Chuẩn bị: MTdt thích hợp để lên men (môi trường dịch thể không có thạch), bình nón, các chủng xạ khuẩn đã được cấy giữ trong ống nghiệm, ống nghiệm chứa 10ml nước. Tất cả được tiệt trùng ở 120oC trong 30 phút.
Tiến hành:
Tạo giống cấp 1: cấy chủng xạ khuẩn từ môi trường thạch nghiêng sang MTdt trong bình nón (bình nón 500ml chứa 100ml môi trường dịch thể). Cách cấy: đổ 10ml nước đã hấp tiệt trùng vào ống thạch nghiêng có xạ khuẩn, gạt bề mặt thạch để bào tử xạ khuẩn phân tán vào nước. Đổ toàn bộ phần hỗn dịch sang bình nón. Cho bình nón vào trong máy lắc140 vòng/phút ở nhiệt độ 281oC trong vòng 48h. Sau 48h thu được giống cấp I.
Chọn môi trường lên men tốt nhất: sau 48h, giống cấp I được cấy chuyển sang các bình 500ml chứa 100ml MTdt (thử trên các môi trường cho hoạt tính kháng sinh cao khi nuôi cấy bề mặt) theo tỉ lệ thể tích 1:10. Các bình
lên men được lắc trong 120 giờ trong máy lắc 140 vòng/phút ở 281oC. Sau đó dịch lên men thu được đem lọc hoặc li tâm và thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch. Lựa chọn môi trường có hoạt tính cao nhất làm môi trường lên men thích hợp.
Chọn chủng có HTKS mạnh nhất: sử dụng các chủng được lựa chọn từ quá trình SLNN và đột biến. Quy trình làm tương tự như trên, mỗi chủng làm 1 bình giống cấp 1 trên môi trường MT2dt, làm lên men tiếp trên môi trường lên men đã lựa chọn, thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch. Chủng có HTKS cao nhất được lựa chọn để thực hiện lên men lớn hơn thu kháng sinh. 2.3.7. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp
Chủng xạ khuẩn được cấy zigzag lên đĩa Petri chứa môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (MT1-MT 7). Sau khi cấy, đĩa Petri được giữ trong tủ ấm 28oC trong 6 ngày. Sau 6 ngày, tiến hành đánh giá hoạt tính kháng sinh của chủng trên mỗi môi trường theo phương pháp khối thạch. (hình P3)
Kết quả thu được chọn ra môi trường cho hoạt tính kháng sinh cao nhất làm môi trường nuôi cấy thích hợp và chọn 2 VSV kiểm định (1 G+ và 1 G-) sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng sinh sau này.
2.3.8. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của dịch kháng sinh
Sử dụng dịch lọc dịch lên men, hoặc dịch lọc thu được từ xạ khuẩn cấy trên môi trường thạch.
Xác định độ bền nhiệt: cho dịch lọc lần lượt vào 3 ống nghiệm, 5-10ml/ống.
Ống 1: đun sôi trực tiếp trên ngọn lửa đèn cồn 10 phút.
Ống 2: đun cách thủy 30 phút.
Ống 3: để ở nhiệt độ thường.
Thử HTKS của 3 ống bằng phương pháp giếng thạch.
Xác định độ bền pH: cho dịch lọc vào lần lượt 5 ống nghiệm, 5-10ml/ống. Chỉng pH của các ống thành các pH lần lượt là 3,5,7,9,11 (sử dụng dung dịch
NaOH 1N và HCl 1N). Thử HTKS của 5 ống sau 1 ngày và 7 ngày bằng phương pháp giếng thạch.
2.3.9. Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ
Dịch lọc kháng sinh được chỉnh lần lượt về các pH 3,5,7,9,11 (sử dụng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N).
Dịch lọc đã chỉnh pH và dung môi hữu cơ được cho lên bình gạn với tỉ lệ thể tích (5:1). Lắc khoảng 1 phút, để yên phoảng 1 giờ để phân lớp tối đa sau đó gạn riêng lớp dung môi và lớp nước.
Thử HTKS của phần dung môi và phần lớp nước bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
Có thể chiết tiếp phần nước nếu sau khi thử thấy vẫn còn HTKS. 2.3.10. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký
Sắc ký lớp mỏng:
Chuẩn bị:
+ Bản mỏng silicagel được hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút.
