Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34
Trang 1BO Y TE
TRUONG PAI HOC DUOC HA NOI
ea AKA RK EERE
PHAM THI DIEU HUYEN
NGHIEN CUU LEN MEN SINH TONG HOP
KHANG SINH NHO STREPTOMYCES 16.34 (KHOA LUAN TOT NGHIEP DUGC SI KHOA 2003- 2008)
- Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu
Th.s Nguyễn Liên lương - Nơi thực hiện: Bộ môn Vỉ Sinh và Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nội
- Thor gian thực hiện: 02-95⁄20/4
Trang 2LOI CAT OR
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin giri loi cam on chan thanh dén thay
giáo PGS TS Cao Văn Thu, người thầy đã tận tình trực tiếp hướng dẫn
tơi thực hiện và hoàn thành khố luận này
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên đang giảng dạy, làm việc tại bộ môn Vi Sinh và Sinh Học, bộ môn Công nghiệp Dược và Phịng thí nghiệm trung tâm đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng Loàn thể các thầy giáo, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã đạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường
Tôi xin bày tơ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và ủng hộ trong suốt thời gian thực hiện khoá luận
Với thời gian thực nghiệm có hạn, khoá luận chắc chắn cịn nhiều điều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô, bạn bẻ đồng
nghiệp để khố luận hồn thiện hơn
Xin chan thành cam on
Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2008
Sinh viên
Trang 3MỤC LỤC
Ua ga - .- = ẽ== l
ELAN 13 THING CA oo sie ceecterersincnceniceumeneuie 2
1.1 Đại cương về PTR GÌ N bu net cacd tao dcá6ssasoliSoslseedbiawsekss 2 LAD, SRA TA RAG SOA ácvccceoiecidietoticeiidGciatiaivavltsissesse 2 Lodi PROBE khôri0 NHHH:.us¿ccoerueocoaioibiseirgtiatsigStau1ii605096860601á666 2 1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh - «5< 5 5< 5ccsexess 3 1.2 Đại cương về xạ khuẩn 2 -22222222222225222222222222221212E Xee 3 13:1 Lêu sự khuâu: (0 NMGHiNWGGŠ]‹ueiiciangidikddiiaidtiLkligiikigdaidnduie 3 1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chỉ Š/repf0iy€es cccccc<cccccccca 4 |.2.3 Kha nang sinh tong hop khang sinh cua Streptomyces 6
1.3 Tuyển chọn, cải tạo và báo quản giống xạ khuẩn 7 1.3.1 Tuyến chọn, cải tạo giống xạ khuẩn - - «sec 7
1.3.2 Bao quan ging xa KAUAN cece eceeceeceeececeeseessesessessteseeseeaeens 9 1.4 Lên men sinh tông hơn kháng BHỈ seeaeeeeooeneoeeiereeereec 9 1.4.1 Gidng Vi sinh Vat c.sessesssssssssessssssssecssessersscseesseessesaesavessesssssenars 9 1.4.2 LÊN mCT - -Q 0S HH HH HH nh 9
1.5 Chiết tách, tỉnh chế kháng sinh từ dịch lên men 11
1.5.1 Chiết xuat, tach san pham ccccecscesscsssesssecsssssevessvvessvesessen i
135.2, Tính OB ce«seeosneeeiibnaoekieekkidoi.Cizbitselisigidogcioilaslgrdsisstgr<l2 12
1/6: Quang Bhê hồng giá Rkoaeieeiaiaoaiaaaarrsoaiagasgena 13 1.7 Một số nghiên cứu mới về kháng sinh 525 13
PHÁN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUUÁ .5-55-55 16
Trang 42.1.1: 4 đi)Yễ(ï vật lIỀN ;suaciaagiocciicodsGsrtiaxeitibcgioiaiigkaliagussyikdilaoyss l6 2.1.2, Các phương phần thực HE NIỆNHH c.cecccecooeciieiiueeiidiokbiaocdaund 19 2.2 Kết quả thực nghiệm va nhan Xét 0 ccc cccecseseceseesseeeeeeenees 25
B21 ROG giiá bi To ngâu HHÌN xueesesaoesisokkabdaxoeseaseergjsai 25
2.2.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 26
2.2.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 27 2.2.4 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh -.-. 28
2.2.5 Kết quả chiết xuất kháng siỉnh 2 5-s+7e<Szz sec 29 DB MC Gath She ký lếp HH hoá gà th ga gua tua gdat,suy se 30
2.2.7 Kết quả kiểm tra sự biến đổi của bột kháng sinh thô 30 1118: KỆ E08 SN KG TỦ cucnguyng Ghà G0020) 0t20G00330016806030034388.0 0s 32
2.2.9 Kết quả kiểm tra sự biến đổi hoạt tinh cua bat kháng sinh tĩnh
KẾT xung hg nhgg4ibEGiAp gia d4i230i3:G01ãu:g)2A45603,1 02130,4210180xu2h:3igag0n5050.8 36
2.2.10 Kết quả phân tích phố hồng ngoại ¿ - <5 5 B7
PHAN 3: KET LUAN VA DE XUAT ooo cccccccccecccssesscseseseesseeeees 38 BRET COI xiiasuunu2 nữ hay gg.0E2201600010010:20.0/0000304423018056184100808061g/ 380 38 Hit.) 00flfT hoa yoepobongneorafl4010409940162/0801000100100/00001100030/7001G07118000030/40.ã0F 38
Trang 5ADN ARN B.pumilus P.mrabilis D (mm) Gr(-) Gr(+) KS MT MT dd PL PTL § STT SKLM VSV
CHÚ GIAI CHU VIET TAT
Acid deoxyribonucleic Acid ribonucleic
Bacillus pumilus ATCC 10241 Proteus mirabilis BV 108
Đường kính vịng vơ khuẩn Gram am
Gram dương Kháng sinh Môi trường
Môi trường dung dịch
Phần phụ lục
Phân tử lượng
Độ lệch thực nghiệm chuẩn đã hiệu chỉnh
Số thứ tự
Trang 6ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự phát triển về vi sinh vật học nói chung, và vi sinh vật công nghiệp nói riêng, với bước ngoặt lịch sử là phất minh về chất kháng sinh của Fleming(1928) cùng với Chain và Florey (1940) đã mở ra kỷ nghuyên mới trong y học: khai sinh ra ngành công nghệ sản xuất chất kháng sinh và ứng dụng thuốc kháng sinh và điều trị bệnh cho con người Tuy nhiên, hiện nay do nhiều nguyên nhân khác nhau nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh đã kháng lại nhiều loại kháng sinh kinh
điển Do đó, nhu cầu nghiên cứu và sản xuất ra những kháng sinh mới có đặc tính
trì việt hơn là rất cần thiết
Trong số hơn 10.000 kháng sinh đã được tìm ra thì có đến 66% kháng sinh
do xạ khuẩn sinh ra Và từ các cheủng xạ khuẩn thuộc chỉ Streptpmyces cc nha khoa học đã phát hiện ra nhiều loại kháng sinh với hoạt phổ rộng trên vi khuẩn, nấm và I số có khả năng kháng tế bào ung thư va HEV
6 Việt Nam, hiện nay cac chung Streptomyces da duge phan lap va nghiên cứu rộng rãi nhằm phục vụ việc tìm kiếm những kháng sinh mới góp phần cho
quá trình điều trị hiệu quả
