SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

GVHD: GS-TS NGUYỄN KIM PHI PHỤNG

SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

1 Đặc điểm tổng quát của nhựa trao đổi ion

2 Kiến thức căn bản trong thực nghiệm trên nhựa trao đổi ion

4 Một số áp dụng của sắc ký trao đổi ion

3 Sắc ký trao đổi ion sử dụng cột hoặc becher

Tổng quan về sắc ký trao đổi ion.

Sắc ký trao đổi ion là một trong những phương pháp sắc lý dùng để cô lập các hợp chất hữu cơ Hiện nay,

kỹ thuật này được dùng rộng rãi trong phân tích và cô lập các protein

Trong phương pháp sắc ký trao đổi ion, yếu tố chính liên quan đến sự lưu giữ và phân tách các chất là sự tương tác tĩnh điện giữa các hợp chất mang điện tích có trong mẫu với các tâm mang điện tích ngược dấu của pha tĩnh

Hình 1 Các giai đoạn trong quá trình trao đổi ion

1 Đặc điểm tổng quát của nhựa trao đổi ion

Nhựa trao đổi ion là những hạt hình cầu, không tan trong nước Trên bề mặt của chúng có những nhóm chức mang điện tích; xung quanh các nhóm mang điện tích này luôn có các đối-ion của chúng

Nếu nhựa trao đổi ion âm gọi là nhụa trao đổi anion

Nếu nhựa troa đổi ion dương gọi là nhựa trao đổi cation

Tên nhựa trao đổi ion Tính acid base Nhóm hoạt động Khoảng pH hiệu

quả

Khả năng trao đổi (trên resin

khô)

Nhựa CM Acid yếu Carboxymetyl (-CH2-COOH) 5-14 9-10 mmol H+/g

Nhựa QAE (quaternary

amino etyl)

Base mạnh

(2-hydroxypropyl)-dietyletylamonium(-CH2-CH2-N+R’R2)

1-15 4 mmol OH-/g

Bảng 2 Một số đặc trưng của nhựa trao đổi ion

+ Nhựa trao đổi ion tính base mạnh sẽ hấp thu-bắt giữ tất cả các hợp chất có tính acid; nhựa trao đổi ion tính base yếu chỉ hấp thu-bắt giữ hợp chất có tính acid mạnh.

+ Đối với nhựa trao đổi ion tính acid mạnh sẽ hấp thu-bắt giữ tất cả các hợp chất có tính base; nhựa trao đổi ion tính acid yếu chỉ hấp thu-bắt giữ hợp chất có tính base mạnh.

1 Đặc điểm tổng quát của nhựa trao đổi ion

1.1 Lý thuyết về sự trao đổi ion

1.1 Lý thuyết về sự trao đổi ion

- Điện tích của các hợp chất hữu cơ có thể điều chỉnh bằng cách điều chỉnh pH của dung dịch: + pH > pKa: các acid hữu cơ mang điện tích âm (RCOO-)

+ pH < pKa: các amin mang điện tích dương (RNH4+)

1.1 Lý thuyết về sự trao đổi ion

So sánh ái lực của một số ion (anion, cation) đấi với chất trao đổi:

1.1 Lý thuyết về sự trao đổi ion

- Mỗi loại nhựa trao đổi ion đều được nhà sản xuất xác định khả năng trao đổi ion của nó

VD: một loại nhựa có khả năng trao đổi 3 mili đượng lương cho mỗi gam (3meq/g), có nghĩa là về mặt lý thuyết 1 gam nhựa này có khả năng bắt giữ 3 milimol phan tử mang đơn điện tích hoặc 1 milimol phân tử mang ba điện tích

1.2 Nguyên liệu sử dụng làm nhựa trao đổi ion.

- Các nguyên liệu được chọn phải đáp ứng một số điều kiện sau: hạt nhựa có độ bền cơ học; dung môi có thể chảy qua với vận tốc thích hợp

- Nhựa trao đổi ion có thể có hoặc không có lỗ rỗng

- Có 3 loại nguyên liệu chính: nhựa polystyren; polymercarbohydrat và silica gel

1.2 Nguyên liệu sử dụng làm nhựa trao đổi ion.

1.2.1 Nhựa polysytren

- Nguyên liệu chính thường là polystyren, metacrylat có tính kỵ nước và mang nhiều nhóm chức + Ưu điểm:

- Hạt nhựa rắn chắc, có độ bền cơ học

- Nhựa polystyren chịu được pH : 1-14

- Nhựa Metacrylat chịu được pH: 2-10

+ Nhược điểm:

- Nhựa có độ tạo mạng ngang cao có thời gian cân bằng chậm

- Có thể xảy ra sự tương tác giữa chất tan cần tách và chất nền của pha tĩnh; khiến cho sau quá trình sắc ký không đuổi hết các chất cần tách ra khỏi cột nhựa, gây khó khăn chó quá trình tái tạo nhựa

+ Phương pháp tổng hợp để có các nhóm chức hoạt động của nhựa trao đổi ion

Nhựa loại acid mạnh

Nhựa loại acid yếu

Nhựa loại base mạnh

Nhựa loại base yếu

1.2 Nguyên liệu sử dụng làm nhựa trao đổi ion.

- Hạt silica gel không trương nở trong dung môi

- Hạt có kích cỡ nhỏ (5-50µm) nên thời gian cân bằng nhanh

- Chịu được pH cao (trong khoảng thời gian ngắn)

+ Nhược điểm:

- Cần pH ổn định; khoảng pH: 2-7.5

1.2 Nguyên liệu sử dụng làm nhựa trao đổi ion.

- Do tính ái nước nên ít xảy ra tương tác giữa chất tan và mạng ngang của pha tĩnh

- Hạt nhựa dễ trương nở trong nước nên dễ nạp cột và tốc độ dung môi giải ly tốt

+ Nhược điểm:

- Không bền trong dung dịch có pH thấp, nhiệt độ cao, những sản phẩm có tính oxi hóa

2 Kiến thức căn bản trong thực nghiệm trên nhựa trao đổi ion.

2.1 Chọn loại nhựa trao đổi ion phù hợp

2.1.1 Chọn loại nhựa trao đổi ion tùy thuộc vào độ bền của chất khảo sát

- Những hợp chất dễ hư hỏng cần thực hiện với nhựa trao đổi ion yếu: DEAE hoặc CM

2.1.2 Chọn loại nhựa trao đổi ion tùy theo tính acid/base mạnh hay yếu của chất khảo sát

- Nhựa trao đổi anion mạnh QAE được sử dụng để sắc ký với hợp chất có tính acid yếu, cần pH nhỏ để biến hợp chất khảo sát về dạng ion

- Nhựa trao đổi cation mạnh SP được sử dụng để sắc ký với hợp chất có tính base yếu, cần pH lớn để biến hợp chất khảo sát về dạng ion

2.1.3 Chọn loại nhựa trao đổi ion tùy thuộc vào điện tích toàn phần của hợp chất khảo sát.

- Nếu protein không bị hư hỏng ở giá trị pH > pI, có thể sử dụng nhựa DEAE hoặc QAE

- Nếu protein không bị hư hỏng ở giá trị pH < pI, có thể sử dụng nhựa CM hoặc SP

2.1.4 Cách thực hiện

- Lấy 50mg nhựa vào mỗi ống nghiệm và cân bằng với loại dung dịch đệm thích hợp.

- Cho vào mối ống 1 lượng nhất định của dung dịch cần khảo sát Khuấy đều, để yên cho nhựa lắng xuống, hút lấy phần dung dịch nổi lên trên.

- Đo mức hấp thu quang của dung dịch nổi ở trên.

- Đo mức hấp thu quang của dung dịch mẫu E.

So sánh mức hấp thu quang sẽ chọn được loại nhựa trao đổi ion cần dùng.

DEAE; pH 8

Dung dịch chuẩn

5 Kiến thức căn bản trong thực nghiệm trên nhựa trao đổi ion.

5.1 Chọn loại nhựa trao đổi ion phù hợp

2.2 Chọn số lượng nhựa trao đổi ion phù hợp số lượng chất khảo sát

- Cân bằng nhựa trong dung dịch đệm.

- Cho vào mỗi ống một lượng biết trước dung dịch cần khảo sát; khuấy nhẹ, hút lấy phần dung dịch ở trên

- Đo mức hấp thu quang của dung dịch vừa hút.

- Đo mức hấp thu quang của dung dịch mẫu.

So sánh mức hấp thu quang của các dung dịch để tính toán lượng nhựa cần dùng.

Chú ý: để đảm bảo kết quả thí nghiệm, không nên sử dụng vượt quá 10-20% khả năng của nhựa.

