Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces

Tuy nhiên song song với đó, sự biến đổi nhanh chóng của vi sinh vật gây bệnh làm xuất hiện nhiều bệnh lý phức tạp, cũng như việc sử dụng kháng sinh tràn lan, không hợp lý đã làm cho hiện

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn và lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Lê Thị Thu Hương, người

đã hướng dẫn em từ bước đầu cho đến khi hoàn thành khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Cao Văn Thu đã cho em những góp

ý về kiến thức cùng các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy, công tác tại Bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội, Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, trung tâm phổ ứng dụng viện Hóa học- Viện Hàn lâm khoa học Quốc gia đã giúp đỡ em trong thời gian làm thực nghiệm

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập tại trường

Cuối cùng là lời cảm ơn em gửi tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thận có hạn, khóa luận này vẫn còn nhiều thiếu sót Vì thế, em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy

cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 13 tháng 05 năm 2014

Sinh viên

Vũ Thị Vân Anh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về kháng sinh 2

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 2

1.1.2 Phân loại kháng sinh [11],[16] 2

1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh [16] 2

1.1.4 Cơ chế kháng kháng sinh [10],[16] 3

1.1.5 Vi sinh vật sinh kháng sinh [10] 3

1.1.6 Con đường và phương pháp tìm kiếm kháng sinh [10] 4

1.2 Tổng quan về xạ khuẩn. 4

1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn [5], [7] 5

1.2.2 Đặc điểm tế bào xạ khuẩn [5], [7] 6

1.2.3 Cơ sở phân loại xạ khuẩn và một số khóa phân loại thường dùng [5] 6

1.3 Các phương pháp nghiên cứu về tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn. 6

1.3.1 Tuyển chọn và bảo quản giống 6

1.3.2 Lên men tổng hợp kháng sinh [6],[10], [11] 8

1.3.3 Nghiên cứu tách chiết và tinh chế kháng sinh [10], [11] 10

1.3.4 Nghiên cứu các đặc điểm của kháng sinh [1] 12

1.4 Elaiomycins K và L, kháng sing anzoxy mới được tìm thấy ở Streptomyces sp Tü 6399 [22] 13

1.5 Tăng hoạt tính cụm gen sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất thứ cấp ở Streptomyces grieus bằng các gây đột biến rsmG [24] 14

1.6 Actinomycin X2, chất kháng sinh được phân lập từ quá trình lên men sinh

tổng hợp Streptomyces microflavus [15] 15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16

2.1.1 Nguyên vật liệu 16

Bảng 2.1: Thành phần môi trường nuôi cấy xạ khuẩn 16

2.1.2 Thiết bị 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.3 Phương pháp thực nghiệm 20

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy, giữ giống 20

2.3.2 Nuôi cấy trên môi trường phân loại ISP để định tên xạ khuẩn 20

2.3.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn 22

2.3.4 Phương pháp lựa chọn chủng có hoạt tính cao bằng phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên 23

2.3.5 Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV 24

2.3.6 Phương pháp lên men chìm (hình P6.1, hình P6.2) 25

2.3.7 Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 26

2.3.8 Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của dịch kháng sinh 26

2.3.9 Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ 27

2.3.10 Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký 27

2.3.11 Phương pháp thu kháng sinh tinh khiết 28

2.3.12 Phương pháp xác định cấu trúc kháng sinh 29

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30

3.1 Kết quả chọn môi trường nuôi cấy và chọn VSV kiểm định. 30

3.2 Kết quả nghiên cứu định tên khoa học. 31

3.3 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên. 31

3.4 Kết quả đột biến. 32

3.4.1 Kết quả đột biến lần 1 32

3.4.2 Kết quả đột biến lần 2 33

3.5 Kết quả lên men chìm 33

3.5.1 Kết quả lên men chìm chọn môi trường lên men thích hợp 34

3.5.2 Kết quả lên men chìm chọn chủng có hoạt tính cao nhất 34

3.6 Kết quả thử độ bền pH và độ bền nhiệt. 35

3.6.1 Độ bền pH 35

3.6.2 Độ bền nhiệt 35

3.7 Kết quả chọn dung môi hữu cơ chiết kháng sinh. 35

3.8 Kết quả sắc ký tách kháng sinh tinh khiết. 36

3.8.1 Kết quả sắc cột lần 1 37

3.8.2 Kết quả sắc ký cột lần 2 39

3.9 Kết quả xác định các đặc điểm của kháng sinh tinh khiết. 42

3.9.1 Đặc điểm vật lý của kháng sinh 42

3.9.2 Phổ UV (hình P7.1, P7.2) 42

3.9.3 Phổ IR ( hình P7.3) 42

3.9.4 Phổ khối (hình P7.4) 43

1 KẾT LUẬN 44

2 KIẾN NGHỊ 45

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

B cereus Bacillus cereus ATCC 9946

B pumilus Bacillus pumilus ATCC 10421

B subtilis Bacillus subtilis ATCC 6633

P mirabilis Proteus mirabilis BV 108

P aeruginosa Pseudomonas aeruginosa VN 201

S coelicolor Streptomyces coelicolor

S aureus Staphylococcus aureus ATCC 1228

S typhi Salmonella typhi DT 220

S lutea Sarcina lutea ATCC 9341

S flexneri Shighella flexneri DT 112

DANH MỤC CÁC BẢNG- ĐỒ THỊ - HÌNH VẼ Danh mục bảng:

Bảng 2.1: Thành phần môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Bảng 2.2: Thành phần môi trường nuôi cấy định tên ISP

Bảng 2.3 : Thành phần môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

Bảng 2.4 : Các dung môi hữu cơ sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 3.1 : Kết quả thử hoạt tính kháng sinh trên các môi trường nuôi cấy

Bảng 3.2 : Kết quả phân loại xạ khuẩn theo ISP

Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS của các chủng sau sàng lọc ngẫu nhiên