Sau thời øian nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn đề tài: “ Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 16.34” vGi nhig muc tiéu sau:
- Tiến hành nghiên cứu cải tạo giống nhằm tạo ra biến chủng có khả nang
sink lổng hợp kháng sinh ca hơn sẽ với chủng gốc
- Lua chon mdi trường và biến chủng lên men, chiết xuất, tỉnh chế kháng
sinh
- Dự đoán sơ bộ một số nhóm chức trong cấu trúc phân tử của kháng sinh do
Trang 7PHẦN 1
TONG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH
1.1.1 Định nghĩa kháng sinh [1]
Thuật ngữ kháng sinh theo quan niệm truyền thống được định nghĩa là
những chất do các vi sinh vật (vi khuẩn, vi nấm., ) tạo ra có khả năng ức chế
sự phát triển hoặc tiêu diệt vì khuẩn khác
Hiện nay kháng sinh được định nghĩa như sau:
Kháng sinh là những chất cơ nguỗn gốc vì sinh vật, được bắn tổng hợp
hoặc tổng hợp hoá học Với liều thấp có tác dụng kừmn hãm hoặc tiêu diệt vỉ sinh vat gay bệnh
1.1.2 Phân loai khang sinh [1], [3]
Có thể phân loại kháng sinh theo nguồn gốc (kháng sinh do xạ khuẩn vi khuẩn, nấm) tạo ra; theo cơ chế tác dụng (kháng sinh ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, ức chế tổng hợp protein, ức chế tổng hợp nhân ức chế chuyển hóa,
thay đổi tính thâm của màng tế bào) và phân loại theo cấu trúc hoá học Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hoá học là khoa học nhất, bao gồm các nhóm:
- Nhóm beta lactam: penicilin, cephalosporin, carbapenem, monobactam - Nhém aminoglycosid (aminosid): streptomycin, gentamicin, tobramycin
Nhém macrolid: erythromycin, clarithromycin, spiramycin - Nhóm lincosamid: lincomycin, clindamycin
- Nhém phenicol: cloramphenicol, thiamphenicol - Nh6m tetracyclin: tetracyclin, doxycyclin - Nhóm peptid: vancomycin, polymyxin, bacitracin - Nhom quinolon: acid nalidixic, ciprofloxacin, ofloxacin - Nhém co- trimoxazol: co- trimoxazol
- Cac kháng sinh khác: Rifamicin, kháng sinh chống nấm chống ung thư
Trang 81.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh [4]
Môi kháng sinh đều có đích tác dụng nhất dịnh trong các tế bào vỉ sinh
vật mãn cảm, tuy nhiên có thể khái quát thành 6 nhóm tác dụng chính:
- Thanh té baa: beta- lactam, vancomycin, bacitracin; - Mang té bao chat: amphotericin, poly-en, valinomycin; - AND: actinomycin, antracyclin, anzamycin (rifamicin);
- Téng hop protein: aminoglycosid (ribosome), macrolid (lién két -ARN), chlorocid, tetracyclin, acid fuzidic (kéo dai mach polypeptid);
- Trao đổi chất hô hấp: antimycin, oligomycin;
- Trao đổi chất folat: sulfamid
1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN
1.2.1 Lớp xạ khuẩn (Actinomycetes) [4], [7] [9] Đặc điểm chung:
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gr (+), có tí lệ G+C > 55% Đại đa số xa khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng phân nhánh Trong số, hơn 10.000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khoảng 66% là do xạ khuẩn tao ra Xa
khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzym (amylase, cellulase,
glucoizomerase, protease ) Xạ khuẩn gây bệnh cho người và động vật là trường hợp rất hạn hữu
Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn:
Trang 9Đa số khuẩn tv xạ khuẩn khơng có vách ngăn
Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn rất phong phú (màu da cam, đỏ, lục lam,
nâu, trắng, vàng, xám .)
Khuẩn ty cơ chất có thể tiết vào mơi trường I số loại sắc tố có thể tan
trong nước hoặc chỉ tan trong dung môi hữu cơ
Khuẩn lạc của xa khuẩn không trơn ướt như ở vi khuẩn, nấm men mà
có dạng thơ ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp toả ra theo hình phóng xạ
Đặc điểm cấu tạo tế bào:
Thành tế bào xạ khuẩn: dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20mm Màng tế bào chất: chủ yếu là phospholipid va protein, day 7,5-10mm Mezosom: hình phiến, hình bọng hay hình ống
Các thể ẩn nhập trong tế bào chất: gồm các hạt polyphosphat, các hạt polysaccarid
1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces [5], [7], [11]
Đặc điểm hình thái: Khuẩn lạc:
+ Tạo thành cụm, bề mặt khô, xù xì, được bao phủ bởi một lớp bột mịn
như bụi phấn hoặc bởi những sợi nhỏ bông như lơng tơ
+ Khuẩn lạc có chân khá vững chác khó tách khỏi môi trường nuôi cấy
+ Hệ sợi của khuẩn lạc: khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh
Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhãn hoặc sần sùi
Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển đài ra trong không
khí Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất
Trang 10-_ Chuỗi bào tử: có thể mọc đơn hoặc mọc vòng gồm các hình thái cơ bản như thẳng, cong, móc câu đơn hoặc kép, xoắn lò xo
- Bao tt tran:
+ Được hình thành do sự phân cát của chuỗi bào tử, là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn
+ Bào tử trần có thể có hình cầu, hình bầu dục, hình que, hình trụ Các
bảo tử tập hợp với nhau thành chuỗi từ 10- 50 bào tử hoặc nhiều hon
+ Bé mat bào tử có dạng trơn nhận (sm), xù xì mụn cơm (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (ha)
Đặc điểm sinh lý:
- — Sfreptomyces là VSV dị dưỡng, nguôn cacbon thường dùng là đường, tỉnh bột và nhiều chất hữu cơ khác: nguồn nitơ hữu cơ là protein pepton, cao ngô, cao nấm men; nguồn nItơ vô cơ là nitrat, muối amoni Khả năng đồng hoá ở các loài khác nhau là khác nhau
-_ S#epfomyces là loài xạ khuẩn hô hấp hiếu khí Nhiệt độ tối ưu của chúng
thường là 25°C- 30C, một số lồi có thể mọc tốt ở nhiệt độ cao hơn, pH tối ưu
thường từ 6,8-7,5
Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố được tạo thành từ S!zepfomyces được chia thành 4
loại: sắc tố hoà tan, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố của khuẩn ty cơ chất và sắc tố melanoid
Phan loai Streptomyces:
Hội nghị vi sinh vật thế giới lần thứ 10 được tố chức tại Mexico vào năm 1970 chọn khoá phân loại của E.B Shirling & D.Gottlied làm khố phân loại chính để phan loai chi Streptomyces va dat tén 1a International Streptomyces Project ( ISP)
Trang 11- Pac điểm hình thái học của xạ khuẩn: màu sắc khuẩn ty cơ chất, khuân ty khí sinh hình dạng chuỗi bào tử và bề mặt bào tử
- Dac điểm sinh lý học: Kha nang tao sac tố hoà tan, khả nãng tạo sắc tố melanoid va kha nang sit dung cdc nguồn đường của xạ khuẩn
1.2.3 Khả năng sinh tổng hop khang sinh cia Streptomyces [5] Những khang sinh do cac loai cla chi Sirepiomyces téng hop rat da dang
Kháng sinh Chủng sinh tổng hợp Phổ tác dụng
Acid clavulanic Streptomyces clavuligerus Vi khuẩn G'
Actinomycin Streptomyces antibioticus Ung thư
Adriamycin Streptomyces peucelicus Ung thu Amphotericin B_ | Streptomyces nodesus Nấm Cloramphenicol Streptomyces venezuelae Vi khuan G* Daunomycin Streplomyces peucelicus Ung thu Erythromycin Streptomyces erythreus Vi khuan G* Kanamycin Streptomyces kanamyceticus Vi khuẩn G
Kasugamycin Streptomyces kasugaensis Vi khuẩn G' và G va F LincomycIn Sireptomyces lineolnensis Vi khuẩn G*
Monensin Sireptomyces cinnamonensis — Vikh uan G* vi G va M yc Nystatin Sireplomyces Noursel Nam
Paramomycin Streptomyces rimosus | Don bao | Trichomycin _ Streptomyces hachijoaensis Nam va don bao
Trang 12
1.3 TUYỂN CHỌN, CAI TAO VA BAO QUAN GIONG XA KHUAN
1.3.1 Tuyển chọn, cải tao giéng xa khuan [3], [5] [6] [7] [10]
Việc chọn giống vi sinh vật cho một quy trình công nghệ là điều hết sức quan trọng Để có giống vi sinh vật có hoạt tính cao, người ta phải tìm cách hồn thiện genotype với các phương pháp: chọn lọc lai tạo, gây đột biến trong chất liệu đi truyền của tế bào hoặc trong hệ thống điều hoà trao đổi chất
1.3.1.1 Chọn chủng có hoạt tính cao bảng phép chọn lọc tự nhiên
Các vị sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể hoạt tính kháng sinh tăng 20% so với những cá
thể khác Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để
nghiên cứu tiếp
Tiến hành cấy giống trên hộp Petri sao cho môi hộp chỉ có 10-20 khuẩn lạc tách riêng biệt, sau đó tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng sinh của chúng bằng phương pháp khối thạch Và chọn chủng có hoạt tính mạnh nhất
cho các bước cải tạo giống tiếp theo
1.3.1.2 Đột biến cải tạo giống xạ khuẩn sinh kháng sinh
Đột biến nhân tạo là quá trình gây biến đổi tế bào vi sinh vật nhờ các tác nhân đột biến nhân tạo (hoá học, vật lý, sinh học) với tần xuất đột biến
ting gdp nhiều lần
Những cá thể nào sống sót sẽ biến đổi nhiễm sắc thể, làm thay đổi các tính trạng dân đến hoặc làm mất khả năng sinh tổng hợp kháng sinh (đột biến âm tính) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến
dương tính)
Tác nhân sảy đột biến: Hoá học (hydroxylamin, các acridin ); vật lý (ánh sáng UV, tia gamma, tia X ): sinh học: gen nhảy
Trang 13Trong khoá luận chúng tôi sử dụng phương pháp đột biến nhân tạo bằng ánh sang UV
- Một số tính chất của ánh sáng UV: ánh sáng UV có khả năng đâm xuyên
kém Tuy nhiên với tế bào VSV có kích thước nhỏ (0,3-3 „ m) thì có khả năng
dâm xuyên tới tận nhân Vì vậy, đây là tác nhân được dùng phổ biến trong đột biến cải tạo giống
- Cơ chế đột biến bang ánh sáng UV: ánh sáng UV tác dụng chủ yếu lên acid nucleic, mạnh nhất là vùng 260nm, dẫn đến hiện tượng đime hoá timin, ở dây 2 timin gần nhau dược liên kết cộng hoá trị với nhau ở nguyên tử C số 5
và 6 Hậu quả là sao chép bị sao lầm vì DNA:polymerase dé lâp một nueleotid
khơng chính xác vào vị trí trên Do tác dụng của ánh sáng LIV trên sợi ADN
xuất hiện một dime pyrimidin khác gọi là quang sản phẩm 6-4, ở đây C-6 của
pyrimidin 5’ (T hoac C) được liên kết với C-4 của pyrimidin 3” (thường là C) Các sản phẩm này là nguyên nhân chủ yếu của đột biến gây nên bởi ánh sáng
UV
Các yếu tổ ảnh hướng đến tác đụng gây chết và tân số phát sinh đột biển: - Liều lượng chiếu: Được đặc trưng bởi 3 tham số là thời gian chiếu,
khoảng cách chiếu và độ pha loãng bào tử Thường thì đột biến dương sẽ xuất
hiện ở những liều lượng chiếu có độ sống sót bào tử từ 0,1%- 1%, còn đột biến
âm sẽ xuất hiện ở những liều lượng chiếu cao hơn
- Ánh sáng thường: Sau khi đột biến bang ánh sáng UV, nếu đem chiếu
ánh sáng thường (bước sóng 320nm- 480nm) trở lại thì sẽ có khoảng 50%-
80% tế bào được phục hồi do tác dụng của men photolyase Hiện tượng này được gọi là quang phục hoạt
Trang 141.3.2 Bao quản giống xạ khuẩn [10], [11]
Mục đích: Giữ cho VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền khơng bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ
Có nhiều phương pháp khác nhau dể giữ giống VSV (đông khô, lạnh
sâu ) Trong quy mơ phịng thí nghiệm, giống xạ khuẩn thường được giữ
trên môi trường thạch nghiêng trong tủ lạnh (nhiệt độ 2-4°C) định kỳ 3-6
tháng cấy truyền
1.4 LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH [3], [5], [10], [11] 1.4.1 Giống vi sinh vật
Giống VSV trước khi đem gieo cấy vào các bình lên men phải được
tuyên chọn cần thận Chi những cá thê có hoạt tính như mong muốn mới được truyền giông và nhân lên trong các bình giống cấp 1, 2, 3
1.4.2 Lên men
Lên men là giai đoạn nuôi vi sinh vật để chúng tạo sản phẩm hoặc là
sinh khối vi sinh vật, hoặc là các sản phẩm trao đổi chất bậc 1,2, Đây là
khâu quyết định kết quả của một quy trình lên men
Để thực hiện lên men, người ta thường sử dụng hai phương pháp chủ yếu sau: lên men bề mặt và lên men chìm
1.4.2.1 Lên men bề mặt:
Lên men bề mặt là thực hiện nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt môi
trường dịch thể hoặc môi trường bán rắn VSV hấp thụ các chất của môi trường và sử dụng ưxy khơng khí để hơ hấp trên bên mặt của môi trường dinh