Dung dịch mẫu, 1mg/ml

2.3 CHỌN LOẠI DUNG DỊCH ĐỆM

 Nguyên tắc:

Dung dịch đệm cation sử dụng cho nhựa trao đổi cation, dung dịch đệm anion sử dụng cho nhựa trao đổi anion Thí dụ: dung dịch đệm anion CH3COO-NH4+ sử dụng cho nhựa trao đổi cation –COO-

Nên sử dụng dung dịch đệm ở 0.1M

Đôi khi có thể thêm vào dung dịch đệm một số hợp chất: alcol, dimetylformamid, 7M urea, triton X-100… để giúp cho dung dịch đệm hòa tan tốt hơn

Khoảng pH của một số dd đệm thông dụng Giá trị pH

Acid citric-citrat natri

Acid formic-format natri

Acid acetic-acetat natri

2.4 LÀM TRƯƠNG NỞ NHỰA TRƯỚC KHI GẮN MẪU KHẢO SÁT

2.4.1 Trường hợp đối ion của dung dịch đệm giống với đối ion của nhựa

2.4.2 Trường hợp đối ion của dung dịch đệm khác đối ion của nhựa

2.4.1 Trường hợp đối ion của dung dịch đệm giống với đối ion của nhựa

• Nhựa cần được trương nở hoàn toàn ở pH sử dụng

• Làm trương nở nhựa bằng cách ngâm nhựa vào dung dịch đệm phù hợp ở nhiệt độ phòng trong hai ngày hoặc trong 2 giờ, ở pH trung tính, trên bếp cách thủy

• Không được khuấy trộn nhựa mạnh vì như thế có thể làm hư hỏng các hạt nhựa

• Trong thực nghiệm: trong một becher, cho 1 gam nhựa khô và dung dịch đệm( khoảng 50ml), khuấy nhẹ, để yên cho nhựa lắng xuống, chờ một khoảng thời gian ngắn, gạn bỏ phần dung dịch nổi bên trên

và thay dung dịch đệm mới vào, thực hiện nhiều lần trong quá trình làm trương nở nhựa, cuối cùng để nhựa trương nở qua đêm trong dung dịch đệm

• Thí dụ: sử dụng nhựa SP-Sephadex(-O-CH2-CH2-CH2-SO3-Na+) thực hiện với dung dịch đệm “acetat natri-acid acetic”, như thế phần đối ion của nhựa vẫn là Na+.

• Sau khi trương nở, hạt nhựa có dạng hình khối cầu, đường kính hạt khoảng 0,1-0,2 mm, có thể quan sát bằng mắt thường

2.4.2 Trường hợp đối ion của dung dịch đệm khác với đối ion của nhựa

• Các nhà sản xuất bán hạt nhựa dưới dạng muối: nhựa DEAE, QAE với đối ion là Cl- và nhựa CM, SP với đối ion là Na+ hoặc H+

• Nếu trong quá trình thực nghiệm cần sử dụng một loại dung dịch đệm nào đó không phải là Cl-(hoặc Na+) Trước khi áp dụng sắc kí trao đổi ion, phải chuyển đổi đối ion của nhựa từ Cl-(hoặc Na+) trở thành X-(hoặc Y+), với thực nghiệm như sau

Ngâm nhựa trong một lượng thừa dung dịch đệm muối đối ion mới, dung dịch đệm này có nồng độ 1M

0,5-Khuấy nhẹ và để yên cho nhựa trương nở hoàn toàn

Lắng gạn, thu lấy nhựa.

Thả nhựa vào dung dịch đệm mới có nồng độ thấp 0,1M Thực hiện nhiều lần để nhựa hoàn toàn trương

nở trong dung dịch đệm mới

Thí dụ: thực hành nhựa DEAE(-O-CH2-CH2-+NH(C2H5)2, Cl-) với dung dịch đệm acetat

ammonium(CH3COO-+NH4):

 Trước tiên, nhựa được cho trương nở trong dung dịch đậm đặc acetat ammonium hoặc acetat natri, như thế các ion Cl- của nhựa được thay thế bằng ion acetat

 Lọc, thu lấy nhựa

 Tiếp theo nhựa được cho cân bằng nhiều lần trong dung dịch loãng acetat ammonium(loại sẽ sử dụng)

 Muốn kiểm tra xem có còn hiện diện của ion Cl-: dung dịch AgNO3 1% sẽ thấy kết tủa trắng.