+ Dung môi pha theo tỉ lệ có sẵn đổ vào trong bình sắc ký khoảng 30 phút để bão hòa dung môi (chú ý chiều cao của dung môi trong bình không quá 1cm).
+ Dùng mao quản chấm dịch chiết kháng sinh trong DMHC lên bản mỏng (vết chấm cách mép dưới 1,5cm, cách mép bên 0.5cm, chấm khoảng 3-5 lần, để khô tự nhiên hoặc sấy khô ở 50oC).
Khai triển sắc ký: đặt bản mỏng đã chấm dịch chiết vào bình chạy sắc ký, khi dung môi chạy đến cách mép trên 0,5cm lấy bản mỏng ra.
Hiện sắc đồ: sấy khô bản mỏng hoặc để khô tự nhiên, sau đó soi đèn UV hoặc quan sát bằng mắt thường và hiện hình VSV.
+ Soi đèn UV: bản mỏng sắc ký đã trộn sẵn với chất phát huỳnh quang khi chiếu ánh sáng UV nên vết chất sẽ có màu vết huỳnh quang sẫm.
+ Hiện hình VSV: Đặt bản mỏng vào đĩa Petri vô trùng, đổ thạch thường có chứa VSV kiểm định lên trên, để trong tủ 37oC trong 1 ngày, vết kháng sinh được xác định dựa trên vòng vô khuẩn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sắc ký cột:
Chuẩn bị:
+ Mẫu thử: dịch chiết kháng sinh với DMHC được đem cất quay thu được kháng sinh thô.
+ Dung môi: pha đúng theo tỷ lệ, để bão hòa 30 phút.
+ Chuẩn bị cột: cột đường kính 1cm , dài 50cm, rửa sạch, tráng cồn, sấy khô. Nhồi cột bằng Silicagel (cân khoảng 6,0g, hoạt hóa ở 110oC trong vòng 30 phút). Chuyển dần 5,0 g silicagel đã hoạt hóa cùng dung môi lên cột.
+ Đưa mẫu thử lên cột: bột kháng sinh thô hòa tan trong methanol cùng với khoảng 1g silicagel đã hoạt hóa. Sấy cho bay hết dung môi, chuyển bột lên cột. Ổn định cột trong 30 phút.
Chạy cột: cho dung môi trên cột chảy với tốc độ khoảng 0,5ml/phút. Thu phân đoạn vào các ống nghiệm sạch, khoảng 3ml/ phân đoạn.
Xác định các chất trong phân đoạn:
+ Đánh giá HTKS: thử HTKS của các phân đoạn vừa tách được bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Các phân đoạn có HTKS được tiến hành sắc ký lớp mỏng.
+ Sắc ký lớp mỏng, chấm từng phân đoạn lên bản mỏng và chạy sắc ký lớp mỏng để biết các chất trong từng phân đoạn là gì. Phân đoạn chính là phân đoạn có HTKS cao và có Rf trùng nhau.
2.3.11. Phương pháp thu kháng sinh tinh khiết
Các phân đoạn chính sau khi tách được gộp vào, cất quay thu hồi bớt dung môi, chuyển sang ống nghiệm với tỉ lệ dung môi chạy sắc ký : n-hexan (1:4).
Để kết tinh trong tủ lạnh, tinh thể kháng sinh sẽ kết tinh trên thành và trong lòng ống nghiệm.
Gạn và rửa kháng sinh kết tinh trong ống ra đĩa bằng n-hexan, sấy khô thu được kháng sinh tinh khiết.
2.3.12. Phương pháp xác định cấu trúc kháng sinh
Xác định các đặc điểm vật lý: màu sắc, hình dạng tinh thể.
Bột kháng sinh tinh khiết thu được đem đi đo các thông số: phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại, phổ MS để sơ bộ xác định cấu trúc.
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. 3.1. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy và chọn VSV kiểm định.