Bảng 3.4: Kết quả HTKS của các biến chủng sau đột biến lần 1

Bảng 3.5 :Kết quả HTKS của các biến chủng sau đột biến lần 2

Bảng 3.6: Kết quả thử HTKS khi lên men ở các MTdt khác nhau

Bảng 3.7: Kết quả thử HTKS của các chủng và biến chủng sau khi lên men chìm Bảng 3.8: Kết quả thử độ bền với pH của dịch chiết kháng sinh

Bảng 3.9: Kết quả thử độ bền với nhiệt của dịch chiết kháng sinh

Bảng 3.10: Kết quả thử HTKS khi chiết bằng các dung môi hữu cơ khác nhau Bảng 3.11: Kết quả sắc ký lớp mỏng khảo sát hệ dung môi

Bảng 3.12: HTKS của các phân đoạn thu được sau SKC lần 1

Bảng 3.13: Kết quả SKLM của các phân đoạn thu được sau SKC lần 1

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát hệ dung môi chạy sắc ký cột lần 2

Bảng3.15: HTKS của các các phân đoạn thu được sau SKC lần 2

Bảng 3.16 : Kết quả SKLM của các phân đoạn sau thu được sau SKC lần 2 Danh mục hình –đồ thị

Đồ thị 1: HTKS của các phân đoạn thu được sau sắc ký cột lần 1

Đồ thị 2: HTKS của các phân đoạn thu được sau sắc ký cột lần 2

Hình 1.1 : Tủ ấm Binder

Hình 1.2: Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300Lf

Hình 1.3: Máy cất quay Buchi Waterbath B480

Hình 2: Nuôi cấy xạ khuẩn trên MT thạch

Hình 3.1: Đánh giá HTKS của xạ khuẩn bằng phương pháp khối thạch Hình 3.2: Đánh giá HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc

Hình 4.1: Hình ảnh bề mặt và kích thước bào tử Streptomyces 183.212 Hình 4.2 : Hình dạng chuỗi bào tử xạ khuẩn Streptomyces 183.212

Hình 5.1: Bình lên men chìm trên các MTdt sau 7 ngày

Hình 5.2: Dịch lọc lên men sau 7 ngày

Hình 6.1: Phổ UV của kháng sinh

Hình 6.2: Đỉnh hấp thụ UV và độ hấp thụ của kháng sinh

Hình 6.3: Phổ IR

Hình 6.4: Phổ MS

ĐẶT VẤN ĐỀ

Phát hiện kháng sinh là một trong những phát minh vĩ đại mở ra một bước tiến lớn trong việc điều trị các bệnh do vi sinh vật gây ra, đặc biệt là vi khuẩn Trải qua nhiều năm tìm kiếm, nghiên cứu và sản xuất, đã có nhiều kháng sinh mới được phát hiện cũng như tổng hợp Đã có nhiều loài có khả năng sinh kháng sinh được phát hiện, riêng xạ khuẩn đã có tới 660 loài với 3000 chất kháng sinh khác nhau Ngoài

ra công nghiệp hóa dược và sản xuất cũng góp sức tổng hợp nhiều kháng sinh mới Tuy nhiên song song với đó, sự biến đổi nhanh chóng của vi sinh vật gây bệnh làm xuất hiện nhiều bệnh lý phức tạp, cũng như việc sử dụng kháng sinh tràn lan, không hợp lý đã làm cho hiện tượng kháng kháng sinh ngày càng xuất hiện nhiều và đặc biệt hiện tượng kháng chéo (kháng các kháng sinh trong cùng một họ) đặt ra nhu cầu cần phải thực hiện nghiên cứu, tìm kiếm phát hiện các kháng sinh mới cũng như các chủng có khả năng sản xuất kháng sinh mạnh Con đường quan trọng để tìm kiếm các kháng sinh mới vẫn là phương pháp sinh học: nghiên cứu các chủng VSV

có khả năng tổng hợp kháng sinh

Chúng tôi lựa chọn thực hiện đề tài “Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ

Streptomyces 183.212” tại bộ môn Vi sinh-Sinh học với các mục tiêu:

 Sơ bộ định tên khoa học của xạ khuẩn

 Nghiên cứu cải tạo giống, làm tăng khả năng sản xuất kháng sinh của xạ khuẩn

 Xác định điều kiện lên men, chiết xuất, tinh chế kháng sinh

 Xác định sơ bộ một số đặc tính của kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về kháng sinh

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh

Có nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh, trong đó định nghĩa được coi là khá hoàn chỉnh cho rằng : “ Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt được nhận từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm

…) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp.” [11]

1.1.2 Phân loại kháng sinh [11],[16]

Việc phân loại kháng sinh là cần thiết để các nhà khoa học nghiên cứu các kháng sinh mới về cấu trúc hóa học, cơ chế tác dụng, độc tính…

Kháng sinh được phân loại theo nhiều cách khác nhau : theo nguồn gốc, cấu trúc hóa học, cơ chế tác dụng… Trong đó, cách phân loại theo cấu trúc hóa học là cách phân loại khoa học nhất vì nó giúp người nghiên cứu nhanh chóng định hướng các đặc điểm của kháng sinh mới khi biết được cấu trúc hóa học Theo cách phân loại này, kháng sinh được phân vào các nhóm như sau:[11]

 Các kháng sinh có cấu trúc -lactam (penicillin, cephalosporin)

 Các kháng sinh có chứa nhân thơm (chloramphenicol)

 Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycoside (streptomycin, gentamicin)

 Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin)

 Các kháng sinh polypeptide (polymyxin, bacitracin)

 Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin)

 Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B)

 Các kháng sinh chống ung thư nhóm antracyclin (daunorubicin)

 Các kháng sinh chống ung thư nhóm actinomycin (actinomycin D)

1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh [16]

Kháng sinh có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn dựa trên một số cơ chế:

 Ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn

 Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn

 Ức chế tổng hợp acid nucleic (ADN và ARN) của vi khuẩn

 Thay đổi tính thấm của màng tế bào

 Kháng chuyển hóa (ức chế tổng hợp acid folic)

1.1.4 Cơ chế kháng kháng sinh [10],[16]

Kháng thuốc là hiện tượng VSV mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó trong một thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hóa trị liệu Thông thường VSV kháng kháng sinh dựa trên một số cơ chế:

 Tạo enzyme phân hủy hoặc biến đổi kháng sinh

 Thay đổi tính thấm màng tế bào

1.1.5 Vi sinh vật sinh kháng sinh [10]

Trong các VSV có khả năng sinh kháng sinh, xạ khuẩn được quan tâm nhiều nhất vì khả năng sinh ra nhiều loại kháng sinh quan trọng Nhóm xạ khuẩn sinh kháng sinh

thường tìm thấy trong môi trường đất Ngoài ra các loài thuộc chi Bacillus chiếm ưu

thế trong môi trường đất, vì chúng có khả năng hình thành nội bào tử bền vững và

sản xuất kháng sinh quan trọng như bacitracin ức chế sự sinh trưởng các VSV khác Trong nhóm VSV nhân thực (eukaryote) người ta quan tâm đến nhiều các loài thuộc nhóm vi nấm (nấm mốc) Nhiều chất kháng sinh quan trọng như penicillin, cephalosporin, griseofluvin… được tìm thấy và sản xuất ở quy mô công nghiệp 1.1.6 Con đường và phương pháp tìm kiếm kháng sinh [10]

Con đường để tìm kiếm một kháng sinh mới thường đi theo các bước sau:

 Thu nhập các mẫu đất, nước, bùn hoặc mẫu thực vật từ môi trường sinh thái khác nhau sau đó phân lập trên môi trường thích hợp

 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật đã thuần khiết để chọn chủng có hoạt tính ức chế hoặc tiêu diệt các VSV kiểm định

 Chọn chủng có hoạt tính kháng khuẩn cao để nghiên cứu tiếp Lên men để thu nhận lượng kháng sinh cao hơn, cô đặc và tinh chế kháng sinh Xác định loài sinh kháng sinh và xác định các đặc điểm của kháng sinh xem đây có phải là kháng sinh mới

 Thử nghiệm độc tính và phổ kháng khuẩn của kháng sinh

 Nếu chất kháng sinh có thể là kháng sinh mới thì lên men ở mức độ cao hơn, thu nhận kháng sinh thô, tách chiết và tinh chế chất kháng sinh

 Xác định tính chất hóa học của các chất kháng sinh nhận được nếu đạt tiêu chuẩn làm thuốc chữa bệnh thì phải so sánh với các tiêu chuẩn đã liệt kê cho một số loại thuốc được phép dùng hay không

1.2 Tổng quan về xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Bacteria) phân bố rộng trong

đất, nước, bùn… và cả cơ chất mà vi khuẩn cũng như nấm mốc không phát triển được Trung bình trong 1g đất có trên một triệu xạ khuẩn [7]

Phần lớn xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn G(+), có tỉ lệ G+C>55%, dinh dưỡng kiểu hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (hay còn gọi là khuẩn ti) [5], [7]

Xạ khuẩn được quan tâm và nghiên cứu nhiều bởi những sản phẩm trao đổi chất do

xạ khuẩn tạo ra có ý nghĩa quan trọng với con người Trong số kháng sinh hiện đã được biết đến trên thế giới, có đến 60% là do xạ khuẩn sinh ra Ngoài ra, xạ khuẩn còn được dùng để sản xuất nhiều loại enzyme, vitamin, acid hữu cơ [7]

1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn [5], [7]

Hệ sợi của xạ khuẩn chia ra thành khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh Khuẩn ti cơ chất là khuẩn ti cơ bản, còn khuẩn ti khí sinh phát triển mạnh hay yếu hay không phát triển còn tùy vào từng chi, loài Đường kính của khuẩn ti khoảng 0,2 -1,0m đến 2-3m Đa số khuẩn ti không có vách ngăn và không tự đứt đoạn Màu sắc của khuẩn ti xạ khuẩn rất đa dạng : trắng, vàng, da cam, đỏ, lục, lam, tím, nâu, đen… Khuẩn ti cơ chất còn có khả năng tiết ra các sắc tố vào môi trường

Khuẩn ti cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí tạo thành khuẩn

ti khí sinh Vì vậy, người ta còn gọi khuẩn ty khí sinh là khuẩn ti thứ cấp để phân biệt với khuẩn ti sơ cấp (khuẩn ti mọc từ khi bào tử nảy mầm)

Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh của khuẩn ti khí sinh sẽ xuất hiện chuỗi bào

tử Chuỗi bào tử có thể có nhiều hình dạng khác nhau (thẳng, lượn sóng, xoắn, mọc đơn, mọc vòng (vòng đơn cấp hoặc hai cấp)), các đặc điểm này có ý nghĩa quan trọng khi định tên xạ khuẩn Một số xạ khuẩn có sinh nang bào tử trong đó có các bào tử nang

Bào tử trần là cơ quan sinh sản của xạ khuẩn Bào tử trần của xạ khuẩn có hình dạng và đặc điểm rất đa dạng: hình tròn, bầu dục, hình que, hình trụ… Bề mặt của bào tử có dạng trơn nhẵn, xù xì, có vẩy, có gai, có lông Hình dạng và kích thước bào tử có vai trò quan trọng trong định tên xạ khuẩn

Khuẩn lạc xạ khuẩn có những đặc điểm riêng biệt: không trơn uớt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, dạng phấn trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ Khuẩn lạc của xạ khuẩn khác biệt về kích thước so với nấm lạc của vi nấm (sợi khí sinh của vi nấm lớn hơn của xạ khuẩn 5-10 lần)

1.2.2 Đặc điểm tế bào xạ khuẩn [5], [7]

Thành tế bào xạ khuẩn có dạng kết cấu lưới, dày 10-20nm Căn cứ vào kết cấu hóa học, người ta chia thành tế bào xạ khuẩn thành 4 nhóm:

 Nhóm CW I: chứa L, L-DAP, glycin

 Nhóm VW II: chứa Mezo-DAP, glycin

 Nhóm CW III: chứa Mezo-DAP

 Nhóm CW IV: chứa Mezo-DAP, arabinose, galactose

1.2.3 Cơ sở phân loại xạ khuẩn và một số khóa phân loại thường dùng [5]

Có khá nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đã được các nhà khoa học nghiên cứu phát triển, trong đó phải kể đến khóa phân loại của Waksman, Krassilnhikov, khóa phân loại của Gauze…Các khóa phân loại chia lớp xạ khuẩn thành các lớp phụ (bộ)

