- Đo mức hấp thu quang của dung dịch mẫu.
3.2.Nhồi nhựa trao đổi vào cột và nạp mẫu cần phân tích vào đầu cột
3.2.1. Nhồi nhựa trao đổi vào cột3.2.2. Nạp mẫu chất lên đầu cột 3.2.2. Nạp mẫu chất lên đầu cột
3.2.1. Nhồi nhựa trao đổi vào cột
• Giữ cột thẳng đứng trên giá, khóa vòi bên dưới cột.
• Nhựa trao đổi ion đã được cân bằng trong dung dịch đệm, lượng nhựa và thể tích dung môi sao cho có thể rót nhựa dễ dàng vào cột, không tạo những bọt khí.
• Để yên 5-10 phút cho hạt nhựa lắng xuống
• Rót đầy cột bằng dung dịch đệm, mở khóa để cho nhựa lắng xuống.
• Khi nhồi cột hoàn tất, cần cân bằng cột bằng cách cho dung dịch đệm chảy qua cột.
3.2.2. Nạp mẫu chất lên đầu cột
• Dung dịch mẫu phải được lọc trong suốt trước khi được nạp vào cột, lọc bằng tờ giấy lọc hoặc ngang qua một lớp celite.
• Lượng mẫu tùy vào lượng nhựa cũng như khả năng trao đổi của nhựa.
• Điều quan trọng nhất là: tất cả các cấu tử quan trọng của mẫu chất phải được hấp thu hết vào nhựa. Như thế nghĩa là chú ý đến số lượng mẫu hơn thể tích mẫu.
• Thí dụ: muốn sắc kí trao đổi ion để bắt giữ 0,7g hemoglobin thi cần 1 gam nhựa SP-Sephadex C-50. Để nạp mẫu lên đầu cột, 0,7g hemoglobin trong 2 ml dung dịch mẫu hoặc trong50ml dung dịch mẫu đều cho kết quả sắc kí như nhau.
• Để nạp mẫu lên đầu cột, mở khóa để hạ mức dung dịch đệm xuống vừa sát mức nhựa ở trên đầu cột, khóa lại.
• Dùng pipette hút và đặt dung dịch mẫu lên đầu cột
• Mở khóa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựa ở trên đầu cột.
• Để yên 10-20 phút để cho mẫu chất tiếp xúc cân bằng với nhựa.
3.3. Giải ly cột trao đổi ion