Kết quả thử HTKS của xạ khuẩn trên tất cả các VSV kiểm định sau khi cấy trên 7 môi trường. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1:
Bảng 3.1 : Kết quả thử hoạt tính kháng sinh trên các môi trường nuôi cấy
Môi trường VSV mm (s) MT1 MT2 MT3 MT6 MT7 S. flexneri 23,33 (0,4) 24,41(0,11) 17,20(0,05) 22,74(0,35) 23,05(0,87) B. subtilis 16,31(0,34) 15,61(0,07) 11,30(0,40) 15,63(0,32) 15,46(0,14) B. pumilis 17,50 (0,02) 16,63(0,31) 10,83(0,36) 16,01(0,51) 15,83(0,06) E. coli 20,92(0,36) 20,67(0,42) 13,98(0,17) 21,53(0,46) 20,91(0,12) S. aureus 19,35(0,13) 21,74(0,38) 16,00 (0,12) 19,55(0,15) 20,99(1,38) B. cereus 22,73(0,64) 24,71(0,57) 16,55(0,39) 23,56(0,53) 24,59(0,85) P. mirailis 22,08(0,1) 23,30(0,54) 16,75(0,17) 21,77(0,37) 22,60(0,58) P.
aeruginosa Không có hoạt tính
Nhận xét:
Xạ khuẩn cho HTKS ở các môi trường MT1, MT2, MT3, MT6, MT7, các môi trường MT4, MT5 không có hoạt tính. Trong đó, môi trường MT1, MT2, MT6, MT7 có hoạt tính khá cao, môi trường MT2 là môi trường cho hoạt tính cao nhất. Vì vậy môi trường MT2 được lựa chọn là môi trường nuôi cấy thích hợp.
Trong các VSV kiểm định, xạ khuẩn không có tác dụng với P. aeruginosa, có tác dụng mạnh nhất trên P. mirabilis, B. cereus, S. flexneri, với các VSV còn lại có tác dụng tương đối mạnh. Vì thế, lựa chọn S. aureus và E. coli làm VSV kiểm định do vòng vô khuẩn tạo ra với các VSV này ở mức trung bình. Phù hợp để tiến hành đánh giá kết quả của các phương pháp đột biến.
3.2. Kết quả nghiên cứu định tên khoa học.
Phân loại xạ khuẩn theo ISP [20]
Bảng 3.2: Kết quả phân loại xạ khuẩn theo ISP
Đặc trưng Streptomyces 183.212 Streptomyces coelicolor
Khuẩn ty khí sinh WY Y Khuẩn ty cơ chất 1 1 Sắc tố melanoid 0 0 Sắc tố hòa tan 1 0 Chuỗi bào tử RF RF Bề mặt bào tử Sm Sm L-arainose + + D-xylose + + Inositol + - D-Manitol + + D-Fructose + + Rhamnose - - Saccarose - - Raffinose - - (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhận xét: Như vậy sơ bộ kết luận, chủng Streptomyces 183.212 thu được có thể là
Streptomyces coelicolor. Tuy nhiên không thể kết luận chắc chắn vì vẫn còn những điểm khác nhau. Tỉ lệ giống là 79% (11/14).
3.3. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên.
Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS của các chủng sau sàng lọc ngẫu nhiên
Kết quả Chủng mm (s) S. aureus E. coli SLNN-1 22,61 (0,32) 22,06 (0,23) SLNN-6 23,19 (0,01) 24,54 (0,28)
SLNN-11 24,35 (0,08) 24,66 (0,09) SLNN-12 24,21 (0,06) 22,65 (0,16) SLNN-13 23,13 (0,19) 23,38 (0,07) SLNN-23 22,05 (1.23) 22,21 (0,28) SLNN-24 21,62 (1,66) 21,63 (0,30) SLNN-25 21,48 (0,07) 22,27 (0,17) SLNN-26 21,21 (0,94) 22,04 (1,54) SLNN-27 21,75 (0.76) 22,22 (0,27) SLNN-30 22,30 (0.11) 24,13 (0.05)
Nhận xét: Từ kết quả trên: các chủng sau khi sàng lọc ngẫu nhiên có HTKS khác nhau. Lựa chọn giữ lại 3 chủng SLNN-11, SLNN-12 và SLNN-30 để tiến hành nghiên cứu tiếp. Trong đó chọn ra chủng SLNN-12 để tiến hành đột biến nhằm tăng HTKS .
3.4. Kết quả đột biến.
3.4.1 Kết quả đột biến lần 1
Đột biến lần 1 tiến hành trên chủng SLNN-12, với tác nhân UV, thời gian chiếu sáng 4 phút 15 giây.