Actinomycetales và các VSV giống xạ khuẩn Lớp phụ Actinomycetales được chia

thành các họ: Actinoplanacea, Actinomycetacea, Streptomycetacea, Micromonosporacea, Norcadiacea…

Riêng với xạ khuẩn chi Streptomyces trong họ Streptomycetacea, được phân loại theo khóa phân loại Streptomyces quốc tế (ISP) do Shirling và Gotlieb đề xuất

Khóa phân loại này dựa trên các đặc điểm về màu sắc, dinh dưỡng như:màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử, tiêu thụ các đường khác nhau

Ngày nay, phân loại xạ khuẩn còn được dựa trên việc xác định trình tự gen 16S rADN, việc này đã được tiến hành phổ biến ở các phòng thí nghiệm hiện tại và cho kết quả đáng tin cậy

1.3 Các phương pháp nghiên cứu về tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn

1.3.1 Tuyển chọn và bảo quản giống

Việc nghiên cứu, tìm kiếm, thu thập các chủng có năng lực tổng hợp kháng sinh cao

đã được triển khai mang lại hiệu quả kinh tế ngay từ những năm 40 của thế kỉ XX

Việc “tuyển chọn” này là kết quả kết hợp hàng loạt các kĩ thuật chọn giống, tạo chủng và đặc biệt là có sự đóng góp của các kĩ thuật đột biến, dung hợp tế bào, tái

tổ hợp và các giải pháp kĩ thuật gen [6]

 Phân lập từ thiên nhiên: [10]

Dựa trên từng môi trường phân lập khác nhau sẽ thu được chủng cần phân lập Tùy từng chủng muốn phân lập sẽ sử dụng môi trường khác nhau Tùy mẫu cần phân lập sẽ có các cách phân lập khác nhau: phân lập trong không khí hay phân lập các mẫu rắn

 Sàng lọc giống bằng phương pháp ngẫu nhiên [10], [11]

Sàng lọc ngẫu nhiên là phương pháp lựa chọn giống dựa trên sự biến dị tự nhiên giữa các cá thể Trong ống giống thuần khiết, các VSV có biến dị tự nhiên với tần số khác nhau, HTKS có thể tăng lên 20-30% Tiến hành sàng lọc để lựa chọn cá thể có hoạt tính cao nhất, giữ lại để nghiên cứu tiếp

 Cải tạo giống

Để cải tạo giống, có thể sử dụng các phương pháp, kĩ thuật khác nhau:

Gây đột biến: sử dụng các tác nhân đột biến tác động làm thay đổi khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn, phương pháp này dễ thực hiện và cho hiệu quả nhanh Các tác nhân gây đột biến được chia thành các nhóm :[10], [11]

 Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO2), dimethylsulphat hydroxylamine,…

 Tác nhân vật lý: ánh sáng UV, tia X, tia ,  Trong đó, tác nhân hay được sử dụng nhất là sáng sáng UV Ánh sáng UV, 253nm-280nm tác dụng lên acid nucleic dẫn đến dime hóa thymin (TT), thymin – cytosine (TC) hoặc cytosine (CC) tại vị trí C4 và C5 Hậu quả là sao chép bị sai lệch [5], [7], [9]

 Tác nhân sinh học: phage Mu, transposon,…

=> Các tác nhân đột biến hóa học, vật lý với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết hầu hết các VSV Những cá thể nào còn sống sót sẽ có đột biến Đột biến

này có thể làm tăng, giảm, không đổi hoặc mất khả năng tổng hợp kháng sinh của

xạ khuẩn Có thể tiến hành đột biến nhiều lần để thu được chủng có HTKS cao

Sử dụng các kĩ thuật di truyền để tạo chủng tái tổ hợp có hoạt tính kháng sinh cao: dung hợp tế bào trần, chuyển gen… Các phương pháp này khó thực hiện so với gây đột biến nhân tạo

 Bảo quản giống [10]

Hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn cũng như VSV nói chung không những phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy mà còn phụ thuộc vào điều kiện bảo quản Tùy theo trang thiết bị và loại VSV cần bảo quản mà có thể sử dụng một trong các phương pháp khác nhau:

 Đông khô chủng giống : gồm đông khô VSV, đông khô dịch thể trực tiếp

 Giữ bào tử trong cát và các loại hạt vô trùng

 Bảo quản trong tủ lạnh sâu, nhiệt độ âm

 Bảo quản ở nhiệt độ thấp (2oC): phương pháp này còn được gọi là giữ giống trên thạch nghiêng Đây là phương pháp phổ biến và khá đơn giản Tuy nhiên thời gian giữ giống không dài nên cần cấy truyền lại môi trường mới

1.3.2 Lên men tổng hợp kháng sinh [6],[10], [11]

Tất cả các quá trình lên men tổng hợp kháng sinh đều là quá trình lên men ái khí Lên men ái khí được định nghĩa là các quá trình phân giải, chuyển hóa hydratcarbon trong điều kiện ái khí Theo quan niệm chặt chẽ thì chỉ những quá trình lên men sản xuất các sản phẩm sơ cấp được đề cập như lên men sản xuất acid acetic, acid citric, acid glutamic…Theo nghĩa rộng, lên men ái khí được hiểu bao gồm tất cả các quá trình lên men chuyển hóa các nguồn carbon sinh tổng hợp các sản phẩm sơ cấp và thứ cấp trong đó có lên men sản xuất các kháng sinh và cả vitamin… là những lên men có sản phẩm ứng dụng hết sức quan trọng trong ngành Y-Dược

Trong bình lên men, VSV sinh trưởng theo quy luật [5], [7]

