Nghiên cứu phân biệt đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của hai loài nưa thuộc chi amorphophallus, họ ráy ( araceae)

CAO THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU PHÂN BIỆT ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HAI LOÀI NƯA THUỘC CHI AMORPHOPHALLUS, HỌ RÁY ARACEAE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người hướng dẫn: 1

AMORPHOPHALLUS, HỌ RÁY

(ARACEAE)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SỸ

HÀ NỘI – 2014

CAO THỊ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU PHÂN BIỆT ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HAI LOÀI NƯA THUỘC CHI

AMORPHOPHALLUS, HỌ RÁY

(ARACEAE)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

Người hướng dẫn:

1 PGS.TS Nguyễn Viết Thân

2 DS Nguyễn Thị Thu Huyền Nơi thực hiện:

Bộ môn Dược liệu

HÀ NỘI – 2014

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cám ơn chân thành tới

PGS TS Nguyễn Viết Thân người thầy trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo

mọi điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận

Em xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc tới: DS Nguyễn Thị Thu Huyền, DS Nguyễn Thanh Tùng, các thầy cô giáo giảng viên và các anh chị kỹ

thuật viên trong bộ môn Dược Liệu đã tận tình giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện cho em trong suốt quá trình làm khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy giáo, cô giáo giảng viên trường đại học Dược Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, giảng dạy, dìu dắt và truyền nhiệt huyết cho em trong suốt 5 năm học vừa qua

Cuối cùng, em xin gửi lời cám ơn chân thành tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập

Sinh viên

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ HỌ RÁY (ARACEAE) 3

1.1.1 Vị trí phân loại họ Ráy (Araceae) 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của họ Ráy (Araceae) 3

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHI AMORPHOPHALLUS 4

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Amorphophallus 4

1.2.2 Đặc điểm thực vật của một số loài thuộc chi Amorphophallus 5

1.2.3 Các nghiên cứu ở Việt Nam về chi Amorphophallus 10

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 13

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 13

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 13

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.2.1 Nghiên cứu về mặt cảm quan của hai loài Nưa 14

2.2.2 Nghiên cứu về vi phẫu củ và vi học bột củ của hai loài Nưa 14

2.2.2 Nghiên cứu về hóa học bột củ của hai loài Nưa 15

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16

3.1 NGHIÊN CỨU VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA HAI LOÀI NƯA 16

3.1.1 Mô tả về đặc điểm hình thái của hai loài Nưa 16

3.1.2 Nghiên cứu vi học bột của hai loài Nưa 17

3.1.3 Nghiên cứu vi phẫu củ của hai loài Nưa 22

3.2 ĐỊNH TÍNH SƠ BỘ CÁC NHÓM CHẤT TRONG CỦ HAI LOÀI NƯA BẰNG CÁC PHẢN ỨNG HÓA HỌC 24

3.2.1 Phản ứng định tính glycosid tim 24

3.2.2 Định tính saponin trong dược liệu 26

3.2.6 Định tính polysaccharid 28

3.2.7 Định tính acid amin 29

3.2.8 Định tính acid hữu cơ 29

3.2.9 Định tính flavonoid 29

3.2.10 Định tính coumarin 31

3.2.11 Định tính alcaloid 32

3.2.12 Định tính chất béo, steroid, caroten 33

3.3 ĐỊNH TÍNH DỊCH CHIẾT HAI LOÀI NƢA BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG 35

3.4 BÀN LUẬN 41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43

1 KẾT LUẬN 43

2 ĐỀ XUẤT 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

KM: Khoai môn

Mẫu N1: Mẫu Nưa 1

Mẫu N8: Mẫu Nưa 8

1 Bảng 3.1 Sự khác nhau về đặc điểm hình thái hai loài Nưa 18

2 Bảng 3.2 Sự khác nhau về đặc điểm vi học bột hai loài Nưa 18

3 Bảng 3.3 Kết quả định tính các nhóm chất trong củ của hai

16 Hình 3.7 Sắc ký đố dịch chiết thủy phân hai mẫu Nưa với hệ dung

môi toluen-ethyl acetat-acid formic (6:2:0,5) 36

17 Hình 3.8 Sắc ký đồ dịch chiết thủy phân hai mẫu Nưa với hệ dung

môi ether dầu hỏa-ethyl acetat-aceton-acid formic (3:1:0,5:0,05) 38

18 Hình 3 9 Sắc ký đồ dịch chiết thủy phân hai mẫu Nưa với hệ dung

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa Vì vậy, nước

ta có thảm thực vật phong phú và có nhiều tiềm năng về cây thuốc Theo thống kê

sơ bộ của viện dược liệu nước ta có khoảng 14.000 loài thực vật, nấm tảo trong đó

có gần 4000 cây thuốc

Họ Ráy (Araceae) là một họ thực vật một lá mầm, có đặc điểm hình thái đa dạng và phong phú Theo PGS TS Phạm Hoàng Hộ, Việt Nam có khoảng 30 chi,

