sắc ký trao đổi ion và cơ chế. Tài liệu được tổng hợp và viết dựa trên nhiều bài báo cáo khoa học nước ngoài. Chỉ mang tính chất tham khảo. Nhằm phục vụ cho các bạn dược sĩ hoặc kỹ sư hóa tìm kiếm cơ chế trao đổi ion của sắc ký.
Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUỐC TẾ HỒNG BÀNG KHOA DƯỢC – BỘ MƠN HĨA PHÂN TÍCH SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION (Ion – exchange chromatography) Lớp 14ĐH-DS1 LỜI NÓI ĐẦU Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography) Sắc ký phương pháp tách quan trọng dựa trình hấp thụ điều kiện động học Trong phương pháp sắc ký, trình tách thực liên tục cách cho pha tiếp xúc với nhiều lần cột, giấy hay mỏng Pha giữ nguyên gọi pha tĩnh Pha di động, tiếp xúc với pha tĩnh gọi pha động Trong trình tiếp xúc pha tĩnh pha động, cấu tử cần phân tích phân bố khác pha phụ thuộc vào chất chất phân tích, chất pha tĩnh pha động, nhờ mà ta tách cấu tử riêng biệt Ngày nay, sắc ký ion kỹ thuật sắc ký chung áp dụng muốn tách hỗn hợp thành dạng ion riêng rẽ Có nhiều kỹ thuật sắc ký ion khác nhau; nhiên sắc ký ion phân loại theo chế phân cách điện tử sau: Ion - exchange chromatography Ion - exclusion chromatography Ion - pair chromatography Ion - suppression chromatography Phương pháp sắc ký ion quan trọng sắc ký trao đổi ion (ion - exchange chromotography – IEC) chế chung, bao hàm cho tất kỹ thuật sắc ký ion khác, ứng dụng nhiều cách lĩnh vực Hóa Sinh, Cơng Nghệ Sinh Học, kiểm nghiệm Dược học NGUYÊN TẮC Sắc ký trao đổi ion dựa lực khác ion đầu charge trái dấu ionic (nhựa trao đổi ion) pha tĩnh Các ion ionic hút vào nhờ lực hút tĩnh điện phân tử mang điện tích trái dấu Dựa theo điện tích trao đổi bề mặt, nhựa trao đổi ion phân loại sau: Nhựa trao đổi cation: Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography) Phân tử ion âm gắn kết bề mặt ionit Cationit acid mạnh có nhóm acid sulfonic –SO3-H+ Cantionit acid yếu có nhóm acid carboxylic –COO-H+ Nhựa trao đổi anion: Phân tử ion dương gắn kết bề mặt ionit Anionit base mạnh có nhóm amin bậc –N(CH3)3+OH Anionit base yếu có nhóm amin bậc –NH3+OHHình 1: Nhựa trao đổi cation anion CƠ CHẾ 2.1 Cân trao đổi ion Quá trình trao đổi ion dựa cân trao đổi ion dung dịch ion bề mặt pha tĩnh Trao đổi ion A+ B+ dung dịch cột Rnhư sau: Hằng số cân trao đổi ion: A.R + B+ B.R + A+ Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography) Nếu nồng độ A+ dung dịch lớn cân chuyển sang trái, tức B+ bị phản hấp phụ Vì vậy, chất có Kex lớn bị lưu giữ mạnh ionit (B.R tăng cao) ngược lại Hằng số phân bố: Ví dụ: Hình 2: Cationit axit mạnh –SO3-H+ gắn kết với cation K+ Cationit axit mạnh có nhóm –SO3-H+ phản ứng với cation K+ theo phương trình phản ứng sau: Resin –SO3-H+ + K+ Resin –SO3-K+ + H+ Tương tự, trao đổi ion C- D- cột sắc ký E+ C.E + D- D.E + CKex lực hấp thu ionit với chất phân tích phụ thuộc vào điện tích Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography) ion, kích thước hydrat hóa tính chất khác Mặt khác KD phụ thuộc nồng độ H+ theo tỷ lệ ngược 2.2 Pha động sắc ký trao đổi ion Trong phản ứng E chất rửa giải hay pha động, X nhóm trao đổi ion pha tĩnh Q trình rửa giải - hồn ngun tái sinh ionit theo chế cạnh tranh vị trí hấp thu vào pha tĩnh, vai trò phóng thích ion gắn cột Khi tăng nồng độ ion pha động, ion thay ion chất ban đầu, gắn vào pha tĩnh, ion ban đầu ngồi cột theo trình tự độ lớn điện tích Hình 3: Ion Cl- gắn kết pha tĩnh anionit – NH3+ cạnh tranh liên kết với RCO2- Có để lựa chọn pha động sau: Kiểu phát chất phân tích; Độ phức tạp mẫu phân tích; Loại chất phân tích Loại cột sử dụng Thông thường, pha động dung dịch đệm có pH xác định, để tách ion kim loại người ta thêm chất tạo phức, mục đích cuối để cạnh tranh liên kết ion với cột R, tách ion khỏi cột thu ion cần thiết Với hỗn hợp chất ban đầu có nhiều hợp chất khác nhau, có nhiều hợp chất mang điện tích 2.3 Trình tự giai đoạn sắc ký trao đổi ion Hình 4: Giai đoạn trình trao đổi ion Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography) - Giai đoạn 1: Nhựa trao đổi ion cân với đối ion Các hợp chất - cần phân tích sẳn sàng ngang qua nhựa Giai đoạn 2: Nhựa trao đổi ion bị cạnh tranh gắn kết với ion cần phân tích, đối ion nhựa bị loại khỏi nhựa, sau giai đoạn cân - này, việc giải ly thực Giai đoạn 3: Ion dung dịch rửa giải cạnh tranh trao đổi với nhựa để - đẩy tách hợp chất khỏi nhựa Giai đoạn 4: Gia tăng nồng độ dung dịch rửa giải, để ion dung dịch rửa giải đủ mạnh để cạnh tranh đẩy ion khỏi