2.5 TÁI TẠO NHỰA-TỒN TRỮ NHỰA TRAO ĐỔI ION

2.5.1 Tái tạo nhựa

2.5.2 Tồn trữ nhựa

2.5.3 Chất chống nấm mốc cho hạt nhựa trao đổi ion

2.5.1 Tái tạo nhựa

• Loại bỏ những hợp chất gắn vào nhựa và các chất tạp bẩn khác

• Nhựa được đặt trên phễu bucher, rửa nhựa nhiều lần với dung dịch nước muối đậm đặc nhằm tách hết những hợp chất gắn vào nhựa

• Các muối này phải có đối ion giống đối ion của nhựa trao đổi lúc nguyên thủy

• Các hợp chất bẩn khác như lipit, protein… có thể loại khỏi nhựa bằng dung dịch NaOH0,1M

2.5.2 Tồn trữ nhựa

• Nhựa có tính hút ẩm nên cần tồn trữ nhựa trong lọ đậy nút kín

• Nhựa đã sử dụng có thể tồn trữ trong dung dịch đệm có đối ion giống với đối ion của nhựa trao đổi lúc nguyên thủy, có cho thêm chất chống mốc vào dung dịch Nhựa được đựng ngập trong dung dịch đệm

và chai lọ phải đậy thật kín

• Để tồn trữ nhựa an toàn với cách thực hành như sau:

Rửa nhựa trên phễu bucher với một lượng thừa dung dịch đệm trung tính, có nồng độ loãng, cho đến khi nước rửa không còn vết muối nào

Làm cho hạt nhựa co thể tích lại bằng cách rửa nhựa với dung dịch alcol có nồng độ tăng dần cho đến khi đạt nồng độ 96%.

Rửa loại bỏ alcol ra khỏi hạt nhựa bằng dietyl eter, sấy khô ở nhiệt độ thấp

Trữ hạt nhựa khô trong lọ đậy nút kín

2.5.3 Chất chống nấm mốc cho hạt nhựa trao đổi ion

• Chất chống nấm mốc dành cho nhựa trao đổi cation: azid natri(NaN3)0,02%; thimerosal; etyl

3 SẮC KÍ TRAO ĐỔI ION, SỬ DỤNG CỘT HOẶC BECHER

3.1 Lựa chọn kích thước cột sắc kí

3.2.Nhồi nhựa trao đổi vào cột và nạp mẫu cần phân tích vào đầu cột.

3.1 Lựa chọn kích thước cột sắc kí

• Để đạt kết quả tốt trong sắc kí trao đổi ion, sử dụng cột ngắn có đường kính lớn

• Trong phòng thí nghiệm, người ta thường sử dụng cột có ống hình trụ dài, làm bằng nhựa PTFE, plastic, thùy tinh… hai đầu ống có ven răng cưa

3.2 Nhồi nhựa trao đổi vào cột và nạp mẫu cần phân tích vào đầu cột

3.2.1 Nhồi nhựa trao đổi vào cột

3.2.2 Nạp mẫu chất lên đầu cột

3.2.1 Nhồi nhựa trao đổi vào cột

• Giữ cột thẳng đứng trên giá, khóa vòi bên dưới cột

• Nhựa trao đổi ion đã được cân bằng trong dung dịch đệm, lượng nhựa và thể tích dung môi sao cho có thể rót nhựa dễ dàng vào cột, không tạo những bọt khí

• Để yên 5-10 phút cho hạt nhựa lắng xuống

• Rót đầy cột bằng dung dịch đệm, mở khóa để cho nhựa lắng xuống

• Khi nhồi cột hoàn tất, cần cân bằng cột bằng cách cho dung dịch đệm chảy qua cột

• Kiểm tra pH của dung dịch chảy ra khỏi cột

3.2.2 Nạp mẫu chất lên đầu cột

• Dung dịch mẫu phải được lọc trong suốt trước khi được nạp vào cột, lọc bằng tờ giấy lọc hoặc ngang qua một lớp celite

• Lượng mẫu tùy vào lượng nhựa cũng như khả năng trao đổi của nhựa

• Điều quan trọng nhất là: tất cả các cấu tử quan trọng của mẫu chất phải được hấp thu hết vào nhựa Như

thế nghĩa là chú ý đến số lượng mẫu hơn thể tích mẫu.

• Thí dụ: muốn sắc kí trao đổi ion để bắt giữ 0,7g hemoglobin thi cần 1 gam nhựa SP-Sephadex C-50 Để

nạp mẫu lên đầu cột, 0,7g hemoglobin trong 2 ml dung dịch mẫu hoặc trong 50ml dung dịch mẫu đều

cho kết quả sắc kí như nhau

• Để nạp mẫu lên đầu cột, mở khóa để hạ mức dung dịch đệm xuống vừa sát mức nhựa ở trên đầu cột, khóa lại.