dưỡng Do đó, yêu cầu của môi trường lên men phải rộng và không quá sâu (5-I0cm), đồng thời phải giữ độ ẩm môi trường khoảng 60% để tránh khô bể
mặt môi trường
Trang 15- Nhược điểm: đòi hỏi mặt bằng lớn, khó cơ khí hố và tự động hố, giá
thành cao
Do đó, phương pháp này chỉ áp dụng cho nghiên cứu cải tạo giống trong
phịng thí nghiệm ! 4.2.2 Lén men chim:
Khi lên men chim, vi sinh vat được nuôi cấy ở môi trường dịch thể, chúng sẽ phát triển trong không gian 3 chiều của mỏi trường Dùng cho cả sinh vật hiếu khí và kỊị khí
Giống VSV dùng trong lên men chìm là những tế bào sinh đưỡng
đang ở giải đoạn phát triển mạnh và có khả näng đổng hố Vai chat cao nhãi
Vì vậy trước khi lên men phải có giai đoạn nhân giống Tỷ lệ giống trong môi
trường lên men là 1-I0% Quy mỏ giống phụ thuộc vào quy mơ bình lên men
Quá trình lên men có thể thay đổi các điều kiện ban đầu của môi
trường lên men Do đó, cần theo dõi và điều chỉnh các thông số: sự cấp khí, sự
tạo bọt, điều chỉnh pH, nhiệt độ, nhiên liệu và chất tiền thể
-_ Ưu điểm: hiệu suất cao, môi trường dinh dưỡng được sử dụng triệt để, tiết kiệm mặt bằng sản xuất, đề tự động và cơ giới hoá trên quy mô lớn -_ Nhược điểm: yêu cầu phải có thiết bị chuyên dụng (thiết bị chịu áp lực,
điều kiện vô trùng tuyệt đối ) chi phí đầu tư sản xuất lớn
Phân loại:
> lên men gián đoạn (lên men có chu kỳ): là quá trình lên men được xem như 1 hệ thống kín Trong suốt thời gian lên men, chỉ cung cấp oxy (ở đang
khí nén), chất phá bọt, hệ đệm điều chỉnh pH
> Lên men có bẩ sung: thực chất là kỹ thuật kéo dài chu kỳ phát triển của
VSV khi ta cho thêm môi trường mới vào dịch lên men I cách ổn định, thay
Trang 16> Lên men liên tực: q trình lên men mơi trường dinh dưỡng được hổ sung liên tục vào bình lên men đồng thời cùng lúc đó lấy ra đồng thể tích dịch lên men
> Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men việc rút bớt dịch lên men va bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng không xảy ra liên tục mà định kỳ sau những khoảng thời gian nhất định
1.5 CHIẾT TÁCH, TINH CHẾ KHÁNG SINH TỪ DICH LEN MEN [2],
[3] [8],
Kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp Tuỳ theo đặc tính của lồi mà sản phẩm thứ cấp đó được tiết vào mồi trường nuôi cấy hay giữ lại trong tế bào Để thu lấy các hoạt chất có độ tỉnh khiết cao cần tìm phương pháp chiết
tách thích hợp
1.5.1 Chiết xuất, tách sản phẩm
Chiết là phương pháp dùng dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu
Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha khơng hồ lẫn
được vào nhau
Phương pháp chiết: Có thể chiết bằng dung môi hữu cơ, bang nhựa trao
đổi lôn hoặc bằng phương pháp kết tủa Nếu chiết bằng dung môi hữu cơ cần thoả mãn các yêu cầu sau:
+ Dung mỏi dễ kiếm, rẻ tiền, khơng độc, khó cháy
+ Có tính chọn lọc cao: hoà tan tốt hoạt chất ít hồ tan tạp chất
+ Dê cất thu hồi Quá trình tách sắc kỹ
Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý đùng để tách các thành phần
Trang 17chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và khơng hồ lần vào nhau: một pha
tĩnh và một pha động Quá trình tách sắc ký thường qua 3 giai đoạn chính: đưa
hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha động chạy qua pha tĩnh và phát hiện các chất
Sắc ký lớp mỏng
Pha nh là chat ran khong tan được tán nhỏ thành bột mịn được cố định trên bản mỏng
Pha động là chất lỏng sẽ thấm và chạy trên lớp mỏng do tác động của lực mao dẫn và đôi khi cả trọng lực và điện thế
R, là đại lượng đặc trưng cho | chat trong ] hệ dung môi xác định, không
phụ thuộc vào nồng độ chất cần phân tích 1.5.2 Tinh chế
Mục đích: để thu lấy kháng sinh tỉnh khiết cho các nghiên cứu tiếp theo Ở đây, chúng tôi ứng dụng quá trình tách bằng sắc ký cột để tinh chế
Sắc ký cột là sắc ký trong đó chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha tĩnh được nhổi trong ống hình trụ, nhờ vậy mà có thể khai triển dung môi liên
tục với nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực rnanh
“_ Cột sắc ký: ống hình trụ bằng thuỷ tỉnh dài 30-70cm, đường kính 1-5
cm, đầu dưới có vịi và một khố điều chỉnh tốc đó
" Hố chất nhồi cột: Có thể là cellulose, gel của acid silic khơng hoạt hố oxit nhôm, silicagel, CaCO; Các chất dùng cho sắc ký cột đều phải được chuẩn hoá để việc sử dụng được dễ dàng thuận lợi
= Dung moi: Cac hệ dung môi dùng cho SKLM đều có thể dùng cho sắc ky cét nhu cloroform, aceton, n- butanol
Trang 181.6 QUANG PHỔ HỒNG NGOẠI (IR) [2], [12]
Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ hấp thụ bức xạ IR của | chất vào số sóng hoặc bước sóng là phổ hấp thụ hồng ngoại, thường gọi đơn giản là phổ hồng ngoại của I chat
Cơ sở Ìý thuyết:
ie
# I '
Ta có số sóng: 0= ĐANG RANEY Oe ie
M, gọi là khối lượng rút gọn nhân tử Với nhân tử có 2 nguyên tử A va Bta cé:
Mr M4 MB
Nhu vay, khi M, cang lén thi v cang nho
Nguyên tắc: Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và thay đổi trạng thái dao đơng thì tạo nên 1 đải hấp thụ trên phố IR Có mối tương quan giữa nhóm nguyên tử và đải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ để nhận biết một nhóm chức nào đó Nhiều nhóm chức có các đải hấp thụ đặc trưng Đây là cơ sở của việc phân tích cấu trúc bằng phố IR
1.7 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU MỚI VỀ KHÁNG SINH [14] [15]
1.7.1 Đặc điểm của P450 Monooxygenase NysL, chịu trách nhiệm hydroxyl héa C-10 trong sinh tổng hợp kháng sinh Nystatin Polyen Macrolid cua Streptomyces noursei
Trang 19hoạt tính chống nắm của nó ngang hằng với nystatin Protein NysL đc,
hiện dị thể trong #Zseherichia coli như một protein có đầu His và được thử