Khi nghiên cứu quá trình sinh trưởng này của VSV, nhận thấy các sản phẩm trao đổi chất được chia làm 2 loại Sản phẩm bậc một được tạo thành trong pha sinh trưởng đầu tiên của VSV Trong khi đó sản phẩm bậc hai được tạo thành vào gần lúc kết thúc quá trình sinh trưởng, thường vào gần hoặc chính pha cân bằng Kháng sinh thuộc sản phẩm trao đổi chất bậc hai Nghiên cứu quá trình sinh trưởng phát triển này sẽ giúp điều khiển sao cho VSV phát triển tốt nhất và tạo ra sản phẩm ta mong muốn

Công nghệ lên men phân loại phương pháp lên men thành các loại khác nhau: [6], [10], [11]

 Lên men bề mặt: trong lên men bề mặt VSV phát triển trên bề mặt môi trường dinh dưỡng, oxy được cung cấp từ không khí Phương pháp này không được phát triển trong công nghiệp sản xuất kháng sinh

 Lên men chìm: các VSV nuôi cấy trong môi trường dịch thể, đối với các VSV

kị khí thì không cung cấp khí, còn đối với VSV hiếu khí thì cấp oxy để cho VSV phát triển Đây là phương pháp sử dụng phổ biến trong công nghiệp để sản xuất các chế phẩm sinh học nói chung và kháng sinh nói riêng Lên men chìm được phân loại thành các phương pháp khác nhau:

 Lên men mẻ (lên men chu kỳ): VSV được nuôi cố định trong bình lên men với một thể tích xác định VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra các sản phẩm Kết thúc quá trình, người ta tiến hành các công đoạn cần thiết để thu sản phẩm Phương pháp lên men chu kì được ứng dụng để sản xuất nhiều hoạt chất quan trọng như amino acid, các chất kháng sinh

 Lên men có bổ sung : tương tự như lên men mẻ nhưng trong quá trình lên men có bổ sung dinh dưỡng và các yếu tố cần thiết nhằm làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên Phương pháp này được áp dụng nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng bình lên men

 Lên men bán liên tục: là quá trình lên men VSV trong điều kiện xác định, khi VSV phát triển trong một thời gian đủ để tạo ra nồng độ sinh khối cần

thiết người ta lấy bớt đi một thể tích môi trường bao gồm cả sinh khối, đồng thời bổ sung thêm một thể tích môi trường mới bằng với lượng đã lấy

đi Như vậy với phương pháp này, chỉ cần truyền giống một lần vẫn có thể thu hoạch sản phẩm nhiều lần

 Lên men liên tục: là quá trình nuôi VSV trong thiết bị được cấu tạo đặc biệt để sao cho khi VSV đã phát triển đến giai đoạn hợp lý để lấy đi một thể tích môi trường lên men cùng tế bào và sản phẩm trao đổi chất của chúng, lại bổ sung đúng môt thể tích môi trường dinh dưỡng mới vào bình nuôi cấy lúc đó ta được trạng thái cân bằng động

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men: [6], [11]

 pH môi trường: pH của môi trường ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực tiếp của các ion H+, OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc các cơ chế khác

 Nhiệt độ: nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng, kiểu sinh sản, hình thái, quá trình trao đổi chất và nhu cầu dinh dưỡng của VSV Ở nhiệt độ thấp VSV không phát triển được, ở nhiệt độ cao làm biến tính protein, ARN, VSV có thể

1.3.3 Nghiên cứu tách chiết và tinh chế kháng sinh [10], [11]

Sau khi kết thúc quá trình lên men VSV, giai đoạn chiết xuất thu lấy sản phẩm cũng

vô cùng quan trọng Các sản phẩm cần thu được thường kém bền và hàm lượng của chúng trong môi trường lên men hoặc nuôi cấy thường thấp Vì vậy, để thu được

sản phẩm tinh khiết và hiệu suất cao là khó khăn, tùy theo sản phẩm chứa trong môi trường lên men mà chọn phương pháp xử lý thích hợp

Các phương pháp thường dùng gồm: lọc, ly tâm, chiết tách bằng các phương pháp khác nhau, bốc hơi chân không, sắc ký, điện di, thẩm tích, lọc màng chọn lọc: [10]

 Lọc tách sinh khối:

Trước khi tiến hành chiết rút kháng sinh từ dịch nuôi cấy cần phải loại bỏ sinh khối của VSV bằng phương pháp lọc hay li tâm

 Chiết rút kháng sinh bằng dung môi hữu cơ

Chiết rút bằng dung môi là một trong những phương pháp phổ biến và quan trọng để tách chiết và tinh sạch kháng sinh Đây là phương pháp tách chất dựa trên khả năng hòa tan trong hai chất lỏng khác nhau, không trộn lẫn như nước và các hợp chất hữu cơ, tạo điều kiện cho việc phân tách các chất kháng sinh

 Sắc ký: [1]

Là kỹ thuật được ứng dụng nhiều, với nguyên tắc chung là mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động, pha này có thể là chất khí, chất lỏng hoặc chất lỏng siêu tới hạn được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó Pha tĩnh được cố định trong cột hay trên bề mặt chất rắn Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc tương tác pha tĩnh- pha động- chất tan Nhờ tốc độ khác nhau này thành phần của mẫu

sẽ được tách riêng ra

 Sắc ký lớp mỏng: pha tĩnh được cố định trên bề mặt rắn, pha động di chuyển qua nhờ lực mao dẫn, các chất trong hỗn hợp được tách dựa trên khả năng hấp phụ khác nhau trên bề mặt Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu Rf

 Sắc ký cột: pha tĩnh được cố định trong cột, pha động di chuyển qua nhờ áp suất và trọng lực Các chất trong hỗn hợp tách ra dựa trên sự phân bố khác nhau giữa 2 pha

1.3.4 Nghiên cứu các đặc điểm của kháng sinh [1]

 Phổ tử ngoại – khả kiến:

Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn làm thay đổi mức năng lượng của các electron từ trạng thái cơ bản lên kích thích Căn cứ vào phổ hấp thụ khi chiếu ánh sáng UV-VIS ta có thể xác định một số đặc điểm hoặc định tính chất Phổ UV-VIS được sử dụng định tính bằng cách so sánh với phổ của chất chuẩn