• Dùng pipette hút và đặt dung dịch mẫu lên đầu cột

• Mở khóa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựa ở trên đầu cột

• Để yên 10-20 phút để cho mẫu chất tiếp xúc cân bằng với nhựa

• Cho vài ml dung dịch đệm ban đầu chảy qua cột, nối cột với bình cung cấp dung dịch giải li

3.3 Giải ly cột trao đổi ion

Hỗn hợp mẫu chất ban đầu chứa nhiều loại hợp chất khác nhau,nên các hợp chất đó cũng gắn vào nhựa trao đổi ion với các ái lực khác nhau: muốn lần lượt tách từng loại hợp chất phải áp dụng một trong hai cách sau đây

3.3.1 Giải ly bằng cách tăng dần pH dung dịch giải ly.

Điện tích toàn phần của những phân tử lưỡng cực thay đổi theo pH.

Khi pH môi trường bằng pI của hợp chất, hợp chất có điện tích bằng zero, nó không gắn vào nhựa nữa và bị giải ly ra khỏi cột.

Ví dụ: ở pH6 các acid carboxylic ở dạng R-COO- nên bị hấp thu vào nhựa Khi chỉnh pH4 các anion carboxylat được proton hòa.

Tuy nhiên, trong thực nghiệm, việc tăng dần pH một cách tuyến tính rất khó thực hiện (việc này cũng đồng thời làm gia tăng nồng độ của dung dịch đệm.)

3.3.2 Giải ly bằng cách tăng dần nồng độ dung dịch giải ly.

Có thể tăng nồng độ dung dịch đệm theo hai phương pháp.

3.3.2 Giải ly bằng cách tăng dần nồng độ dung dịch giải ly.

Người ta thường cho dung môi hữu cơ vào dung dịch đệm để giảm bớt tương tác với chất nền.

Hiện tượng này thường thấy rõ khi phân tử cần sắc ký là hợp chất thơm và nhựa làm từ

polystyren Muốn loại bỏ tương tác này, sử dụng hỗn hợp dung môi-muối.

Hơn thế nữa, hỗn hợp dung môi-muối cũng giúp tránh được trường hợp khi môi trường bị điều chỉnh pH.

3.3.2 Giải ly bằng cách tăng dần nồng độ dung dịch giải ly.

Các thí nghiệm thường sử dụng các dung môi hữu cơ như metanol, acetonitril… thí dụ thí nghiệm với nhựa trao đổi anion Dowex-1, giải ly bằng dung dịch 3% clorua

ammonium(0,5M) trong 90% hỗn hợp metanol/nước.

Các muối hữu cơ thí dụ như hỗn hợp pyridin/acid acetic Có thể tạo nên những dung dịch có

3.4 Vận tốc giải ly cột trao đổi ion.

Vận tốc giải ly trung bình khoảng 5-10 ml/phút đối với cột có thể tích 100 ml vận tốc được điều chỉnh tùy theo các yếu tố sau.

Chiều cao và đường kính của phần nhựa trong cột sắc ký.

Độ nhớt của dung dịch.

Loại hạt nhừa.

3.5 Sắc ký trao đổi ion sử dụng becher.

Các thao tác với các bước như sau.

Việc lựa chon nhựa, số lượng nhựa, loại dung dịch đệm… được hực hiện như mô tả trong phần sắc ký sử dụng cột.

Chọn nhựa trương nở trong dung dịch đệm ban đầu.

Lọc hỗn hợp nói trên ngang qua một phễu buchner:

Nhựa trao đổi trên phễu được rửa nhiều lần với dung dịch đêm ban đầu rửa loại

bỏ hết tạp chất.

Các hợp chất cần khảo sát sẽ được rửa nhiều lần lượt giải hấp ra khỏi nhựa, bằng cách ngâm nhựa vào dung dịch đệm có nồng độ lớn hơn nồng độ của dung dịch đệm ban đầu.

Với mỗi loại dung dịch đệm nói trên, lọc ngang qua phễu buchner; dung dịch qua qua lọc sẽ chứa hợp chất cần khảo sát.

Thu hợp chất cần khảo sát ra khỏi dung dịch đệm bằng cách cho dung dịch qua lọc chảy ngang qua một cột sắc ký lọc gel với gel Sephadex G-10.

Dung dịch qua lọc được đuổi nước bằng máy cô quay chân không ở áp suất thấp hoặc tốt nhất là bằng kỹ thuật đông khô chân không sẽ cho hợp chất cần khảo sát ở dạng bột khô.