Nghiên cứu được tiến hành để tối ưu hóa phương pháp sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao detector xung ampe (HPAEC-PAD) nhằm xác định hàm lượng myo-inositol trong nền mẫu sữa. Mẫu được thủy phân bằng HCl ở nhiệt độ 120°C trong 6 giờ và được trung hòa đến pH 6,0 ÷ 7,5. Myo-inositol được xác định bằng HPAEC-PAD với các điều kiện: Cột Dionex CarboPacTM MA1 (4 × 250 mm), pha động gồm NaOH 50 mM - NaOH 1M với chương trình gradient.
Xác định hàm lượng myo-inositol tổng số sữa phương pháp sắc ký trao đổi ion hiệu cao detector đo xung ampe (HPAEC-PAD) Lê Việt Ngân1 , Đỗ Thị Hồng Thúy2, Nguyễn Thị Ánh Hường2, Vũ Thị Trang1, Lê Thị Hồng Hảo1,2 1Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, Hà Nội, Việt Nam 2Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Việt Nam Tóm tắt Nghiên cứu tiến hành để tối ưu hóa phương pháp sắc ký trao đổi ion hiệu cao detector xung ampe (HPAEC-PAD) nhằm xác định hàm lượng myo-inositol mẫu sữa Mẫu thủy phân HCl nhiệt độ 120°C trung hịa đến pH 6,0 ÷ 7,5 Myo-inositol xác định HPAEC-PAD với điều kiện: Cột Dionex CarboPacTM MA1 (4 × 250 mm), pha động gồm NaOH 50 mM - NaOH 1M với chương trình gradient Phương pháp có độ đặc hiệu tốt, đường chuẩn khoảng 0,01 - 20 mg/L với hệ số tuyến tính R2 = 0,9998, độ thu hồi > 99,0%, độ lặp lại với RSD < 1,8% Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp 0,047 µg/g 0,155 µg/g Phương pháp áp dụng để xác định hàm lượng myo-inositol 10 mẫu sữa cho kết dao động khoảng 22,5 ÷ 64,7 mg/100g Từ khóa: myo-inositol, sắc ký trao đổi ion, HPEAC, PAD ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, sữa sản phẩm có giá trị dinh dưỡng quan trọng, cần thiết cho tăng trưởng phát triển trẻ sơ sinh trẻ nhỏ lợi ích trì sức khỏe người lớn Sữa nguồn dinh dưỡng tốt cung cấp vitamin, khoáng chất chất dinh dưỡng khác Tùy vào sản phẩm dành cho đối tượng, lứa tuổi khác bổ sung thêm số chất dinh dưỡng khác với hàm lượng khác Trong đó, myo-inositol thường bổ sung sữa thực phẩm Myo-inositol gọi vitamin B8 chất vitamin mà loại đường đóng vai trị quan trọng thể thành phần màng tế bào Nó tác động đến hoạt động insulin – hormon cần thiết để kiểm soát lượng đường máu Ngồi ra, myo-inositol cịn ảnh hưởng đến chất dẫn truyền não serotonin dopamin [1] Theo nghiên cứu gần [2-3] myo-inositol có lợi cho số bệnh nhân bị rối loạn, bao gồm vấn đề sức khỏe tâm thần, rối loạn chuyển hóa, cải thiện triệu chứng hội chứng buồng trứng đa nang (PCOS) [4-5] Myo-inositol cho thấy hiệu điều trị cho trẻ sinh non mắc hội chứng hô hấp [6] Các dạng myo-inositol bổ sung thực phẩm sử dụng rộng rãi bao gồm: inositol hexaphosphate (thường gọi "IP6") hợp chất myo-inositol Việc xác định hàm lượng xác myo-inositol bổ sung vào sữa góp phần quản lý chất lượng sữa thị trường đảm bảo quyền lợi sức khỏe cho người tiêu dùng Cho đến nay, có số nghiên cứu giới xác định hàm lượng myo-inositol mẫu như: sữa, đậu, loại hạt, loại ngũ cốc phương pháp điện di mao quản (CE) [7], Điện thoại: 0385805442 Email: lethuynifc@gmail.com Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 3, 2021 209 Xác định hàm lượng