135 loài Ráy [12]

Chi Nưa (Amorphophallus) là một chi thuộc họ Ráy, được trồng nhiều ở các

tỉnh vùng núi, trung du, miền Nam và miền Bắc Cây cho năng suất cao và chịu được điều kiện khắc nghiệt Trước kia, ở một vài địa phương cây thường được trồng lấy củ

và lá dùng làm lương thực, thức ăn trong chăn nuôi Hiện nay, với sự phát triển của

mô hình bệnh tật tăng cao, một số loài trong chi Nưa đã được nghiên cứu và sử dụng làm thuốc Nhiều nghiên cứu về thành phần và vai trò củ Nưa cho thấy trong bột củ

có chứa glucomannan là hợp chất có nhiều công dụng quý, có tác dụng tốt đến bệnh ung thư, tim mạch, béo phì, cao huyết áp Ở nhiều nước trên thế giới củ Nưa đã được nghiên cứu, sử dụng và đem lại nguồn lợi lớn Ở nước ta cây Nưa ít được nghiên cứu và khai thác sử dụng hợp lý [13] Mặc dù có rất nhiều loài Nưa nhưng hầu

hết các nghiên cứu chỉ tập trung về hai loài Amorphophallus kojac C Koch và

Amorphophallus peaoniifolius (Denst.) Nicols Các loài khác ít được quan tâm đến,

đặc biệt là về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học cũng như cách phân biệt chúng Nhằm góp phần phát hiện, phân biệt và nâng cao giá trị sử dụng của từng loài

Nưa thuộc chi Amorphophallus và góp phần bảo tồn, phát triển nguồn gen quý để phát triển đề tài “Thu thập nguồn gen và tri thức bản địa các nguồn gen nghiên

cứu” chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành

phần hóa học của hai loài Nƣa thuộc chi Amorphophallus, họ Ráy (Araceae)’’

với mục tiêu:

Tạo cơ sở dữ liệu, các lý lịch về thực vật, hiển vi, hóa học nhằm từng bước phân biệt các loài Nưa, cũng như mong muốn góp phần vào công tác kiểm nghiệm dược liệu

Để thực hiện được mục tiêu trên, đề tài được tiến hành với những nội dung sau:

Về thực vật: Mô tả đặc điểm hình thái cây, vi phẫu, bột củ của hai loài Nưa và

so sánh chúng

Về hóa học: Định tính các nhóm chất bằng phương pháp hóa học, sắc ký lớp mỏng dịch chiết methanol, thủy phân và so sánh chúng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ HỌ RÁY (ARACEAE)

1.1.1 Vị trí phân loại họ Ráy (Araceae)

Theo từ điển cây thuốc Việt Nam của Võ Văn Chi (2012), trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam và các tài liệu phân loại thực vật vị trí phân loại của họ Ráy trong giới thực vật như sau:

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của họ Ráy (Araceae)

Cây cỏ mọc ở nơi ẩm, sống dai nhờ thân rễ Thân nạc hoặc leo mang nhiều lỗ khí sinh thõng xuống Lá thường đơn, có bẹ, gân lông chim, chân vịt hay song song Cụm hoa bông mo nạc, không phân nhánh, mang nhiều hoa Mo thường có màu sặc

sỡ, một số có mùi thơm Trục hoa có thể mang hoa khắp bề mặt hay kết thúc bằng một phần không mang hoa, thường có hoa cái ở dưới, hoa đực ở trên Hoa nhỏ không cuống hay cuống không rõ rệt, đơn tính, lưỡng tính hay tạp tính Hoa lưỡng tính thường có 3 vòng hoa, mỗi vòng có 3 bộ phận; hoa đơn tính có bao hoa tiêu giảm hay trần Bộ nhị có 2 vòng, mỗi vòng có 3 nhị có khi còn 1 nhị ở hoa đơn tính