đã có sẵn (so sánh vị trí các cực đại, cực tiểu và tỉ lệ mật độ quang giữa các bước sóng đó), tuy nhiên phổ UV-VIS là phổ cho khá ít thông tin về cấu trúc, thông thường vẫn sử dụng phổ IR để xác định cấu trúc

 Phổ hồng ngoại

Ánh sáng hồng ngoại có năng lượng thấp nên chỉ dẫn đến sự thay đổi các mức năng lượng và chuyển động quay Phổ hấp thụ ánh sáng hồng ngoại thường được gọi là phổ dao động Phổ hồng ngoại thường được sử dụng để nhận dạng các nhóm chức đặc biệt trong phân tử và định tính bằng cách so sánh với phổ chuẩn Đối với hầu hết các hợp chất dạng của phổ IR là đơn nhất và đặc trưng trong vùng 1350-750 cm-1 được gọi là “vùng vân tay” Người ta thường dựa vào tín hiệu trong vùng này để xác định sự “không” có mặt của một nhóm chức

 Phổ khối

Khối phổ khác với các kĩ thuật quang phổ, không sử dụng bức xạ điện từ Là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử hoặc bằng Dalton Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối trước khi đến detector Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch

có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối

Phổ khối được ứng dụng trong định tính các chất:

 Xác định các đồng vị

 Định tính: phổ khối cho phép xác định chính xác khối lượng ion của phân

tử, xem xét các pic để xác định được công thức của chất phân tích Hoặc

còn được kết nối với GC, HPLC so sánh với thư viện phổ để khẳng định thành phần định tính của mẫu

 Xác định công thức cấu tạo : để xác định công thức cấu tạo cần nghiên cứu

kĩ hơn cùng với dùng kĩ thuật ion hóa thích hợp, phối hợp với phổ IR, cộng hưởng từ hạt nhân

=> Sử dụng phối hợp các phương pháp trên sẽ giúp xác định cấu trúc hóa học của kháng sinh đang nghiên cứu

1.4 Elaiomycins K và L, kháng sing anzoxy mới được tìm thấy ở Streptomyces

sp Tü 6399 [22]

Giống Streptomyces sp Tü6399 đã được phân lập từ đất rhizospheric thu thập trong

rừng vân sam nằm trong rừng Rammert gần Tübingen , Đức Chủng được gửi trong

bộ sưu tập chủng tại viện Vi sinh vật, trường Đại học Tübingen, Đức Dòng Tü

6399 đã được kiểm tra đặc điểm hình thái và giải trình tự gen 16S rRNA

Chủng được đem lên men hàng loạt và thu lấy kháng sinh Kháng sinh thu được đem xác định cấu trúc bằng các phương pháp HPLC, UV, MS, NMR và so sánh với kết quả của các kháng sinh trong họ elaiomycin Đồng thời, kháng sinh tạo ra được

xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng các chủng Bacillus subtilis DSM 347,

Staphylococcus LENTUS DSM 6672 và Xanthomonas campestris DSM 2405 , khả

năng gây độc tế bào đối với các dòng tế bào NIH 3T3, HepG2 và HT29, cũng như xác định khả năng ức chế acetylcholinesterase và phosphodiesterase (PDE4 - 4B2 ) Kết quả thu được: Nghiên cứu ban đầu cho thấy sự hiện diện của hai dẫn chất mới

của elaiomycin trong dịch chiết của Streptomyces sp Tü 6399, được khẳng định bởi

sự giống nhau của phổ UV với những chất trong họ elaiomycin Hơn nữa, chúng biểu hiện khối lượng phân tử tương tự và kết quả phân tích trình tự 16S rRNA của

các chủng sản xuất, cho thấy một mối quan hệ rất chặt chẽ với dòng Streptomyces

sp BK 190 sản xuất elaiomycin đã ủng hộ giả thuyết này Sự hiện diện của hai chất

mới của họ elaiomycin được xác nhận bởi phương pháp MS và NMR

1.5 Tăng hoạt tính cụm gen sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất thứ cấp ở

Streptomyces grieus bằng các gây đột biến rsmG [24]

Streptomyces griseus là một xạ khuẩn sống trong đất, thuộc vi khuẩn Gram dương ,

trong đó sản xuất một kháng sinh aminoglycoside, streptomycin, và được đặc trưng

bởi sự hiện diện của một gen streptomycin tự kháng, aphD, mã hóa streptomycin 6- phosphotransferase Nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến rsmG và rpsL kháng streptomycin có thể được tạo ra trong Streptomyces griseus , mặc dù sinh vật này đã

-có mức độ tự kháng tương đối cao với kháng sinh của chính nó Những ảnh hưởng

của đột biến rsmG và rpsL đến sản xuất streptomycin đã được kiểm tra

Kết quả cho thấy: Đột biến trong rsmG có hiệu quả trong việc tăng cường sản xuất

streptomycin , dẫn đến tăng hai đến ba lần trong sản xuất streptomycin , trong khi

đột biến rpsL K88E và đột biến rpsL chèn là không có hiệu quả Ngoài ra, các đột biến không có đột biến một trong hai rsmG hoặc rpsL cho thấy khả năng suy giảm sản xuất streptomycin Nghiên cứu đã phân tích phiên mã của metK, adpA và strR, cùng với một số gen liên quan đến sinh tổng hợp streptomycin ( strB, strF và strD ) Theo dự kiến, các đột biến rsmG, nhưng không phải là đột biến rpsL K88E, có sự biểu hiện cao của metK, strR, strB, strF và biểu hiện strD so với chủng gốc ở giai

đoạn tăng trưởng cuối do đó cơ bản các tăng cường sản xuất streptomycin trong đột

biến rsmG

Phân tích sự biểu hiện của18 gen thuộc 18 cụm gen chuyển hóa - sinh tổng hợp thứ

cấp trong Streptomuces griseus (phân tích phiên mã bởi PCR thời gian thực), kết

quả cho thấy mức độ biểu hiện của các gen này là khá thấp ( 1/10-1/1000 so với

cùng kỳ strB1 Phân tích phiên mã cụm gen chuyển hóa - sinh tổng hợp thứ cấp các RNA được chiết xuất từ các tế bào hoang dại và đột biến rsmG ( KO- 1050 ) dòng đột biến phát triển đến giai đoạn tăng trưởng cuối) Kết quả cho thấy rsmG