myo-inositol tổng số sữa phương pháp sắc ký khí (GC) [8], phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) [9-10] Tại Việt Nam có TCVN 11912:2017 phương pháp xác định hàm lượng myo-inositol thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh thực phẩm dinh dưỡng cho người lớn sắc kí lỏng đo ampe xung AOAC ban hành yêu cầu hiệu phương pháp chuẩn (SMPR 2011.007) xác định hàm lượng myo-inositol sản phẩm dinh dưỡng công thức dành cho trẻ sơ sinh sản phẩm dinh dưỡng công thức dành cho người lớn/ trẻ em với khoảng phân tích: từ 0,5 đến 68 mg/100g; giới hạn phát hiện: 0,175 mg/100g; giới hạn định lượng: 0,5 mg/100g; độ lặp lại: RSDr ≤ 5%, độ tái lặp RSDR ≤ 8%; độ thu hồi từ 90 - 105% Nghiên cứu tiến hành với mục tiêu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng myo-inositol tổng số sữa phương pháp sắc ký trao đổi ion hiệu cao detector xung ampe (HPAEC-PAD) với kết hợp ưu điểm phương pháp cơng bố, quy trình xử lý mẫu đơn giản, độ nhạy, độ chọn lọc độ xác cao VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu Chất chuẩn: myo-inositol (độ tinh khiết ≥ 99%) từ Sigma-Adrich, Mỹ; hóa chất: natri hydroxide, acid hydrochloric, kali hydroxide từ Merck, Đức Mẫu nghiên cứu: mẫu sữa bột không chứa myo-inositol (mẫu trắng), 10 mẫu sữa bột có cơng bố nhãn sản phẩm lấy ngẫu nhiên địa bàn thành phố Hà Nội 2.2 Thiết bị Hệ thống sắc ký trao đổi anion hiệu cao HPAEC (Dionex ICS-5000, Thermo Scientific, Mỹ) trang bị detector PAD; cột Dionex CarboPacTM MA1 (4 x 250 mm) thiết bị phụ trợ khác phịng thí nghiệm 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu Cân xác mẫu đồng vào ống ly tâm 50 mL, thêm H2O, lắc thêm dung dịch HCl, thủy phân tủ sấy với thời gian nhiệt độ cần khảo sát, trung hòa lại dung dịch KOH 1M, sau gạn dịch chiết vào bình định mức 100 mL định mức H2O đến vạch Dung dịch lọc qua giấy lọc qua màng lọc 0,45 µm (pha loãng cần) trước tiêm vào hệ thống HPAEC-PAD 2.3.2 Điều kiện phân tích HPAEC-PAD Điều kiện phân tích myo-inositol HPAEC sau: detector PAD, tốc độ dòng: 0,4 mL/phút, thể tích tiêm: 25 µL Thành phần pha động: Kênh A NaOH 50 mM kênh B NaOH 1M với chế độ gradient, ổn định 90% A phút, 50% A giảm xuống 35% A phút, giảm từ 35% A xuống 25% A phút, giảm từ 25% A xuống 0% A phút, giữ ổn định 0% A 13 phút, tăng từ 0% A đến 50% A phút Tổng thời gian phân tích 35 phút 2.3.3 Thẩm định phương pháp Độ đặc hiệu/chọn lọc: Thực phân tích mẫu: dung dịch chuẩn, mẫu trắng (mẫu thực 210 Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 3, 2021 Lê Việt Ngân, Đỗ Thị Hồng Thúy, Nguyễn Thị Ánh Hường, Lê Thị Hồng Hảo khơng chứa chất phân tích), mẫu trắng thêm chuẩn mẫu thực hệ thống HPAEC So sánh tín hiệu chất phân tích mẫu Giới hạn phát (LOD): Chọn mẫu thử có nồng độ thấp, khoảng - lần LOD ước lượng Phân tích lặp lại 10 lần Tính SD LOD = × SD Giới hạn định lượng (LOQ): LOQ = 3,3 × LOD Độ lặp lại: Tiến hành thí nghiệm lặp lại 06 lần Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD % hàm lượng chất phân tích Độ thu hồi: Tiến hành thêm chuẩn 03 mức độ khác mẫu phân tích Lượng chất chuẩn thêm vào mẫu phải đảm bảo cho