mã di truyền là mã bộ ba Đối tượng là gene rII ở phage T4 Trong thí nghiệm người ta tạo đột biến mất (-) và thêm (+) một cặp bazơ trên ADN → biến đổi ADN → thành phần axit amin của protein

Giả sử phân tử mARN chỉ có thành phần CAG và trong phân tử protein chỉ có một loại axit amin:

mARN CAG CAG CAG CAG CAG

Protein a1 a1 a1 a1 a1

- Nếu đột biến làm mất C (-) ở vị trí mã số 2 trên mARN:

mARN CAG AGC AGC AGC AGC

protein a1 a2 a2 a2 a2

- Nếu đột biến (+) thêm G vào giữa bộ ba thứ 2:

mARN CAG AGC GAG CAG CAG CAG

protein a1 a2 a3 a1 a1 a1

Các số liệu thực nghiệm thu được trên thí nghiệm rII ở thực khuẩn T4 đã chứng tỏ lập luận trên là đúng Vậy mã di truyền là mã bộ ba nucleotit

1.1 Giải mã di truyền

Năm 1961 M Nirenberg sử dụng hệ thống vô bào để giải mã di truyền

Hệ thống vô bào được chiết từ E coli có chứa ribosome, ARN, enzyme

aminoacylsynthetase, mARN, các axit amin và một số phụ gia khác Phản ứng diễn ra trong vài phút rồi dừng lại, nếu bổ sung thêm mARN thì việc tổng hợp lại tiếp diễn

Nếu mARN nhân tạo chỉ toàn uraxin thì chuỗi polipeptit được tổng hợp chỉ có loại axit phenylalanine, nếu mARN chỉ toàn adenine thì chuỗi polipeptit được tổng hợp chỉ có loại axit lisine; nếu mARN toàn cytosine thì chuỗi polipeptit được tổng hợp chỉ có loại axit proline Từ đó có thể suy ra bộ ba UUU quy định axit amin phenylalanine; AAA : lisine; CCC : proline

Bằng phương pháp đó người ta đã tìm ra 61 bộ ba mã hoá Ba bộ ba còn lại là UAA, UAG, UGA làm nhiệm vụ nhận biết tín hiệu kết thúc quá trình tổng hợp chuỗi polipeptit, còn gọi là bộ ba vô nghĩa (non sense) vì chúng không quy định axit amin

1.2 Các đặc tính của mã

Thông tin được đọc theo từng cụm ba nucleotit một cách liên tục không ngắt quãng

- Thông tin được đọc theo một chiều, bắt đầu từ một điểm xác định

- Mã di truyền mang tính phổ biến (umversal)

- Mã di truyền mang tính thoái hoá (degenerate), trừ 2 ngoại lệ AUG và UGG

- Mã di truyền mang những bộ ba khởi đầu (AUG) ở đầu 5' Các bộ ba kết thúc UAG, UAA, UGA

Bảng mật mã di truyển (mã sao mARN)

U C A G UUU Phe UCU Ser

UUC Phe UCC Ser UUA Leu UCA Ser

U

UUG Leu UCG Ser

UAU Tir UAC Tir UAA KT UAG KT

UGU Cys UGC Cys UGA KT UGG Trp

U

C

A

G CUU Leu CCU Pro

CUC Leu CCC Pro CUA Leu CCA Pro

C

CUG Leu CCG Pro

CAU His CAC His CAA Gin CAG Gin

CGU Arg CGC Arg CGA Arg CGG Arg

U

C

A

G AUU Isoleu ACU Thr

AUC Isoleu ACC Thr AUA Isoleu ACA Thr

A

AUG Met ACG Thr

AAU Asn AAC Asn AAA Lis AAG Lis

AGU Ser AGC Ser AGA Arg AGG Arg

U

C

A

G GUU Val GCU Ala

GUC Val GCC Ala GUA Val GCA Ala

G

GUG Val GCG Ala

GAU Asp GAC Asp GAA Glu GAG Glu

GGU Gli GGC Gli GGA Gli GGG Gli

mà là UGU điều khiển axit amin formyl methionine đi vào đầu chuỗi polipeptit)

Mã kết thúc (codon vô nghĩa - nonsense):

UAA (ochae) Tín hiệu kết thúc

UGA (opal) quá trình tổng hợp protein

Phân tích trình tự cho thấy đầu 5' của codon đối mã (bổ trợ với bazơ thứ

ba của cụm mã) khác với 2 bazơ kia, có khả năng kết hợp với một số bazơ trên đầu 3' của cụm mã Hiện tượng này còn được gọi là tính "linh hoạt" trong kết cặp bazơ và tính linh hoạt là có giới hạn:

Hình 3.1 Cấu trúc của inosine và guanine

Bazơ trên đầu 5' của anticodon Bazơ trên đầu 3' của cụm mã

I (Inosin) kết cặp với A, U hoặc G

Hình 3.2 Tính linh hoạt của mã di truyền 1.3 Đột biến và mã di truyền

Mối liên quan giữa đột biến và mã di truyền được thể hiện ở 4 kiểu đột biến cơ bản