Bộ nhụy thường có 2-3 lá noãn, có khi chỉ 1 lá noãn ở hoa đơn tính, chứa 1-nhiều noãn đảo, cong hay thẳng [7], [24]

Quả mọng một hoặc nhiều hạt Hạt có nội nhũ nạc [7], [24]

Theo sách thực vật, cây phân bố ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, một số là ôn đới Việt Nam có khoảng 30 chi, 135 loài mọc hoang và được trồng làm thức ăn cho lợn (Ráy, Nưa), lương thực (Khoai sọ), rau ăn (các loại Môn, Sọ), cây cảnh (Vạn Niên Thanh…) Có

12 loài thường dùng làm thuốc trong đó có 4 loài thường dùng trong công nghiệp dược là Bán hạ, Thạch xương bồ, Thủy xương bồ, Thiên niên kiện [7]

Một số chi điển hình của họ ráy [7]:

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHI AMORPHOPHALLUS

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Amorphophallus

1.2.1.1 Đặc điểm thực vật chi Amorphophallus

Cây ưa ẩm, chịu bóng, thường mọc dưới tán cây rừng ẩm trên núi đất và núi

đá vôi, đất xốp nhiều màu, pH từ trung bình đến kiềm Cây ra hoa hàng năm tái sinh chủ yếu bằng hạt Cây mọc từ hạt sau 2-3 năm mới có hoa Phần trên mặt đất tàn lụi hàng năm vào mùa đông [1]

Theo từ điển thực vật thông dụng, cây thân thảo có dạng rễ củ Lá có dạng lược, có phiến chia nhiều hay ít [10]

Cụm hoa gồm một bông mo không có hoa bất thụ, ở đỉnh của bông có một phần phụ hình nón, tất cả được bao trong một cái mo dạng sừng, lốm đốm nâu và trắng [9], [10]

1.2.1.2 Phân loại thực vật và phân bố chi Amorphophallus

Chi Amorphophallus có khoảng 170 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới

châu Á, châu Phi, Mardagascar, Australia Ở Việt Nam có khoảng 25 loài có thân

(củ) to có nhiều tinh bột, ăn được và có 2 loài Amorphophallus konijac C Koch và

Amorphophallus paeoniifolius (Denst.) Nicols là thông dụng [10]

Nưa (chi Amorphophallus) phân bố chủ yếu ở các tỉnh vùng núi (có độ cao

thường dưới 1000m) và trung du của miền Bắc và miền Nam Việt Nam có nguồn Nưa phong phú Tổng lượng ước tính có khoảng 1000 tấn [10]

Một số loài điển hình thuộc chi Amorphophallus [12]:

Amorphophallus konijac C Koch

Amorphophallus paeoniifolius (Denst.) Nicols

Amorphophallus interrutuptus Engler & Gehrm

Amorphophallus verticillatus Hett

Amorphophallus mekongeasis Engler & Gehrm

Amorphophallus panomensis Gagn

Amorphophallus tonkinensis Engler & Gehrm

Amorphophallus arnoutovil Hett

Amorphophallus pilosus Hett

Amorphophallus lanuginosus Hett

Amorphophallus coeateus S Y Liu & S J Wei, Guihaia

1.2.2 Đặc điểm thực vật của một số loài thuộc chi Amorphophallus

1.2.2.1 Amorphophallus konijac C Koch

Tên khác: Củ Nưa, Khoai na, Khoai ngát

Đặc điểm thực vật và phân bố

Cây thảo lớn, sống lâu năm, cao 50-70cm Thân củ to, mặt trên lõm, mặt dưới lồi và mang nhiều u tròn, vỏ ngoài màu nâu, ruột trằng vàng Lá mọc thẳng từ thân củ, sau khi cây ra hoa, thường chỉ có 1 (ít khi 2 lá) có cuống dài và mập, màu nâu, có những điểm đốm trắng, phiến lá chia thành 3 nhánh, các nhánh lại phân chia tiếp và chẻ thùy sâu hình lông chim, hai mặt nhẵn Cụm hoa mang trên cuống mập dài, mọc thẳng đứng, cao 30-40cm, có mo to, mặt ngoài màu lục, mặt trong màu đỏ tía, mép uốn lượn, bông mo dài gấp đôi mo mang phần hoa cái ở dưới ngắn, phần hoa đực ở giữa dài hơn và phần phụ ở trên dài gấp 3-4 lần phần kia Hoa không có bao hoa, hoa đực có nhị rời, hoa cái có bầu hình trứng Hoa có mùi khó ngửi Quả mọng [1], [14] Cây mọc hoang ở rừng thưa, ven suối, chỗ ẩm, đất nhiều mùn Có nơi trồng lấy củ để ăn và nuôi lợn [16]