Độ sống sót sau đột biến lần 1: 0,14%
Kết quả HTKS của một số biến chủng sau đột biến 1 được trình bày ở bảng 3.4.1
Bảng 3.4: Kết quả HTKS của các chủng sau đột biến lần 1
Kết quả Chủng S. aureus E. coli mm (s) %HTKS mm (s) %HTKS ĐB1-2 23,73 (0,48) 111,46 23,72 (0,53) 117,37 ĐB1-3 22,87 (0,36) 107,42 23,25 (0,57) 115,04 ĐB1-4 23,99 (0,56) 112,68 23,67 (1,05) 117,12 ĐB1-7 24,49 (1,12) 115,03 22,17 (0,38) 109,70 ĐB1-9 22,07 (0,50) 103,66 22,24 (0,41) 110,04 ĐB1-10 22,77 (0,71) 106,95 22,41 (0,56) 110,89 ĐB1-13 22,67 (0,61) 106,48 20,82 (0,53) 103,02 ĐB1-14 21,00 (0,56) 98,63 22,84 (0,33) 113,01 ĐB1-16 18,68 (0,39) 87,74 18,17 (0,12) 89,91 ĐB1-17 23,91 (0,94) 112,31 22,59 (0,52) 111,78 ĐB1-19 23,07 (0,91) 108,36 22,47 (0,29) 111,18
Chứng 21,29 (0,51) 20,21 (0,40)
Nhận xét: Từ kết quả đột biến lần 1 của chủng SLNN-12, ta thấy hầu hết thu được các chủng tăng lên về HTKS. Chọn giữ lại 3 chủng ĐB1-2, ĐB1-4và ĐB1-7. Trong đó, chủng ĐB1-7được đem tiến hành đột biến lần 2 bằng UV. 3.4.2. Kết quả đột biến lần 2
Đột biến lần thứ 2 tiến hành trên chủng ĐB1-7, tác nhân tia UV, thời gian chiếu sáng 4 phút.
Độ sống sót sau đột biến 2: 0,12%
Kết quả HTKS của một số biến chủng sau đột biến 2 được trình bày ở bảng 3.4.2
Bảng 3.5: Kết quả HTKS của các biến chủng sau đột biến lần 2
Kết quả Chủng S. aureus E. coli mm(s) %HTKS mm(s) %HTKS ĐB2-1 25,64 (0,77) 117,89 24,23 (0,48) 118,02 ĐB2-2 23,67 (1,06) 108,83 25,50 (0,18) 124,21 ĐB2-3 23,17 (0,51) 106,53 23,37 (0,19) 113,83 ĐB2-8 24,63 (0,30) 113,21 22,33 (0,44) 108,77 ĐB2-9 24,58 (1,07) 113,01 23,22 (0,80) 113,10 ĐB2-11 25,65 (0,87) 117,93 22,98 (1,41) 111,93 ĐB2-12 25,00 (0,30) 114,94 22,06 (0,93) 107,45 ĐB2-13 23,03 (0,16) 105,89 22,73 (0,54) 110,72 ĐB2-17 23,67 (0,51) 108,83 21,68 (0,86) 105,60 ĐB2-18 24,70 (0,04) 113,56 22,20 (0,56) 108,13 ĐB2-22 23,40 (0,27) 107,59 21,62 (0,95) 105,31 ĐB2-24 24,15 (0,93) 111,03 21,23 (0,18) 103,41 ĐB2-26 22,26 (0,80) 102,34 21,15 (0,19) 103,02 ĐB2-29 22,96 (0,19) 105,56 21,02 (0,20) 102,39 Chứng 21,75 (0,71) 20,53 (0,32)
Nhận xét: sau khi tiến hành đột biến lần 2 , đa số các biến chủng tăng lên về hoạt tính kháng sinh so với chứng, tỉ lệ tăng cao hơn ĐB1 không nhiều. Các biến chủng ĐB2-1, ĐB2-2, ĐB2-11 được giữ lại để nghiên cứu tiếp.
3.5.1. Kết quả lên men chìm chọn môi trường lên men thích hợp
Thực hiện lên men chìm trong môi trường MTdt1, MTdt2, MTdt7. Sau thời gian lên men, lọc bỏ sinh khối bằng giấy lọc. Thử hoạt tính kháng sinh của dịch lọc bằng phương pháp giếng thạch.
Nhận xét: MTdt1 và MTdt2 cho xạ khuẩn phát triển tốt hơn MTdt7. Trong đó, MTdt2 là môi trường phát triển tốt nhất. Vì vậy, lựa chọn MTdt2 là môi trường lên men thích hợp để chọn chủng có hoạt tính cao nhất.