1.3.1 Đột biến nhầm nghĩa

Một cặp bazơ bị biến đổi dẫn đến thay đổi cụm mã tương ứng trên mARN

và làm thay đổi 1 axit amin trên polipeptit

1.3.2 Đột biến vô nghĩa

3' AGT CAA GGT TGC CAT 5'

1 2 3 4 5

Đột biến thay thế ở bộ ba thứ 4 (G-C bị thay thế bởi A-T) 3' AGT CAA GGT TAC CAT 5'

Thay đối ở mARN

5' UCA GUU CCA AUG GUA 3' mARN

Biến đổi một cặp bazơ làm xuất hiện một codon vô nghĩa dẫn đến xuất hiện tín hiệu kết thúc chuỗi polipeptit làm cho chuỗi polipeptit được tổng hợp ngắn (ít axit amin) hơn bình thường

3' AGT CAA GAT TGC CAT 5'

1 2 3 4 5

Đột biến măt cặp bazơ G-X ở bộ ba thứ 3

3' AGT CAA ATT GCC AT 5'

Xuất hiện mã kết thúc UAA ở mARN

5' UCA GUU UAA CGG UA 3' mARN

1.3.3 Đột biến cặp bazơ ở bộ ba quy định axit amin 1àm xuất hiện codon mới (codon thoái hoá) không ảnh hưởng đến chuỗi polipeptit

Một loại axit amin có thể được quy định bởi một vài bộ ba: ví dụ GUU, GUC, GUA, GUG cùng quy định axit amin valine

Trường hợp bình thường:

3' AGT CAA GGT TGC CAT 5'

1 2 3 4 5

5' UCA GUU CCA ACG GUA 3' mARN

Scrine - Valine - Proline - Threonie - Valine Protein

Trường hợp đột biến

1.3.4 Đột biến dịch khung

3' AGT CAA GGT TGC CAT 5'

1 2 3 4 5

Đột biến thay thế ở bộ ba thứ 2 (A-T bị thay thế bởi G-X)

3' AGT CAG GOT TAC CAT 5'

Thay đối ở mARN 1àm BD đổi GUU thành GUC

5' UCA GUC CCA AUC GUA 3' mARN

Serine - Valine - proline - Threonie - Valine Protein

(GUU và GUC cùng quy định valine)

Hiện tượng mất hoặc thêm một cặp bazơ dẫn đến tổ hợp lại các codon và làm thay đổi thành phần axit amin của chuỗi polipeptit

• Trường hợp đột biến dịch khung:

3' AAC ACA CAG GTT CAA AGG AGC 5' Gene

Như vậy chuỗi polipeptide có thành phần axit amin:

- Leucinne - Cysteine-Valine - Glicine - Valine - Tryptophane - Serine Biến đổi thành:

- Leucinne - Cysteine - Serine - Lisine - Tryptophane - Proline

§2 PROTEIN

2.1 Chức năng của protein trong tế bào

Protein chiếm khối lượng lớn trong tế bào và tham gia vào hầu hết các quá trình sinh học

Thành phần cấu tạo nên các bộ phận của tế bào, quy định những đặc điểm

về hình thái và cấu tạo của tế bào và cơ thể

Protein enzyme có khả năng xúc tác lớn và tính đặc hiệu cao

Kháng thể: chống lại các tác nhân xâm nhập vào tế bào và cơ thể Tác nhân gây miễn dịch (kháng nguyên) xâm nhập vào cơ thể động vật có xương sống sẽ kích thích sự sản sinh ra kháng thể

Protein vận động (myosin), cảm ứng

2.2 Cấu trúc của protein

Axit amin là đơn vị cấu tạo nên protein, có khoảng 20 loại axit amin cấu tạo nên các phân tử protein khác nhau Axit amin có cấu tạo chung như sau:

Dựa vào diện tích của chúng các aminoacit có thể chia làm 4 nhóm:

• Nhóm I Các axit amin có tính kiềm: lisine, argimne, histidinc ở độ pH của tế bào nhóm amine (NH)2 ở nhánh bên bị ion hoá thành NH3, nên chúng mang điện tích dương

• Nhóm II Các axit amin mang tính axit, vì nhánh bên bị oxy hoá thành COO-, bao gồm: aspartic và glutamic

• Nhóm III Các axit amin trung tính kị nước (không mang điện tích) như:

alanine, valine, leucine có nhánh bên mang các nhóm kị nước

• Nhóm IV Các axit amin trung tính phân cực có nhánh bên nhóm OH để tạo các liên kết hyđrô ưa nước

Các axit amin liên kết với nhau bằng mối liên kết peptit

Protein có cấu trúc theo nhiều bậc:

Bậc I: chuỗi polipeptit có dạng mạch thẳng

Bậc II: chuỗi polipeptit có dạng mạch xoắn α

Bậc III: chuỗi polipeptit có dạng mạch hình cầu

Bậc IV: tổ chức protein có nhiều chuỗi polipeptit :

Hình 3.4 Liên kết tạo chuỗi polipeptit

Hình 3.5 Sơ đồ các bậc cấu trúc của protein

Một phân tử protein chỉ có một chuỗi polipeptit (cấu trúc bậc I, II, III) hoặc gồm nhiều chuỗi polipeptit (cấu trúc bậc IV)