nồng độ chất cần nghiên cứu sau thêm chuẩn nằm khoảng khảo sát KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký Do tính đặc hiệu việc phân tích đường, cột Dionex CarboPacTM MA1 lựa chọn để tách myo-inositol mẫu Để đáp ứng áp suất làm việc cột giảm thời gian phân tích, tốc độ dòng đặt cố định 0,4 mL/phút Tham khảo số tài liệu [7, 10-11], dung môi lựa chọn khảo sát gồm: NaOH 240 mM chế độ đẳng dòng; NaOH 50 mM - NaOH 1M với chương trình gradient 1, (Bảng 1, 2) Bảng Chương trình gradient Thời gian (phút) Tốc độ dịng (mL/phút) NaOH 50 mM (%) NaOH 1M (%) -5,00 0,4 90 10 0,00 0,4 100 10,00 0,4 100 10,01 0,4 100 20,00 0,4 100 20,01 0,4 100 30,00 0,4 100 Bảng Chương trình gradient Thời gian (phút) Tốc độ dòng (mL/phút) NaOH 50 mM (%) NaOH 1M -5,00 0,4 90 10 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 3, 2021 211 Xác định hàm lượng myo-inositol tổng số sữa -5,00 0,4 90 10 0,00 0,4 50 50 5,00 0,4 35 65 10,00 0,4 25 75 15,00 0,4 100 28,00 0,4 100 30,00 0,4 50 50 Khi sử dụng hệ pha động gồm NaOH 240 mM, chế độ đẳng dịng, myo-inositol khơng tách khỏi pic tạp mẫu Với hệ pha động gồm NaOH 50 mM - NaOH 1M, chương trình gradient 1, tín hiệu chất phân tích cao hơn, nhiên, pic khơng cân đối, độ phân giải cịn thấp chưa tách hoàn toàn khỏi pic nhiễu Với hệ pha động gồm NaOH 50 mM - NaOH 1M, chương trình gradient 2, chất phân tích tách khỏi pic tạp mẫu, cho pic nhọn, cân đối, tín hiệu chất phân tích cao hơn, tín hiệu nhiễu đường thấp Vì vậy, nghiên cứu pha động NaOH 50mM - NaOH 1M sử dụng với chương trình gradient điều kiện tối ưu cho trình tách sắc ký Sắc ký đồ phân tích mẫu sữa chứa myo-inositol điều kiện tối ưu thể Hình Hình Sắc ký đồ mẫu sữa chứa myo-inositol sử dụng chương trình gradient 3.2 Tối ưu hóa điều kiện xử lý mẫu 3.2.1 Khảo sát tỉ lệ HCl(đặc) H2O Khảo sát mẫu sữa bột có chứa myo-inositol tổng số với lượng cân khoảng gam mẫu sữa bột Sau đó, sử dụng acid để thủy phân dạng liên kết dạng myo-inositol hexaphosphat thành myo-inositol tự Khảo sát tỉ lệ HCl(đặc) H2O 1:10; 1:2; 1:1; 3:2 Kết thể Hình 212 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 3, 2021 Lê Việt Ngân, Đỗ Thị Hồng Thúy, Nguyễn Thị Ánh Hường, Lê Thị Hồng Hảo Hình Kết khảo sát tỉ lệ dung môi thủy phân Hàm lượng myo-inositol sử dụng HCl(đặc) : H2O với tỉ lệ : : cao Do đó, để giảm thiểu việc sử dụng HCl, tỉ lệ HCl(đặc) : H2O 1:1 lựa chọn để thực khảo sát 3.2.2 Khảo sát thời gian thủy phân mẫu Thời gian thủy phân mẫu ảnh hưởng đến hàm lượng ionositol thu được, thời gian ngắn, trình thủy phân chưa hồn tồn, kết chất phân tích thấp, thời gian dài, gây tốn thời gian phân tích Trên mẫu sữa, tiến hành thủy phân mức thời gian khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, đánh giá hàm lượng myo-inositol thu Kết khảo sát thể Hình Hình Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian thủy phân mẫu Kết Hình cho thấy: hàm lượng chất phân tích thời gian thủy phân cho kết cao có thay đổi khơng đáng kể sau Để tiết kiệm thời gian mà đảm bảo hiệu quả, thời gian thủy phân lựa chọn cho khảo sát 3.2.3 Khảo sát nhiệt độ thủy phân mẫu Nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân chất Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ mức 90°C, 100°C, 110°C, 120°C, 130°C vòng sử dụng mẫu sữa Kết khảo sát thể Hình Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 3, 2021 213 Xác định hàm lượng myo-inositol tổng số sữa Hình Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thủy phân mẫu Khi tăng nhiệt độ hàm lượng chất phân tích tăng lên, đạt cao 120°C khơng có thay đổi đáng kể nhiệt độ cao Do đó, nhiệt độ thủy phân 120°C lựa chọn nghiên cứu 3.2.4 Khảo sát pH dung dịch mẫu Sau trình thủy phân, mẫu cần trung hịa trước tiến hành phân tích hệ thống HPAEC-PAD Khảo sát pH trung hòa mức: 5,0, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0 9,0 Kết thể Hình Hình Kết khảo sát ảnh hưởng pH mẫu Hàm lượng myo-inositol chỉnh độ pH khoảng 6,0 - 7,5 cao khơng có khác rõ rệt nên khoảng pH lựa chọn làm điều kiện tối ưu Từ kết khảo sát trên, quy trình xử lý mẫu lựa chọn sau: Cân xác khoảng g mẫu đồng vào ống ly tâm 50 mL, thêm 20 mL HCl : H2O (tỉ lệ : 1), lắc đều, thủy phân tủ sấy 120° C Trung hòa mẫu đến pH 6,0-7,5 sử dụng KOH 1M Gạn dịch chiết vào bình định mức 100 mL, tráng ống lý tâm định mức đến vạch nước cất Dung dịch lọc qua giấy lọc, qua màng lọc 0,45 µm (pha lỗng cần) trước tiêm vào hệ thống HPAEC-PAD 214 Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 3, 2021 Lê Việt Ngân, Đỗ Thị Hồng Thúy, Nguyễn Thị Ánh Hường, Lê Thị Hồng Hảo Khi xử lý mẫu myo-inositol liên kết phosphatidylinositol, TCVN 119212:2017 sử dụng bốn loại hóa chất: methanol, cloroform, acid metaphosphoric, NaCl yêu cầu bước làm qua cột SPE Quy trình nghiên cứu sử dụng loại hóa chất bước thực đơn giản hướng đến hóa học xanh, bảo vệ mơi trường chi phí sử dụng 3.3.Thẩm định phương pháp 3.3.1 Độ đặc hiệu/chọn lọc Độ đặc hiệu phương pháp đánh giá thơng qua việc phân tích mẫu trắng (mẫu sữa bột khơng chứa chất phân tích), dung dịch chuẩn mẫu trắng thêm chuẩn Kết mẫu trắng không cho tín hiệu chất phân tích, dung dịch chuẩn mẫu trắng thêm chuẩn cho tín hiệu chất phân tích thời gian lưu (Hình 6) Do đó, phương pháp có độ đặc hiệu tốt Hình Sắc ký đồ mẫu chuẩn mg/L (a), mẫu trắng (b), mẫu trắng thêm chuẩn mg/L (c), mẫu thực (d) 3.3.1 Xây dựng đường chuẩn Đường chuẩn xây dựng với nồng độ thay đổi từ 0,01 mg/L đến 20 mg/L khảo sát phụ thuộc tín hiệu vào nồng độ Sau vẽ đường biểu diễn phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ Kết thu Hình Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 3, 2021 215 Xác định hàm lượng myo-inositol tổng số sữa Hình Đường chuẩn diện tích pic nồng độ chất chuẩn Kết cho thấy, đường chuẩn y = 12,683x + 0,3731 có hệ số tương quan R2 = 0,9998 kết sai khác (tính hệ thống phần mền Chromeleon thiết bị HPAEC) so với điểm chuẩn lý thuyết là: 0,21 - 0,70% nằm giới hạn ± 15% theo yêu cầu AOAC Như vậy, đường chuẩn biểu diễn phụ thuộc tuyến tính diện tích pic với nồng độ myo-inositol khoảng 0,01 - 20 mg/L đạt yêu cầu 3.3.1 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Phân tích lặp lại 10 lần mẫu thực có hàm lượng thấp Đánh giá LOD tính được: tính R = x / LOD Nếu < R