Các bộ phận đều có dịch ngứa Cuống lá và củ ăn được Củ làm thuốc chữa bệnh đường tiêu hóa và trúng độc cấm khẩu Mùa hoa từ tháng 3-5 [1], [14]

Bộ phận dùng

Thân củ, thu hoạch vào tháng 9-11 cạo sạch vỏ, và rễ con, đồ chín hay sấy khô Khi dùng ngâm cho mềm, thái mỏng, ngâm nước phèn và gừng (cứ 1kg củ Nưa cần 300g gừng tươi và 50g phèn chua) trong 24 giờ rồi sao thơm cho hết ngứa [1]

Tác dụng kháng khuẩn: Dịch chiết ethanol của củ Nưa trên môi trường nuôi

cấy có tác dụng ức chế Bacillus diphtheria, Bacillus typhi, Streptococus

hemolyticus, nồng độ ức chế 3 chủng vi khuẩn trên lần lượt là là 62,5g/l; 5,25g/l;

250g/l [1]

Tác dụng chống viêm: Dịch chiết ethanol của củ Nưa thí nghiệm trên chuột

cống trắng, tiêm thẳng vào dạ dày với liều 15g/kg, dùng 7 ngày liên tiếp, có tác

dụng ức chế phù chân chuột do albumin gây nên [1]

Tác dụng đối với tim mạch: Dạng dịch chiết ethanol từ củ Nưa (1:1) trên tiêu

bản tai thỏ cô lập với liều 2ml/lần cho vào dịch truyền có tác dụng gây giãn mạch Tác dụng này có liên quan tới thụ thể β2 bị kích thích Trên tim ếch cô lập dạng dịch chiết với nồng độ 1:2 đến 1:16 có tác dụng ức chế co bóp tim, trên thỏ gây mê với

liều 15g/kg tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm phúc mạc đều có tác dụng hạ huyết áp [1]

Tác dụng hạ lipid máu: Thí nghiệm trên chuột cống trắng có nồng độ lipid cao

thực nghiệm, trộn củ Nưa với thức ăn hàng ngày của chuột với tỉ lệ 2,5; 5,0 và 10%

có tác dụng giảm cholesterol huyết thanh Dạng dịch chiết ethanol của củ Nưa cũng

có tác dụng làm giảm lipid máu [1]

Tác dụng khác: Dịch chiết ethanol từ Nưa dùng đường uống với liều 15g/kg

có tác dụng làm giảm độ nhớt của máu toàn phần ở chuột thí nghiệm

Ngoài ra củ Nưa còn có tác dụng đối kháng với tình trạng thiếu oxy ở súc vật thí nghiệm, kéo dài thời gian sống [1]

Bài thuốc dân gian thường dùng

Chữa liệt nửa người (sau tai biến mạch máu não, chấn thương nặng sau thắt lung): Củ Nưa sống 10g, Ô đầu 1g, Phụ tử 1g, nước 600ml nấu còn lại 100ml, chia uống nhiều lần trong ngày, uống sau khi ăn no (thường có độc, cẩn thận khi dùng) Chữa mụn nhọt, sưng tấy, rắn cắn: Củ tươi giã ra đắp lên mụn nhọt và vết thương Chữa sốt rét, ăn chậm tiêu: Củ Nưa phơi khô 4-12g sắc uống

Chữa ho, nhiều đờm: Củ Nưa, Trần bì, Bán hạ nam mỗi thứ 40g sao thơm, tán mịn, dùng nước cốt gừng quấy hồ, làm viên bằng hạt ngô mỗi lần dùng 30 viên Trẻ

em dưới 10 tuổi mỗi lần dùng 10-15 viên [16]

1.2.2.2 Amorphophallus paeoniifolius (Denst.) Nicols

Tên khác: Nưa chuông, Khoai na

Đặc điểm thực vật và phân bố

Cây thảo sống hàng năm có thân củ nằm trong đất; có hình bán cầu rộng, đường kính tới 20cm, mặt dưới lồi mang một số rễ phụ, và có những nốt như củ khoai tây xung quanh có 3-5 mấu lồi Vỏ củ có màu nâu, thịt trắng vàng và cứng Lá mọc sau khi đã có hoa, thường chỉ có 1 lá có cuống cao tới 1,5m, màu xanh thẫm có đốm bột trắng; phiến lá chia làm 3 nom tựa như lá đu đủ Cụm hoa gồm một mo không cuống hoặc cuống ngắn dài khoảng 70cm, bông mo màu đỏ xanh có đốm trắng, mặt trong

