Dựa vào các đỉnh hấp thụ trên phổ IR có thể dự đoán trong cấu trúc của kháng sinh có 1 số nhóm chức như sau: [24]
3437,45 cm-1 đặc trưng cho liên kết N-H trong nhóm amin bậc 1, bậc 2.
2931,15 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-H trong alkan.
1738,31cm-1 đặc trưng cho liên kết C=O trong aldehyde.
1658,86 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=C trong alken, C=O trong amid hoặc C=N trong imines hoặc oximes.
1582,25 cm-1 đặc trưng cho liên kết N-H trong amin/amid
1477,26 cm-1 đặc trưng cho liên kết đôi hoặc vòng thơm.
1264,46 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-O trong acol, ether, ester, acid carboxylic, anhydride; liên kết C-N trong amine, C-F, S=O
1097,05 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-O, C-N, C-F
739,53 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-Cl
574,96 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-Cl
489,83 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-Br hoặc C-I 3.9.4. Phổ khối (hình P7.4)
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN
Sau thời gian nghiên cứu, chúng tôi đã thực hiện được các mục tiêu đề ra với kết quả thu được là:
Phân loại được Streptomyces 183.212 được phân lập từ mẫu đất lấy tại Quận 9- thành phố Hồ Chí Minh có đặc điểm phân loại theo ISP giống với
Streptomyces coelicolor (78,.6%)
Thực hiện có hiệu quả biện pháp cải tạo giống làm tăng hoạt tính kháng sinh ở xạ khuẩn : đột biến bằng tác nhân UV (bước sóng 254nm), hoạt tính kháng sinh tăng cao nhất tới 124% so với chủng chứng.
Lựa chọn được môi trường lên men phù hợp để thu kháng sinh là MTdt2 (thành phần: tinh bột 2,0 g; KCl 0,05g; K2HPO4 0,1g; NaNO3 0,2g; MgSO4.7H2O 0,05g; nước máy 100ml; pH: 6,8-7,2) chọn được biếnn chủng có hoạt tính kháng sinh cao là biến chủng ĐB2-11.
Xác định được điều kiện, phương pháp và thực hiện việc tách chiết và tinh chế kháng sinh do xạ khuẩn tạo ra: dung môi chiết kháng sinh là ethylacetat, chiết tốt nhất tại pH=9; hệ dung môi chạy sắc ký cột là hệ ethylacetat: propanol: acetonitrile (2:3:1), hệ ethylacetat : methanol (40:1) và thu được một chất kháng sinh tinh khiết với hiệu suất là 10%.
Sơ bộ xác định các đặc tính vật lý và cấu trúc hóa học của kháng sinh do xạ khuẩn tạo ra: kháng sinh có màu vàng cam, tinh thể hình kim; không bền ở nhiệt độ cao; phổ UV cho 3 cực đại hấp thu tại các bước sóng lần lượt tại các bước sóng 443 nm, 289nm và 234nm; dự đoán một số nhóm chức thông qua phổ IR (nhóm amin, các liên kết đôi và nhân thơm, một số nhóm halogen) và dự đoán khối lượng phân tử thông qua phổ khối khoảng 656,19.
2. KIẾN NGHỊ
Tiến hành phương pháp giải trình tự gen 16S rADN để xác định chính xác tên của Streptomyces 183.212.
Nghiên cứu cải tiến điều kiện chiết tách để tối ưu hóa quy trình chiết tách, tinh chế kháng sinh để thu được hiệu suất cao hơn cũng như có thể tiến hành trên quy mô lớn hơn.
Xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân để biện giải chính xác cấu trúc hóa học của kháng sinh từ đó dễ dàng cho việc phân loại kháng sinh và ứng dụng vào việc sử dụng trong thực tế.
Mở rộng các phương pháp gây đột biến bằng các tác nhân khác để tối ưu hóa đột biến xạ khuẩn cũng như ứng dụng một số kĩ thuật di truyền để làm thay đổi
bộ máy di truyền của xạ khuẩn để thay đổi khả năng tổng hợp kháng sinh.