nhựa - Giai đoạn 5: Tái tạo nhựa, trở lại tình trạng ban đầu CÁCH TIẾN HÀNH - Cần xem thông tin nhựa nhà sản xuất cấp để tính tốn lượng nhựa sử dụng, số lượng nhựa quy thể tích sau trương nở dung dịch cho - phù hợp Sử dụng cột sắc ký ngắn, đường kính lớn dài hợp chất sau ly giải bám vào gần hay xa đầu cột áp suất cột bị sụt - giảm thất thường, làm cho ảnh hưởng đến trình tách hợp chất Nhồi nhựa vào cột: Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography) o Giữ cột thẳng đứng giá, khóa vòi bên cột o Nhựa trao đổi cân dung dịch đệm cho rót dễ dàng vào cột mà khơng xuất bọt khí o Để n 5-10 phút cho nhựa lắng xuống, rót đầy cột dung dịch đệm, mở khóa cho nhựa lắng xuống o Khi nhồi cột hoàn tất, cân bằng cách cho dung dịch đệm chảy qua - cột, kiểm tra pH dung dịch chảy khỏi cột Nạp mẫu chất lên đầu cột: o Dung dịch mẫu phải lọc suốt trước nạp vào cột o Mở khóa để hạ mức dung dịch đệm xuống vừa sát mức nhựa đầu cột, khóa lại o Dùng pipet hút đặt dung dịch mẫu đầu cột, mở khóa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựa đầu cột Để yên 10-20 phút cho mẫu chất tiếp xúc cân với nhựa o Khi tất lượng mẫu gắn lên đầu cột nhựa, cho vài ml dung dịch đệm ban đầu chảy qua cột, nối cột với bình cung cấp dung dịch điện ly Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography) - Hình 5: Các bước tiến hành sắc ký trao đổi ion Tái sinh ionit: Loại bỏ tạp chất hoạt chất dính nhựa cách rửa nhiều lần nước muối đậm đặc tăng dần nồng độ 2M/lít Các hoạt chất tạp bẩn khác rửa với NaOH 0,1M sau rửa nhựa với nước cất dung dịch nước muối dung dịch qua lọc hết tính base ỨNG DỤNG TRONG NGÀNH DƯỢC Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography) Hình 6: Sơ đồ chung hệ thống sắc ký ion Ứng dụng Phương pháp trao đổi ion dùng nhiều khử độ cứng nước muối hòa tan dạng ion Ca2+ Mg2+, tinh chế chất thử hóa học, tinh chế chất không điện ly khỏi hỗn hợp điện ly, tách chiết protein, tách hợp chất khỏi hỗn hợp… Biphosphonate Drug Thuốc điều trị bệnh xương như: hypercalceamia, osteoporosis(loãng xương), Paget’s disease Ứng dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion kết hợp UV để định tính hợp chất Biphosphonate Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography) Hình 7: Cấu trúc tổng quát - - Biphosphonate Cột nhựa trao đổi anion: IC – Pak HR, PAX 100… Điều kiện tiến hành: o Dung môi pH = 2-3: HNO3 (2-10mM) + 0-20% acetonitrite, acid succinic, acid citric o Dung dịch tái sinh ionit: NaOH pH = 9.5 Kết : Hình 8: Dẫn xuất khác Biphosphonate cho kết SIM khác 10 Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography) Hình 9: Đồ thị biểu diễn Etidronate sau tách sắc ký Mỗi dẫn xuất Biphosphonate khỏi cột cho thông số thời gian khác nhau, dễ dàng định tính hợp chất riêng rẽ để đạt hiệu mong muốn - Tách chiết protein Protein với điện tích trái dấu gắn vào giá thể protein khác bị rửa trôi khỏi cột Sau rửa trôi hợp chất, protein gắn với giá thể - chiết xuất lực ion cao (muối nồng độ cao) thay đổi pH Protein tích điện dương pH < pI gắn với cột cationit (tích điện - âm) Protein tích điện âm pH > pI gắn với cột anionit (tích điện - dương) Trên protein, có vùng tích điện khác so với điện tích tổng thể 11 Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography) Hình 10: Tách chiết protein sắc ký trao đổi ion TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Lokesh Bhattacharyya, Ion Chromatography in Pharmaceutical Drug Characterization, Dionex IC Users Meeting Providence, October 16, 2011 2.www.chromacademy.com/lms/sco111/theory_of_hplc_ion-chromatography.pdf 3.Leo Jinyuan Wang, Marcus Miller, and William Schnute, Quantitative Determination of Bisphosphonate Pharmaceuticals and Excipients by Capillary Ion Chromatography Mass Spectrometry, Thermo Fisher Scientiic, Sunnyvale, CA, USA 12 Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography) 13 ... Trình tự giai đoạn sắc ký trao đổi ion Hình 4: Giai đoạn trình trao đổi ion Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography) - Giai đoạn 1: Nhựa trao đổi ion cân với đối ion Các hợp chất -... Các ion ionic hút vào nhờ lực hút tĩnh điện phân tử mang điện tích trái dấu Dựa theo điện tích trao đổi bề mặt, nhựa trao đổi ion phân loại sau: Nhựa trao đổi cation: Sắc ký trao đổi ion (Ion. .. Anionit base mạnh có nhóm amin bậc –N(CH3)3+OH Anionit base yếu có nhóm amin bậc –NH3+OHHình 1: Nhựa trao đổi cation anion CƠ CHẾ 2.1 Cân trao đổi ion Quá trình trao đổi ion dựa cân trao đổi ion