đỏ thẫm, bao lấy một bông mo là một phần mang phần hoa cái ở dưới phần hoa đực ở trên Phần hoa cái có hình trụ, phần hoa cái hình nón ngược Hoa có mùi khó ngửi Quả mọng, màu xanh, khi chín có màu vàng cam tới đỏ [10], [24]

Cây thường phân bố ở Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Việt Nam, Campuchia, Malaixia và Philiphin Ở Việt Nam cây mọc hoang và trồng phổ biến ở các tỉnh Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hòa Bình, Hà Tây, Nghệ An, Hà Tĩnh vào tới Quảng Trị, Thừa Thiên Huế [9], [10]

Tác dụng dược lý

Tác dụng chống oxy hóa: Nghiên cứu cho thấy, dịch chiết ethanol của Amorphophallus paeoniifolius (Denst.) Nicols có tác dụng ức chế peroxyd lipid

giảm từ 4,3% đến 67,2% phụ thuộc vào liều Khả năng peroxyd lipid của dịch chiết

cồn của chúng dựa trên gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl-2 (DPPH) và khả

năng ức chế tỷ lệ phần trăm dựa trên 2,2-azinobis-(-3-ethyl) sulfonate (ABTS +) và H2O2 Dịch chiết ethanol của Amorphophallus paeoniifolius

benzo-thiozoline-6-(Denst.) Nicols cho thấy tối đa là 68,6% hoạt động peroxyd lipid là nhờ gốc tự do DPPH và ức chế tối đa 74% và 67,2% trong trường hợp tương ứng là ABTS và

H2O2 Hiệu quả chống oxy hóa và ức chế quá trình oxy hóa của dịch chiết ethanol

của Amorphophallus paeoniifolius (Denst.) Nicols được tìm thấy là phụ thuộc vào

liều ở nồng độ thử nghiệm của 1-50 µg/ml Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPTLC) cho thấy sự xuất hiện của chất polyphenol như axit galic, resveratrol, quercetin và hai hợp chất không xác định Như vậy kết quả cho thấy dịch chiết ethanol của

Amorphophallus paeoniifolius (Denst.) Nicols có hoạt tính chống oxy hóa mạnh

trong phòng thí nghiệm và có thể được sử dụng như một nguồn chất chống oxy hóa

an toàn và hiệu quả [22]

Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương: Khi nghiên cứu tác dụng của dịch chiết

ether dầu hỏa của Amorphophallus paeoniifolius (Denst.) Nicols trên nhóm 5 nhóm

chuột (chuột bạch), tiêm phúc mạc với liều như sau: nhóm I liều 1500mg/kg, nhóm

II với liều 2000mg/kg, nhóm III với liều 2500mg/kg, nhóm IV với liều 3000mg/kg, động vật nhóm V với liều 3500mg/kg cho thấy gây ra trầm cảm ở nhóm này, tỉ lệ tử vong gây ra ở mức liều 2500 mg/kg và có thể sử dụng an toàn ở mức liều 1500mg/kg Tác động của dịch chiết này lên hoạt động của hệ thần kinh trung ương

là gây ra hoạt động trầm cảm như: buồn ngủ và làm giảm hoạt động vận động của động vật thí nghiệm Cơ chế của hoạt động trầm cảm này chưa được xác định rõ ràng, nhưng người ta cho rằng là do ảnh hưởng trên vỏ não Hoạt động trầm cảm cao điểm đã được quan sát thấy ở 60 phút kể từ khi tiêm dịch chiết Thời gian phục hồi hoạt động trầm cảm của dịch chiết ether dầu hỏa (1000mg/kg) và diazepam

(1,5mg/kg) đã được tìm thấy tương ứng là 24 giờ và 20 giờ Phenobarbiton và diazepam được biết đến thuốc giảm đau thần kinh trung ương và cũng cho thấy hoạt động trầm cảm thần kinh trung ương một cách phụ thuộc vào liều Một tác dụng hiệp đồng đáng kể của các dịch chiết ether dầu hỏa với diazepam đã được tìm thấy trong khi có rất ít tác dụng hiệp đồng với phenobarbiton Dịch chiết ether dầu hỏa

của Amorphophallus paeoniifolius (Denst.) Nicols gây ra hoạt động trầm cảm đáng

kể lên thần kinh trung ương và hoạt động đó phụ thuộc vào liều [26]