nghiệm trong một enzyme với 10-deoxynystatin làm cơ chất Kết quả cho thay NysL 14 enzyme hydroxylase chiu trách nhiệm đối với sự biến đổi hậu- polyketide synthase của 10-deoxynystatin tại vị trí C-I0 Nghiên cứu dộng
hoc voi enzyme tai tơ hợp tính khiết cho phép xác định X„ và #„„„ và phát hiện
ra khơng có sự ức chế nào của NysL tái tổ hợp, cả cơ chất và sản phẩm Nghiên cứu này mở ra khả năng cho sự phát triển in vivo của NysL hỗ trợ
thay doi tinh đặc hiệu của nó Nhờ đó, cung cấp những cơ hội mới cho việc
245
sinh tông hợp công nghiệp cáe dẫn xuất nystatin mới được hydroxyl há tại vị
trí luân phiên của vòng macrolactone
1.7.2 Dot biến gen Sfreptomyces hygroscopicus FC 904 san xuat Rapamycin
Rapamycin duoc san xuat tir chung Streptomyces hygroscopicus FC 904 được phân lập từ đất ở Fuzhou, Trung Quoc Đó là kháng sinh thuộc nhóm trine-macrolid với ứng dụng tiềm năng như 1 chất ức chế miễn địch và thuốc chữa bệnh 1 VỀ gen người Trong thí nghiệm đê cải tạo quá trình sản xuất rapamycin, đã tiễn hành đột biến và sàng lọc chủng góc Sau đột biến gen bằng NTG( 3mg/ml) và UV (30W, 15em, 30 giây) của những hỗn dịch bào tử thu duge hang nghin ca thé sống sót Chưa có ai trình bày cải tạo quá trình
sản xuất RPM Chúng tôi đã xác định được tính nhạy cảm của Š
hygroscopicus FC 904 với kháng sinh băng địch pha loãng gap 2 lần của kháng sinh trong các đĩa thạch bột yên mạch Đã tìm ra chủng kháng lại penicillin, erythromycin, RPM, tetracyclhne và cloramnhemcol, nhưng nhạy cam vol mitomycin C (MIC, 10 microg/ml) va aminoglycosid nhu
gentamicin( MIC, 0.lmicrog/ml), kanamycin (MIC, 0.1lmicrog/ml), va
streptomyees(MIC 0.3mierog/ml) Thể nguyên sinh của chủng FC 904 được
Trang 20điều chế sau khi tìm được điều kiện tốt nhất cho sự hình thành các thể nguyên
sinh của chủng này Chúng được xử ly voi gentamicin, erythromycin, mitomycin C va NTG, That bat ngo, gentamicin dac biét hiéu qua trong viéc
thu được các biến chủng sản xuất RPM cao Biến chủng C14 được sàng lọc bằng cách trộn chủng góc thể nguyên sinh FC 904 với 1 microg/ml
gentamicin 6 28°C trong 2 gid Thu duge 1 lượng lớn RPM- sản phẩm của biên chủng (C14-1) thu được từ thể nguyên sinh C14 ban đầu được xử lý với gentamicin, và hiệu suất tăng lên 60% so với hiệu suất của chủng gốc ban đầu FC 904 nhờ phân tích HPLC Một biến chủng khác (C14-2) thu được từ bao
tử của biển chủng C14 được xử lý với l meierog/ml gentamiein và 2mg/ml
Trang 21PHAN 2
THUC NGHIEM VA KET QUA
2.1 NGUYEN VAT LIEU VA PHUONG PHAP THUC NGHIEM
2.1.1 Nguyên vật liệu s Giống xạ khuẩn:
Chiang xa khuan Streptomyces 16.34 48 duge phan lap va tuyén chon cé khả năng sinh tông hợp kháng sinh, có đặc tinh di truyền ôn định, có phổ tác dụng rộng trên cả vi khuẩn gram (+) và gram (-) Chủng Streptomyces 16.34
do Bộ môn Vị sinh -Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội cụng cập © Giong VSV kiểm định:
Giống VSV kiểm định do Bé mén Vi sinh- Sinh học, Irường Đại Học
Dược Hà Nội cung cấp
- - Vị khuẩn Gr(-): Proteus mirabilis BV 108 - Vi khuẩn Gr(+): Bacillus pumilus ATCC 10241 © Modi frường:
> Các môi trường nuôi cây VSV kiểm định được giới thiệu trong bảng
| Tiệt trùng bằng hơi nước bão hoà ở 0,9 att/20 phút
Bảng 1: Các môi trường nuôi cây VSV kiểm định
S hành phân |
MT NaCl Cao thit Pepton Thach pH |
Qo) — (W (4) (Mo) (%) Canh thang 0,5 0,3 0,5 Gì 7,0- 7,4 Thạch thường 0,5 0,3 0,5 1,6-1,8 | 7,0-7,4 |
> Cac mdi trudng nudi cay xa khuan duge gidi thiéu trong bang 2 Tiét
Trang 22Bảng 2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100m]) _ Thành phần MTI MT3 MT4 Tỉnh bột 2 Lactoza 3 Glucoza 2 Cao ngô 0,5 0.5 KNO; 0,1 NH,NO; 0,2 0,2 CaCO; 0,3 0.4 FeSO 7H;O 0,001 KH;PO, 0,05 0,1 0,05 MgSO,.7H;O 0,05 0,025 0,15 NaCl 0,05 Thach L.8 2 3S Nước 100 100 100 pH _ 0-9 70~—72 16=72
> Các môi trường lên men (MTđđ): Cé thanh phan tong ime mdi trường nuôi cây xạ khuẩn nhưng bỏ thạch
Trang 23Bảng 3: Các dung môi hữu cơ
— Khoi lugng riéng Nhiệt dé sdi (°C)
[g/cm’] Methanol 0,79 1- 0,793 64,5 NH,OH 25% 0,88 Ethanol 0,789- 0,791 78,3 Dimetylformamid 0,95 153 n- butanol 1,470- 1,48 117 Aceton 0,79 56 Butylacetat 0,880- 0,885 118 Triethylamin 0,726- 0,728 90 `
Vật liệu dung trong sắc ký:
- Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60 F254, Merck - Hạt Silicapel 60 F245, Merck, cỡ hạt 0,063- 0,2 mm - Dung môi chạy sắc ký: Các đung môi dung trong bảng 4 - Binh chay sac ky, buret 25cm, mao quan
May moe, thiết bi, dung cu:
Nồi hap v6 tring Hirayama Hic LAVE HVE- 25
Tu cay BASSAIR, tu cay AURA VF48
Ta am Trung Quéc, Binder, Memmert
Cân kỹ thuật Precisa Bj 210C, Sartorius TE 212, cân phân tích Srtoius
Bp 1218
Tác nhân gây đột biển: ánh sáng LIV (2= 245nm) nguồn phát Toshiba
Trang 24- May lac Taitec Bio- Shaker BR 300 LF
- May cất quay Buchi WaterBath B480 (Bộ môn công nghiệp Dược- Trường ĐH Dược Hà Nội)
- Thước kẹp Panmer có độ chính xác 0,02 mm -_ Pipet các loại, ông dong, cốc có mỏ, hộp Petri 2.1.2 Các phương pháp thực nghiệm:
*ˆ Phương pháp nuôi cấy và giữ giỗng:
Giống Streptomyces 16.34 được nuôi cấy trên ống thạch nghiêng MT3, U cho phát triển ở 30C, trong 7-10 ngày Giống Sfrepfomnces 16 34 sau
khi phái triển được cất giữ trong tu lanh 3- 46, định kỷ 3-6 tháng cây truyền
vˆ Đánh giá hoạt tính khủng sinh bằng phương pháp khuyếch tán:
Nguyên tắc: Mẫu thử được đưa lên lớp thạch đinh dưỡng đã cấy vi sinh
vật kiểm định Kháng sinh từ mẫu thử sẽ khuyếch tán vào môi trường thạch, sau đó sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vũ khuẩn
Tiến hành:
- Chuẩn bị môi trường cấy VSV kiểm định:
Vi khuẩn kiểm định được cấy vào môi trường canh thang, rồi ủ ở 37°C trong
18-24 giờ, sẽ dược hỗn dịch vi khuân có nồng độ từ 10”~ 10° té bao/ml