3.5.2. Kết quả lên men chìm chọn chủng có hoạt tính cao nhất
Qua các lần sàng lọc ngẫu nhiên và đột biến đã giữ lại 9 chủng và biến chủng. Tiến hành lên men chìm với 9 chủng và biến chủng này trên MTdt2. Sau khi lên men, dịch lên men được lọc loại bỏ sinh khối. Thử hoạt tính kháng sinh của dịch lọc cho kết quả như trong bảng 3.5.2.
Bảng 3.7: Kết quả thử HTKS của các chủng và biến chủng sau khi lên men chìm Kết quả Chủng mm (s) S. aureus E. coli SLNN 11 21,67 (0,32) 21,10 (0,21) SLNN 12 23,15 (0,62) 22,97 (0,56) SLNN 30 22,56 (0,43) 21,72 (0,28) ĐB1-2 21,18 (0,47) 22,89 (0,14) ĐB1-4 23,11 (0,14) 22,38 (0,35) ĐB1-7 23,00 (0,37) 22,05 (0,69) ĐB2-1 22,93 (0,13) 22,49 (0,36) ĐB2-2 22,89 (0,27) 22,51 (0,35) ĐB2-11 24,29 (0,28) 23,21 (0,33)
Bảng 3.6: Kết quả thử HTKS khi lên men ở các MTdt khác nhau Kết quả MTdt mm (s) S. aureus E. coli MTdt1 21,52 (0,68) 20,95 (0,07) MTdt2 23,29 (0,38) 22,14 (0,14) MTdt7 11,47 (0,18) 13,62 (0,71)
Nhận xét: khi lên men trên MTdt2 hầu hết các chủng được giữ lại đều cho HTKS cao khi lên men. Trong đó, chủng ĐB2-11 là chủng cho HTKS cao nhất. Vì vậy nên lựa chọn chủng này để lên men tạo kháng sinh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.6. Kết quả thử độ bền pH và độ bền nhiệt.
3.6.1 Độ bền pH
Bảng 3.8: Kết quả thử độ bền với pH của dịch chiết kháng sinh
Kết quả mm(s)
VSV S. aureus E. coli
Thời gian
pH 1 ngày 7 ngày 1 ngày 7 ngày
3 23,73 (0,57) 21,93 (0,65) 22,33 (0,35) 22,05 (0,76)
5 23,09 (0,09) 21,57 (0,86) 22,15 (0,24) 22,17 (0,48)
7 22,45 (0,27) 21,70 (0,97) 21,89 (0,58) 21,61 (0,46)
9 16,71 (0,22) 16,03 (0,71) 16,79 (0,23) 16,11 (0,68)
11 11,79 (0,98) 12,43 (1,07) 11,94 (0,12) 12,69 (0,56)
Nhận xét: kháng sinh có hoạt tính cao hơn ở pH acid, HTKS không thay đổi nhiều sau 7 ngày.
3.6.2 Độ bền nhiệt
Bảng 3.9: Kết quả thử độ bền với nhiệt của dịch chiết kháng sinh
Kết quả mm(s)
Điều kiện thử
VSV Nhiệt độ thường
Cách thủy 30 phút
Đun sôi trực tiếp 10 phút
S. aureus 23,47(0,69) 21,43(0,33) 12,17(0,54) E. coli 23,29(0,41) 19,92(0,56) 13,57(0,26)
Nhận xét: kháng sinh kém bền với nhiệt, ở nhiệt độ càng cao hoạt tính của kháng sinh càng giảm. Vì vậy trong quá trình bảo quản, tinh chế, cần tránh các tác động của nhiệt độ cao.