Sau khi xác định cấu trúc kháng sinh có thể tiến hành các bước tiếp theo trong quy trình nghiên cứu kháng sinh như xác định phổ kháng khuẩn, độc tính... để phục vụ cho việc đưa vào sử dụng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Trần Tử An (2007), Hóa phân tích tập II, nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 2. Trần Thị Hồng Anh (1993), Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến và ứng
dụng trong định lượng kháng sinh, nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, Hà Nội. 3. Bộ môn Vi sinh và Sinh học (2005), Thực tập Vi sinh-Ký sinh, trường Đại
học Dược Hà Nội, Hà Nội.
4. Bộ Y tế, Vụ Khoa học và Đào tạo (2007), Hóa sinh học, nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
5. Bộ Y tế (2008), Vi sinh vật học, nhà xuất bản Giáo dục , Hà Nội.
6. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
7. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007), Vi sinh vật học, nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội.
8. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Thạnh, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập 2, nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
9. Phạm Thành Hổ (2006), Di truyền học, nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội. 10.Lê Gia Hy (2013), Công nghệ sản xuất kháng sinh, nhà xuất bản Khoa học
và kỹ thuật, Hà Nội.
11.Từ Minh Koóng (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm tập II, nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
12.Nguyễn Huỳnh Minh Quyên (2011), Điều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng kháng vi sinh vật và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn, Báo cáo kết quả thực hiện đề tài KHCN đặc biệt cấp đại học Quốc Gia, Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học, Hà Nội.
13.Nguyễn Văn Thanh (2009), Công nghệ sinh học dược, nhà xuất bản Giáo Dục, Hà Nội.
14.Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở các phương pháp phổ ứng dụng trong hóa học, nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
15.Cao Văn Thu, Phan Văn Kiệm, Bùi Việt Hà (2010), “Actinomycin X2, chất kháng sinh được phân lập từ quá trình lên men sinh tổng hợp Streptomyces microflavus”, Tạp chí hóa học, (48), 469-474.
16.PGS.TS. Mai Tất Tố, TS Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý học tập 2, nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
17.Mai Ngọc Tú (2011), Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 166.28, trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
18.W.D.Phillips and T.J Chilton (2006), Sinh học tập hai, nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội.
Tiếng Anh
19.Arnold L Demain, Sergio Sanchez (2009), “Microbial drug discovery : 80 years of progress”, Journal of antibiotics, (62), 5-16.
20.Eberhard Kuster (1972), “Simple Working Key for the Classification and Identification of Named Taxa Included in the International Streptomyces Project”.
21.Jian li, Chuhua Lu, Yuemao Shen (2010), “Macrolides of the bafilomycin family produced by Streptomyces sp. CS”, Journal of antibiotics, (63), 595- 599.
22.Niko Manderschied, Soleiman E Helay, Andreas Kulik, Jutta Wiese, Johannes F Imhoff, Hans-Peter Fiedler, Roderich D Süssmuth (2013), “Elaiomycins K and L, new azoxy antibiotics from Streptomyces sp. Tü 6399”, Journal of antibiotics, (66), 85-88.
23.Pavia, Lampman, Kriz, Vyvyan (2008), “Introduction to Spectroscopy”, department of Chemistry Western Washington University Bellingham, Washington.
24.Yukinori Tanaka, Shinji Tokuyama, Kozo Ochi (2009), “Activation of secondary metabolite-biosynthetic gene clusters by generating rsmG
PHỤ LỤC 1. Một sô thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Hình 1.1 : Tủ ấm Binder
Hình 1.3: Máy cất quay Buchi Waterbath B480
2. Hình ảnh xạ khuẩn khi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng
Hình 2: Nuôi cấy xạ khuẩn trên MT thạch
3. Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng sinh
Hình 3.2: Đánh giá HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc
4. Hình dạng chuỗi bào tử của xạ khuẩn khi nuôi cấy trên môi trường ISP3
5. Hình ảnh lên men chìm xạ khuẩn
Hình 5.1: Bình lên men chìm trên các MTdt sau 7 ngày.
6. Hình ảnh phổ kháng sinh
Hình 6.1: Phổ UV của kháng sinh