Dua hỗn dịch này vào môi trường thạch thường đã tiệt trùng và làm nguội đến
45-50°C với tỉ lệ 2,5:100 Lắc đều, đô vào đĩa Petri vô trùng với thể tích
20ml/đïa Dé nguêi về nhiệt đê phòng trước khi dưa mẫu thử vào
- Đưa mẫu thử vào đĩa Petri chửa môi trường đã cấy vi khuẩn kiểm định trên theo sơ đồ định sẵn Có 3 phương pháp:
Trang 25+ Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc có đường kính 6.0mm
da tam 3 làn dịch chiết dung dịch mẫu thử, sấy khô ở t°C < 50°C, sau đó đặt
lên bề mặt môi trường đã cấy vi khuân kiểm định
+ Phương pháp giếng thạch: Đục các giêng thạch đường kính 6.0mm
trên môi trường đã cấy vi khuân kiểm định, sau đó nhỏ mẫu thử vào, mỗi
giêng nhỏ 0,05ml
- Nuôi cây: Các đĩa Petri có chứa môi trường đã cấy vi khuẩn kiểm định và mẫu thử được ủ trong tủ ấm 37°C trong 24 giờ
- _ Đánh giá kết quả: Đo đường kính vịng vơ khuẩn bằng thước kẹp
Panmer có độ chính xác đến 0.02mm Dường kính vịng vơ khuân được xử lý theo công thức:
`D, IS\(D, - Dy
c= H = H—Ì
S| : Đường kính trung bình vịng vơ khuẩn D, : Đường kính vịng vô khuẩn thứ ¡
s : Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n : Số thí nghiệm làm song song
vˆ Phương pháp cải tạo giỗng:
> Phương pháp chọn lọc tự nhiên:
= Pha hon dich bao ti: Chuan bi | ống nghiệm chứa 10ml nước cất
vô trùng, 5 ống nghiệm chứa 9ml nước cấy vô trùng và l pipet 1ml vô trùng Lay 1 vong que cay bao tir Streptomyces 16.34 tit éng giédng cho vào ông nghiệm chứa 10ml nước cất v6 tring, lac déu cho bao tir phan tan déu, thu được hồn dịch bào tử có độ pha loãng (định ước) 10” Sau đó pha loăng thành
‘ x a -2 - ` r a `
các nông độ 10”- 10” bằng nước vô trùng
Trang 26-_ Cấy bào tử: Dùng pipet vơ trùng hút chính xác 0,Iml hỗn địch bào tử ở các nồng độ 10” - 10” nhỏ lên bề mặt MT3 dã được tiệt trùng trong
đĩa Petri Dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn địch bảo tử này Mỗi
nông độ tiền hành làm 3 đĩa song song Sau đỏ ủ trong tủ ấm 30°C trong 6
ngày để xuất hiện các khuẩn lạc
- _ Tiên hành chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển tốt, mọc riêng rẽ, cấy ziczắc lên bề mặt M13 trong đĩa Petri Sau 6
ngảy ủ trong tủ ám 30°C, đem thử hoạt tính KS bằng phương pháp khối thạch
> Phương pháp đột bién bằng ánh sáng UY:
- Phã hôn dịch bàø tử:
Chuẩn bị l ống nghiệm chứa 10ml nước cất vơ trùng Lấy l vịng que cay bao tir Streptomyces 16.34 cho vào ống nghiệm này, lắc đều để tạo thành hồn dịch bào tử có độ pha loãng 10 !(quv ước) Sau đó dùng pipet vô trùng lấy Iml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10 để làm mẫu chứng, 9ml còn lại đổ vào | dia Petri v6 tring
- Đột biến bàng ánh sáng UV:
9m hén dịch bào tử ở nồng độ trong dia Petri vô trùng dược chiếu ánh sáng UV với khoảng cách 60cm, thời gian chiếu Š phút Sau đó để chỗ tối 2h,
rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng dộ 10” - Cấy bào tử:
Dùng pipet võ trùng hút chính xác 0,Iml mẫu chứng 10 nhỏ lên bẻ mật
MT3 trong dĩa Petri và hút chính xác 0,1 mi hỗn dịch bào tử đã đột biến ở các
nồng độ 10”, 10 nhỏ lên bề mặt MT3 trong đĩa Petri Dùng các que trang vô trùng giàn đều giọt hôn địch bào tử Môi nồng độ làm 3 đĩa song song Sau đó ủ các đĩa trong tủ ấm 30C trong 6 ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc Lấy đĩa
ra và đếm các khuẩn lạc, xác định % sống sót theo công thức:
- 2 N
% song sot = =x 100
Trang 27Nm : Số khuẩn lạc sau đột biến No: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng
- Tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc sau đột biến tương tự phép sàng lọc ngẫu nhiên Lầm song song với mẫu chứng Sau 6 ngày ủ ở 30°C, đem thử hoạt tính kháng sinh bảng phương pháp khối thạch
- % biến đổi hoạt tính được tính theo cơng thức:
% biến đổi hoat tinh = 2! x100 Do
Di: Dudng kính trung bình vịng vô khuẩn của biến chủng thứ ¡ sau đột biến
Øø: Đường kính trung bình vịng vô khuẩn của mẫu chứng;
Sau khi tiến hành đột biến, các biến chủng nào có % biến đổi hoạt tính kháng
sinh (+) cao nhất được dùng cho các nghiên cứu tiếp theo > Phương pháp lên ren giún đoạn:
- Tạo giống cấp 1:
Chủng giống Streptomyces 16.34 sau 6 ngay nudi cay trén MT3 thach nghiêng trong ống nghiệm ở 30°C được cấy vô trùng sang bình nón 250m] chứa
100ml MT3dd bằng 10ml nước cất vỏ trùng Sau đó đem lắc trên máy lắc ở nhiệt độ 28°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h
- Lên men:
Tiến hành ở các môi trường dinh dưỡng khác nhau để chọn môi trường
lên men tốt nhất Giống cấp | duoc cấy vỏ trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml các mỗi trường dinh dưỡng khác nhau với ti lé Vgidng: V mdi trường =
1: 10 Các bình lên men được lắc trên máy lắc ở nhiệt độ 28°C, tốc độ quay
140 vong/phut trong 120h
> Phương pháp chiết kháng sinh bang dung mdi hitu co:
Dịch lên men sau khi loại bỏ sinh khối, chính về pH thích hợp (pH= 3)
Trang 28Dịch lọc và dung môi lần lượt cho vào bình gạn với tỉ lệ Vụ„ „„ : V dune
mà 5: 1, lắc kỹ trong I phút để 2 pha tiếp xúc tốt với nhau Sau 1h để phân
lớp tách riêng dung môi và dịch lọc
Hoạt tính kháng sinh của dịch chiết hữu cơ và dịch lọc được kiểm tra bằng phương pháp khoanh giấy lọc và phương pháp giếng thạch
>» Phuong pháp tách các thành phần kháng sùnh bằng SKLM:
Ban mỏng sắc ký có kích thước thích hợp được hoạt hoá ở I10%C
trong 30 phút Dung môi được pha theo đúng tỷ lệ trong bình chạy sắc ký (chiều dày lớp dung môi không quá 1cm) và để cho bão hoà dung môi Chấm
dịch chiết kháng sinh lên bản mỏng ( bằng mao quản) cách mép dưới 1,5cm: Sấy khô bản mỏng ở 40-50°C, cho bản mỏng đã chấm dịch chiết vào bình
chạy sắc ký đã bão hồ dung mơi Khi dưng môi chạy được khoảng 3/4 bản mỏng, lấy ra đánh dấu vạch dung môi (D,„), xác định vết bing phương pháp: + Soi đèn tứ ngoại: Bản mỏng sắc ký tráng sẵn đã được trộn với một chất có huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại, khi sơi dèn tử ngoại, nếu có vết thử sẽ