3.7. Kết quả chọn dung môi hữu cơ chiết kháng sinh.
Bảng 3.10: Kết quả thử HTKS khi chiết bằng các dung môi hữu cơ khác nhau
Dung môi Kết quả VSV
mm (s)
pH dung môi nước dung môi nước Ethyl acetat 3 19,93(0,42) 17,81(0,37) 20,51(0,79) 18,19(0,53) 5 20,17 (0,37) 15,64(0,74) 20,28(0,17) 16,36(0,16) 7 22,46 (0,61) 14,21(0,82) 21,09(0,36) 14,51(0,77) 9 23,49 (0,45) 10,04(0,80) 22,51(0,43) 10,89(0,84) 11 19.98 (0.50) 10.43(0.63) 20.55(0.92) 10.81(0.12) Butyl acetat 3 19,10 (0,33) 11,12(0,33) 18,46(0,93) 22,70(0,73) 5 17,69 (0,56) 9,65(0,53) 15,39(0,73) 23,19(0,67) 7 17,25 (0,82) 10,19(0,57) 15,80(0,74) 23,19(0,46) 9 17,09 (0,36) 9,37(0,17) 15,23(0,35) 23,42(0,82) 11 17,02 (0,47) 8,75(0,22) 14,47(0,49) 22,26(0,92) n- Butanol 3 21,83 (0,97) 14,87(0,42) 21,74(0,22) 15,20(0,23) 5 22,39 (0,88) 17,01(0,90) 22,41(0,31) 17,29(0,66) 7 23,16 (0,33) 14,01(0,54) 22,47(0,49) 13,93(0,42) 9 22,91 (0,31) 13,39(0,35) 22,27(0,57) 13,71(0,20) 11 21,82 (0,50) 13,36(0,49) 21,61(0,12) 13,00(0,21) Dicloromethan 3 20,26 (0,68) 15,29(0,44) 20,90(0,36) 16,06(0,60) 5 19,93 (0,71) 12,53(0,72) 18,84(0,26) 14,83(0,57) 7 19,16 (0,39) 15,00(0,37) 18,96(0,60) 15,83(0,45) 9 18,88 (0,13) 9,41(0,17) 19,75(0,82) 11,11(0,74) 11 20,16 (0,39) 7,55(0,86) 20,72(0,75) 7,52(0,64) Chloroform 3 20,49 (0,29) 14,38(0,95) 20,11(0,55) 13,79(0,66) 5 19,31 (0,45) 13,89(0,56) 18,64(0,26) 12,87(0,12) 7 19,24(0,70) 10,82(0,54) 17,65(0,39) 10,57(0,88) 9 20,92 (0,82) 11,49(0,86) 19,47(0,64) 10,68(0,87) 11 20,00 (0,09) 8,64 (0,38) 18,23(0,59) 10,21(0,94)
Nhận xét: 2 dung môi ethylacetat và butanol là dung môi chiết tốt nhất, cho HTKS trong pha dung môi cao. Tuy nhiên butanol có nhiệt độ sôi cao, nên quá trình cất thu hồi dung môi cần diễn ra ở nhiệt độ cao, có nguy cơ làm mất HTKS (do kháng sinh kém bền ở nhiệt độ cao). Vì thế, ethylacetat là dung môi phù hợp để chiết kháng sinh, trong đó, pH chiết tốt nhất là pH=9. Chiết 1 lần pha nước vẫn còn HTKS, vì thế có thể tiến hành chiết lặp (chiết pha nước bằng dung môi ethylacetat thêm lần 2,3) để chiết kiệt kháng sinh trong pha nước.
3.8.1. Kết quả sắc cột lần 1
3.8.1.1 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi thích hợp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khảo sát một số hệ dung môi bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng để lựa chọn hệ dung môi tách tốt nhất.
Các hệ dung môi được khảo sát:
Hệ 1: Chloroform : Methanol : Amoniac 25% (2:2:1)
Hệ 2: n-Butanol : Ethanol : Dimethylformamid (3:1:1)
Hệ 3: Butylacetat : Aceton : Triethylamin (1:2:1)
Hệ 4: Ethylacetat : Propanol : Acetonitril (2:3:1)
Bảng 3.11: Kết quả sắc ký lớp mỏng khảo sát hệ dung môi
Hệ dung môi Hệ 1 Hệ 2 Hệ 3 Hệ 4 Rf1 0,89 0,79 0,70 0,70
Rf2 0,86 0,81
Ghi chú 1 vết 1 vết 2 vết, tách không rõ 2 vết, tách rõ, tròn vết
Nhận xét: hệ 4 là hệ tách tốt nhất được lựa chọn để chạy sắc ký cột tinh chế kháng sinh.
3.8.1.2. Sắc ký cột lần thứ nhất
Loại tạp, tách thành các phân đoạn nhỏ, bước đầu thu kháng sinh tinh khiết.
Chạy sắc ký bằng 0,127 g kháng sinh thô với hệ dung môi 4 (ethylacetat : propanol : acetonitril (2:3:1). Thu được 24 phân đoạn, mỗi phân đoạn 3 ml. Thử hoạt tính kháng sinh và tiến hành sắc ký lớp mỏng với 1 số phân đoạn để xác định thành phần trong các phân đoạn.
Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh của các phân đoạn SKC lần 1