đột biến có hiệu quả không chỉ cho tăng cường sản xuất streptomycin nhưng cũng

để kích hoạt các gen im lặng hoặc biểu hiện yếu trong Streptomyces griseus

1.6 Actinomycin X 2 , chất kháng sinh được phân lập từ quá trình lên men sinh

tổng hợp Streptomyces microflavus [15]

Trong số các Streptomyces được phân lập từ cơ chất Việt Nam tại phòng thí nghiệm

Vi sinh vật học, Bộ môn Vi sinh và Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội có

Streptomyces 15.29 là chủng xạ khuẩn có độ ổn định di truyền tốt, có khả năng sinh

tổng hợp kháng sinh phổ rộng có tiềm năng trong phòng, chữa bệnh Bằng phương

pháp giải trình tự gen 16s rADN đã xác định tên khoa học là Streptomyces

microflavus

Bằng phương pháp lên men Streptomyces microflavus, từ dịch chiết ethyl acetat của

dịch lên men này, các chất được phân lập bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột (CC) Cấu trúc hóa học được xác định dựa trên các phương pháp: đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối lượng phun mù điện tử, phổ cộng hưởng từ

hạt nhân NMR Kết quả: đã biện giải được cấu trúc kháng sinh do Streptomyces

microflavus sinh ra Hợp chất 1 được xác định là actinomycin X2, một hợp chất

cũng được phân lập từ chủng Streptomyces spp Và có hoạt tính chống ung thư và

kháng sinh rất mạnh Đây là lần đầu tiên dữ kiện phổ NMR của actinomycin X2

được thông báo

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

2.1.1.1 Các chủng sinh vật

1 Xạ khuẩn: Chủng xạ khuẩn Streptomyces 183 212 được phân lập từ mẫu đất

lấy tại Quận 9- thành phố Hồ Chí Minh, tại bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội

2 Vi sinh vật kiểm định: các chủng VSV (vi khuẩn) do bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp, bao gồm:

1 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Bảng 2.1: Thành phần môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

2 Môi trường nuôi cấy định tên theo ISP

Bảng 2.2: Thành phần môi trường nuôi cấy định tên ISP

Môi trường ISP 9:

Các nguồn đường: D-Glucose; D-Mannitol; Raffinose; Inositol; D-Fructose;

Rhamnose; D-Xylose; L-Arabinose; Saccarose tiệt khuẩn bằng phương pháp Tyndal

ISP9: (NH4)2SO4 2,64 g; KH2PO4 2,38g; K2HPO4.3H2O 5,65g; MgSO4.7H2O 1,0g; dung dịch B 1,0g; nước cất 1000ml; pH 6,8-7,0 (tiệt khuẩn 120oC trong 30 phút) sau đó để nguội đến 60oC và cho thêm các đường đã tiệt khuẩn trên sao cho nồng độ đường trong dung dịch khoảng 1%

3 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

Bảng 2.3 : Thành phần môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

Thành phần Môi trường

NaCl (g)

Cao thịt (g)

Pepton (g)

Thạch (g)

Nước máy (ml)

7,4

7,2

7,0-7,4

7,2-Canh thang 0,5 0,3 0,5 0 100

4 Dung môi hữu cơ:

Bảng 2.4 : Các dung môi hữu cơ sử dụng trong nghiên cứu

Dung môi Khối lượng riêng (g/ml) Nhiệt độ sôi (oC)

 Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300Lf, tủ cấy vô trùng Aura VF 48, tủ ấm Memmert, Binder, tủ lạnh Deawoo, Samsung (phụ lục 2)

 Thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm, buret, pipet chia vạch, pipet Pasteur, ống đong, phễu thủy tinh, cốc cỏ mỏ, ống nghiệm, bình nón, bình định mức, đĩa Petri, bông, đèn cồn, đũa thủy tinh, kim mũi mác, patuyn, thìa thủy tinh, que cấy đầu tròn, que chang…

 Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt, máy UV-VIS Hitachi U-1900, máy đo

MS, máy đo IR Impact 410 – NicoLet- USA

2.2 Nội dung nghiên cứu

1 Nghiên cứu định tên khoa học của xạ khuẩn

2 Nghiên cứu cải tạo giống làm tăng khả năng sản xuất kháng sinh của xạ khuẩn

3 Nghiên cứu lên men, chiết xuất, tinh chế kháng sinh

4 Nghiên cứu các đặc tính của kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra

2.3 Phương pháp thực nghiệm

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy, giữ giống

 Chủng xạ khuẩn được nuôi cấy và giữ giống trên môi trường nuôi cấy có thạch

 Để bảo quản giống, chủng được cấy zigzag trong ống nghiệm với môi trường thạch nghiêng thích hợp, để trong tủ ấm 28oC trong 6 ngày để phát triển và bảo quản trong tủ lạnh 2oC Định kỳ cấy truyền khoảng 3 tháng/lần

2.3.2 Nuôi cấy trên môi trường phân loại ISP để định tên xạ khuẩn

 Chuẩn bị môi trường:

 Các môi trường ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, ISP6, ISP7 được chuẩn bị, hấp tiệt trùng và phân vào các hộp Petri (20ml/hộp) Mỗi môi trường làm 4 ống

 Môi trường ISP9, nguồn đường được hấp tiệt trùng theo phương pháp Tyndal, các thành phần còn lại được tiệt trùng ở 120oC trong 30 phút rồi để nguội, sau khi trộn đường vào các thành phần còn lại, môi trường được đổ ra hộp Petri, mỗi đường làm 4 hộp, 4 hộp chứng âm (không có đường)

 Cấy zigzag chủng xạ khuẩn lên các môi trường có thạch hoặc lấy 1 vòng que cấy và trộn lẫn vào môi trường lỏng (ISP1) Sau khi cấy, hộp Petri được giữ trong tủ ấm 28oC

 Theo dõi kết quả:

 Với các môi trường ISP1-5: đọc kết quả vào các ngày 7,14,21 Đặc điểm cần theo dõi:

 Màu khuẩn ty khí sinh, quan sát trên bề mặt khuẩn lạc: màu đỏ (R), màu vàng (Y), màu xanh lá cây (G), màu xanh da trời (B), màu tím (V), màu xám (Gy), màu trắng (W) Trường hợp có màu xen kẽ thì ghi các màu liền nhau

 Màu khuẩn ty cơ chất: quan sát mặt sau của khuẩn lạc Thường khuẩn ty

sẽ có màu vàng nâu, vàng nâu ánh đỏ, da cam, vàng nâu ánh xanh da trời, tím, vàng nâu lẫn xanh lá cây Nếu xuất hiện màu trên kí hiệu là (1), nếu không có kí hiệu là (0)

 Chuỗi bào tử và bề mặt bào tử được quan sát bằng kính hiển điện tử độ phóng đại cao Dạng chuỗi bào tử: thẳng (R), uốn cong (RF), móc câu (RA), lò xo (S) Nếu chuỗi bào tử có nhiều đặc điểm thì ghi đầy đủ (ví dụ SRA) Bề mặt bào tử có thể phẳng nhẵn (sm), sần sùi mụn cơm (wa), có gai (sp), có tóc (ha)

 Sắc tố hòa tan nằm trong môi trường có các màu : vàng , đỏ, tím, xanh… nếu có thì kí hiệu là (1), không có kí hiệu là (0)

 Với môi trường ISP6, ISP7, theo dõi kết quả vào ngày 2 và 4 Đặc điểm cần theo dõi là sắc tố melanin (màu đen hoặc nâu đen) Nếu có kí hiệu là (1), không có kí hiệu là (0)

 Với môi trường ISP9, theo dõi kết quả vào các ngày 12,14,16 Đặc điểm theo dõi là mức độ phát triển của xạ khuẩn Chứng dương là ống chứa glucose, chứng âm là ống không chứa đường Nếu chủng phát triển mạnh hơn hoặc bằng chứng dương kí hiệu là (+), nếu yếu hơn hoặc bằng chứng

âm kí hiệu là (-), nếu yếu hơn chứng dương, mạnh hơn chứng âm kí hiệu là ()

2.3.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn

 Đánh giá hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn bằng phương pháp khuyếch tán

 Nguyên tắc: Chất kháng sinh khuyếch tán vào môi trường dinh dưỡng đặc đã cấy VSV kiểm định, tạo ra các vùng ức chế VSV gọi là vòng vô khuẩn

 Cách thực hiện:

 Chuẩn bị đĩa Petri chứa VSV kiểm định:

 Tạo hỗn dịch VSV: lấy 1 vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2,5 ml môi trường canh thang, hỗn dịch sau khi cấy để trong tủ ấm 37oC trong 18- 24h để VSV phát triển thành hỗn dịch chứa 106-108 tế bào/ml

 Sau 24h, hỗn dịch VSV đã cấy được trộn đều vào môi trường thạch thường đã tiệt trùng và để nguội đến 50oC, lắc đều rồi phân ra các đĩa Petri (20ml/đĩa) Tỉ lệ trộn hỗn dịch vào môi trường là 2,5 : 100

 Đưa mẫu cần thử hoạt tính vào môi trường chứa VSV kiểm định:

 Phương pháp khối thạch: đục các khối thạch có đường kính khoảng 6mm trên đĩa Petri chứa mẫu cần thử hoạt tính, sau đó đặt các khối thạch lên bề mặt của đĩa Petri chứa VSV kiểm định (hình P4.1)

 Phương pháp giếng thạch: đục các giếng thạch có đường kính khoảng 6mm trên đĩa Petri chứa VSV kiểm định, nhỏ vào các giếng thạch đã đục khoảng 0,05 ml mẫu thử

 Phương pháp khoanh giấy lọc: tẩm các dịch mẫu thử vào khoanh giấy có đường kính khoảng 6mm, mỗi khoanh giấy sau khi tẩm được sấy khô ở

nhiệt độ thích hợp với mẫu thử (lặp lại 3 lần) Đặt các khoanh giấy đã tẩm mẫu lên đĩa Petri chứa VSV kiểm định (hình P4.2)

 Các đĩa Petri đã có mẫu thử được đặt trong tủ ấm 37oC trong 24h, sau 24h được đem ra đo kết quả, hoạt tính của kháng sinh được đánh giá thông qua đường kính vòng vô khuẩn tạo ra trên đĩa

 Đánh giá kết quả: đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer (Độ chính xác 0,02mm) Kết quả trung bình được tính theo công thức:

D = ∑ s = ∑ ( )

Trong đó:

D (mm): đường kính trung bình vòng vô khuẩn

D (mm): đường kính vòng vô khuẩn thứ i

s : độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh

n: số thực nghiệm tiến hành song song ( thông thường n = 3)

2.3.4 Phương pháp lựa chọn chủng có hoạt tính cao bằng phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên

 Chuẩn bị: 1 ống nghiệm chứa 10ml nước cất, 5 ống nghiệm chứa 9ml nước cất, môi trường nuôi cấy thích hợp, đĩa Petri, pipet, que chang (tất cả được hấp tiệt trùng)

 Tiến hành

 Pha hỗn dịch bào tử: lấy 1 vòng que cấy bào tử xạ khuẩn, phân tán đều trong ống nước cất 10ml, hỗn dịch thu được có nồng độ bào tử 10-1 Từ hỗn dịch trên, tiếp tục pha loãng ra các nồng độ 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6

 Dùng pipet hút 0,1ml các hỗn dịch có nồng độ từ 10-6 đến 10-4 và nhỏ vào các đĩa Petri riêng rẽ Dùng que chang chang cho hỗn dịch phân bố đều trên

bề mặt đĩa Petri

 Để các đĩa Petri vào tủ ấm 28oC trong vòng 6 ngày Sau 6 ngày, các khuẩn lạc sẽ mọc riêng rẽ trên bề mặt đĩa Petri Chọn các khuẩn lạc phát triển tốt,