cho mầu thẫm đưới đèn tử ngoại
+ Phương pháp hiện hình vì sinh vật: Đặt hản mông đã chạy sắc ký và sấy khô vào đĩa Petri vơ trùng Đổ mưi trường thạch thường vô trùng đã cấy VSV kiểm
định, ủ ở 37°C trong 24h Nếu có kháng sinh vịng vô khuẩn sẽ xuất hiện + Phương pháp hiện màu hoá học: Bản mỏng sắc ký được phun thuốc thử hiện màu, sấy ở 70°C trong 10 phút dể phát hiện vết
Dv
Tính inh R, R.; R= oo
D, : Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết
D„„: Khoảng cách dung môi chạy
> Thu lay kháng sinh thô bằng phương phap cat quay:
Dịch chiết n- butanol sau khi thử hoạt tính kháng sinh, đem cất chân
không bằng máy cất quay Buchi Waterbath B480 ở nhiệt độ 70°C đến bột khô
Trang 29Cân một lượng chính xác bột này đem hoà tan trong methanol theo đúng tỷ lệ
với dịch chiết đem cất chân khơng Thử hoạt tính KS và SKLMI để kiểm tra sự biến đổi của KS sau khi cất chân không, đồng thời tìm các điều kiện tối ưu cho sắc ký lỏng trên cột cũng như kiểm tra độ tỉnh khiết
> Tỉnh chế kháng sinh thô bằng nhương pháp sắc ký cột:
- Chuẩn bị cột sắc ký: Cột sắc ký đường kính Icm dài 50cm Hạt chất nhồi cột được dung la Silicagel 60 F254 Merk cỡ hạt 0,06- 0,02mm Cân 8g hạt chất nhồi cột, hoạt huá ở 105°C trong 1Š phút, đem hoà thành hỗn dịch với hệ
dung môi chạy cột và đưa lên cột, để yên trong 2 giờ cho ổn định cội Chiều
cao lớp chất nhỏi là khoảng I5cm
- Cho mâu thử lên cội: Bột kháng sinh thô duge hoa tan trong methanol réi trộn với 1 lượng nhỏ Silicagel đã hoạt hoá (khoáng 2gam) Sấy ở 50-60°C cho bay hơi hết rmtheanol Cho lượng Silicagel này lên cột đã được ổn định - Cho dung môi chảy qua cột: Pha hệ dung môi theo đúng tỉ lệ Cho chảy qua
cột đã nhôi mẫu với tốc độ (0.5ml/phút Hứng dịch chảy ra vào các ống nghiệm
sạch, mỗi phân đoạn chứa 5-IÖml dịch chảy ra Lấy khoảng 10- 30 phân đoạn - Phát hiện và xác định các phản đoạn chứa kháng sinh cần tách: Hoạt tính kháng sinh của các phân đoạn được kiểm tra bằng phương pháp khoanh giấy lọc Các phân đoạn có hoạt tính kháng sinh được đem chấm các bản mỏng đã
được hoạt hoá để tiến hành SKLM với hệ dung mội mà tách tốt nhất đã nghiên
cứu trước Phân đoạn chính là những phân đoạn có hoạt tính kháng sinh mạnh
nhất và có cung Rr
> Thu bột kháng sinh da tinh chế bằng nhương pháp cất quay
Trang 30kháng sinh và SKLM để kiểm tra sự biến đổi của kháng sinh sau khi cất chân không và kiểm tra sự tỉnh khiết về mặt sắc ký của kháng sinh
> Dự đốn mơi số nhám chức trong cấu trúc phản tử của kháng sinh bang pho hong ngoai(IR):
Bot khang sinh tinh khiết sắc ký, được cân chính xác 10mg, dem ghi phổ hồng
ngoại Dựa trên các pic thu được ta dự đốn các nhóm chức trong phân tử kháng sinh thu được
2.2 KẾT QUÁ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT:
Kết quả nghiên cứu trước đã cho thấy chủng Szejpfomyces !6.34 có tác
dụng mạnh và ốã định trên 2 chủng V§V là P.miabilis GH-) và B.pinilua
Gr(+), nên chúng tôi chọn 2 ching VSV nay lam 2 chủng VS§V kiểm định
2.2.1 Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên:
Sử dụng MT, tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên chọn các dạng chủng có hoạt tính tốt nhất của Streptomyces 16.34 để tiếnhành nghiên cứu tiếp theo
Kết quả thu được trình bày ở bảng 4 và hình PI (PL)
Bảng 4: Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên dạng ching Streptomyces 16.34
| Hoạt tính kháng sinh Hoạt tính kháng sinh
Ký | B.pumilus P.mirabilis | Ký Bpumilus | P.mừabilis
Trang 3117,12 1,03 21,99 3,02 25,40 1,15 244.32 23 1,96 |
Nhận xét: Sau khi tiến hành chọn lọc ngâu nhiên, chúng tôi nhận thấy các dạng chủng ó, 10, 25 là những dạng chúng có hoạt tính kháng sinh tốt nhất, được sử dụng cho các bước đột biến cải tạo giống tiếp theo
2.2.2 Kết quả đột biến cai tạo giống lan 1:
Để làm tăng hoạt tính kháng sinh của chúng §epiomyces 16.34 chúng tơi tiến hành đột biến lần 1 dạng chủng số 6 bằng ánh sáng UV (254nm) với
khoảng cách chiếu 60cm, thời gian chiếu Š phút Độ sống sót sau đột biến lần I là 0,2% Kết quả được trình bày ở bảng 5
Bang 5: Hoat tinh khang sinh cia Streptomyces 16.34 sau đột biến 1
Hoạt tính kháng sinh B pumilus P mirabilis Bién — =
thôn % biến _ % bién
: » S đổi hoạt mí § đổi hoạt
Trang 32Nhận xvéi:
Qua bảng kết quả trên, chúng tôi thấy các dạng biến chủng 6.6, 6.13,
6.14 có % biến đổi hoạt tính kháng sinh cao được giữ lại để tiến hành nghiên cứu tiếp
2.2.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2:
Để nâng cao thêm hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh chúng tôi tiến hành dột biến tiếp tục biến chủng 6.6 với các thông số như trên Độ sống sót sau đột biển lần 2 là 0.21% Kết quả được trình bày ở bảng 6 và hình P2 (PL) Bảng 6: Hoạt tinh khang sinh cia Streptomyces 16.34 sau dét bién 2
| Hoại lực kháng sinh ss B pumilus P mirabilis Bién ae = ` % biến % biến chủng _ ee
D[mm] § đối hoạt D[mm] s đối hoạt
tính tính 6613 | 30,96 0,63 104 28,64 2,00 98 '6.6.14 | 30,61 0,78 103 27.26 — | 1/70 93 6.6.15 | 30,44 0,76 103 28,00 | 1,60 96 6619 |3010 1155 TIØI 27,27 |LI8 93 6.6.21 30,66 1,38 103 28.78 1,30 98 _MC 29,66 0,73 100 29.26 0,52 100
Nhận xét: Sau khi tiến hành đột biến cải tạo giống lần 2, chúng tôi thấy các biến chủng 6.6.6, 6.6.7, 6.6.12 có % biến đổi hoạt tính cao, có khả năng trở thành những giống tốt để lên men sinh tổng hợp kháng sinh
Trang 332.2.4 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh:
> Kết quả chọn mơi trường lên men thích hợp:
Đã tiến hành khảo sát khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 16.34 trén cac môi trường lên men khác nhau Sau lên men, dịch lên men được lọc loại sinh khối thu được dịch lọc đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch Kết quả được trình bày ở bảng 7 và hình
F61
Bang 7: Kha nang sinh tong hợp kháng sinh của Streplomyces 16.34 trên các mỗi trường lên men khác nhau khi lên men chìm
Hoạt tính kháng sinh B.pumilus P.mirabilts MT lén men 2 = D(mm) S D (mm) S MTIdd 11,44 0,54 978 ~ 0,71 MT3dd 18,92 0,24 _ — 1794 0.10 MT4dd 12,96 0,54 | 11,56 0,60 Nhận xét:
Môi trường phân lập MT3dd là môi trường lên men cho khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất đối với chúng Streptomyces 16.34 khi lên men chim
Do đó, chúng tơi chọn MT3 dd cho các lần lên men tiếp theo
È Kết quả chọn biến chủng tốt nhất cha lên men chìm ở guy mơ phịng thí
nghiệm:
Tiến hành lên men chìm ở quy mơ phịng thí nghiệm trém may lac ching géc
và các biến chủng 6, 6.6, 6.6.12, để chọn biến chủng có khả năng sinh tổng
hợp kháng sinh tốt nhất Dịch lên men sau khi loại sinh khối được đánh giá
Trang 34Bang 8: Kết quả lên men trên MT3dd với các biến chủng khác nhau | Hoạt tính kháng sinh
Kí hiệu biến B.pumilus P.mirabilis
ching D(mm) a: D (mm) S
Gốc 16,44 0,54 12,78 0,71
6 19,87 0.57 15.98 0,26
6.6 20,33 0,54 1769 | -
Tiến hành chiết kháng sinh 1 lần bằng dung môi n- butanol ở pH= 3 với tỉ lệ V„.: V đm" địch loc 1:5 Danh gid hoạt tính kháng sinh của pha dung môi hữu cơ và pha nước sau khi chiết bằng phương pháp khoanh giấy lọc và phương pháp giếng thạch Kết quả được trình bày ở bảng 9
Bảng 9: Kết quả chiết xuất kháng sinh bằng n- butanol
Kết quả Hoạt tính kháng sinh
B pumilus Pumirahilis
Mẫu thử D(mm) S D(mm) S
Pha n- butanol 20,82 0,75 18,83 0,30 Pha nước 0,00 0,00 0.00 0.00
Trang 35
2.2.6 Kết quả sắc ký lớp móng:
Sau khi chiết kháng sinh bằng n- hutanol ta tiến hành sắc ký lớp mỏng để tiến hành xác định thành phần kháng sinh và làm cơ sở cho quá trình tỉnh
chế sau này Sắc ký lớp mỏng với các hệ dung mơi có thành phần như sau:
Hệ dung môi [: Cloroform : methanol : NH,OH 25% (2:2: l)
Hệ dung môi 2: n- butanol : ethanol : dnnethyl{ormamid (3: [: |) Hệ dung môi 3: Butylacetat : acetone : trimethylamin (1:2:1)
Vết kháng sinh được phát hiện bằng phương phấp vi sinh vật
Kết quả được trình bày ở bảng 10
Bang 10: Ké qua sac ký lốp mỏng trên B pismiliis
ee Kết quả Hệ dung môi PT Ry | 0,95 2 0,86 3 0,97 - Nhận xét:
Sắc ký đồ với các hệ dung mơi đều có một l vết kháng sinh 2.7 Kết quả kiểm tra sự biến đổi của bột kháng sinh thô
Bội kháng sinh thô thu được sau khi cất chân không được kiểm tra sự biến
đổi hoạt tính kháng sinh và các thành phần kháng sinh bằng phương pháp
khoanh giấy lọc và phương pháp SKLM với 3 hệ dung môi như trên, so sánh
Trang 36Bảng 11: Kết quả kiểm tra sư biến đối hoạt tính KS của bột KS tha ` Hoạt tính kháng sinh
` Kết quả _B.pumilus P.mirabilis
N
\ — đbiếnp — _—_ %biến
yo D fi D sỉ
Mẫu, s đổi hoạt S đổi hoạt
N (mm) (mm) tính tính Bột KS 2240 0,67 106,67 20,59 0,83 105,05 thé/methanol Dich chiét | - TS 210 | 122 | 10000 | 1960 | 047 | 10000 ) (chứng) Bang 12: Kết quả SKLM so sánh các thành phan KS cia dịch chiết và bột KS
thé trén B.pumilus = Kết quả R,; in i
Hedung moi Bot KS/ methanol | — Dịch chiết
CÁN, 7 | I 0,95 0,95 | 2 0.86 0.86 3 0.95 0,95 Nhận vét:
Hoạt tính kháng sinh của bột kháng sinh thô thay đổi không đáng kể Sắc k ý
đồ của dịch chiết và dịch kháng sinh thỏ/ methanol cho các vết trùng nhau Như vậy, hoạt tính và các thành phần của bột kháng sinh thô không thay đổi sau khi cất chân không
31
Trang 372.2.8 Kết quả sắc ký cột:
Cân một lượng chính xác bột kháng sinh thô là 0,05 (g) đem tiến hành
sắc ký cột với hệ dung môi I, thu được 15 phân đoạn dịch phản hấp phụ
Thử hoạt tính kháng sinh của 1Š phản đoạn này bảng phương phán khoanh giấy lọc Kết quả dược trình bày ở bảng 13 và hình P5 (PL)
Bảng 13: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh các phân đoạn
Kết quả Hoạt tính kháng sinh
Phân B.pumilus P mirabilis
Trang 38Nhận xét: Các phân đoạn 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, I1 có hoạt tính kháng sinh
được giữ lại nghiên cứu tiếp Phân đoạn 2 có nồng độ kháng sinh đậm đặc
nhất
Và qua bảng kết quả trên, cho thấy sơ bộ có ít nhất 3 thành phần kháng sinh
Tiến hành SKL,M các phân đoạn 2, 3, 4 với hé dung môi l và các phân đoạn
2,3, 4,5, 6, 7, 8 với hệ dung môi 3 Kết quả được trinh bày ở bảng 14 và hình P6 (PL), bảng 15
Bảng 14: Kết quả SKLM với hệ dung môi | trén P.mirabilis
Pte Kết quả Phân đoạn KG R, — 2 0,95 3 0,95 4 0,95
Bảng 15: Kết quả SKLM với hệ dung môi 3 trén P.mirabilis
Trang 39Nhận xéi: Sắc ký đê các phân đoạn 2, 3, 4 có thành phần chính R;trùng nhau
Các phân đoạn 5,6,7 có thành phần chính R, trùng nhau
Đem gộp các phân đoạn 2, 3, 4 thành một nhân đoạn SỈ; các phản đoạn 5,6,7 thành một phân đoạn S2 Sau đó tiến hành sắc ký cột từng phân đoạn SI, S2
với hệ dung môi 3
2.2.8.1 Kết quả sắc kỹ cột phân đoạn SĨ:
Phân đoạn SI đem tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi 3, thu được 14 phân đoạn Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc Kết quả được trình bày ở bảng 16
Bảng l6: Kết quả thử haạt tính kháng sinh cấc phân đöän
Kết quả Hoạt tính kháng sinh
Phân B.pumilus P mirabilis
Trang 40Nhận xét: Qua bảng kết quả trên sơ bộ kết luận phân đoạn SE có ít nhất 4
thành phần kháng sinh được tách ra
Tiến hành SKUM các phân đoạn 2 3, 4 5, 6 10 11, 14 với hệ dung môi 1 va hệ dung môi 3 Kết quả được trình bày ở bảng 17, bảng 18
Bảng 17: Kết quả SKLM các phân đoạn của SI với hệ dung môi l (thử trên
P.murabtliv.) TS Kết quả
Phan đoạn wes R;
ˆ 0,95 0,95 4 0,97 0,97 po 6 ~ 0 10 0,94 II ˆ 0,94 14 0
Bảng 18: Kết quả SKLM các phân đoạn của S1 với hệ dung môi 3 ( thử trên