Tác dụng chống viêm: Dịch chiết methanol của Amorphophallus paeoniifolius

(Denst.) Nicols có hoạt động chống viêm nổi bật trong khi dịch chiết cloroform có tác dụng nhẹ hơn Ba giờ sau khi tiêm carrageenan, dịch chiết methanol với liều 200 và

400mg/kg sản xuất 37,5% và 45,83% ức chế khi so sánh với nhóm đối chứng [20]

Tác dụng giảm đau: Phát hiện dịch chiết methanol của Amorphophallus paeoniifolius (Denst.) Nicols ở liều 250 và 500mg/kg trọng lượng cơ thể dùng màng

bụng có tác dụng giảm đau đáng kể [21], [27]

Tác dụng kháng khuẩn: Dịch chiết ethanol của Amorphophallus paeoniifolius

(Denst.) Nicols có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, và các tác nhân gây độc tế bào [23]

Tác dụng diệt giun: Dịch chiết methanol từ củ của Amorphophallus paeoniifolius (Denst.) Nicols đã được nghiên cứu chống lại antihelmintic pheretima posthuma và tubifex Dịch chiết methanol với nồng độ 25, 50 và 100 mg/ml đã được

thử nghiệm trong các xét nghiệm sinh học, có liên quan đến xác định thời gian tê

liệt và thời gian gây chết của giun [21]

Công dụng

Củ Nưa chuông có vị cay, tính nóng, có độc Củ có tác dụng lợi tiêu hóa bổ dưỡng hồi phục sức khỏe, lợi trung tiện, dùng để chữa trị kiết lỵ Nếu dùng tươi có tác dụng kích thích làm long đờm và có thể dùng để trị thấp khớp cấp tính Nưa chuông có thể dùng với công dụng như củ Nưa, được trồng chủ yếu để lấy bột Dọc Nưa chuông cũng ăn được, nhưng phải ngâm nước vo gạo cho hết ngứa [16]

Bài thuốc dân gian thường dùng

Dùng làm thức ăn phụ cho người tiểu đường: Thân củ Nưa chuông thu hoạch sau khi tàn cây, cạo sạch vỏ phơi hay sấy khô Khi dùng nấu chín nhừ hay phối hợp với các vị thuốc khác [16]

1.2.2.3 Amorphophallus coeataneus S Y Liu & S J Wei, Guihaia

Quả mọng màu xanh đậm hình bầu dục

Bộ phận dùng: Thân củ [24]

1.2.3 Các nghiên cứu ở Việt Nam về chi Amorphophallus

Năm 2012, khi “Nghiên cứu trồng và phát triển cây Nưa konjac

(Amorphophallus) và một số loài khác trong chi Nưa (họ Ráy–Araceae) ở Việt Nam

hướng tới việc lấy củ làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng và thuốc điều trị bệnh tiểu đường, mỡ máu và béo phì” TS Trần Văn Dư xác định được bốn loài Nưa được cho là có triển vọng làm nguồn nguyên liệu tách chiết glucomannan là các loài Nưa

konjac (Amorphhophallus konjac K Koch), Nưa đầu nhăn (Amorphophallus

corrugatus N E Br), Nưa krausei (Amorphophallus krausei Engler, Pflanzenr) và Nưa

Vân Nam (Amorphophallus yunnanensis Engler, Pflanzenr) Nghiên cứu xác định được hàm lượng glucomannan ở củ cây Nưa Chuông (Amorphophallus paeoniifolius (Denst.) Nicols) là 5% và cây Nưa đầu nhăn (Amorphophallus corrugatus N E Br) là 10% trọng

lượng tươi, tương đương 25% và 50% trọng lượng khô Đồng thời, phát hiện được quần thể loài Nưa konjac ở Việt Nam tại 2 huyện Đồng Văn và Quản Bạ tỉnh Hà Giang [32]

Năm 2013, trong “Nghiên cứu quy trình tách chiết, cấu trúc hóa học và hoạt tính

sinh học của glucomannan từ cây Nưa-Amorphophallus sp (họ ráy-Araceae)” của TS

Trần Thị Ý Nhi (Viện hóa học –Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã nghiên cứu và xác định được tên khoa học của 3 loài Nưa ở Việt Nam

là: Amorphhophallus konjac C Koch ; Amorphophallus corrugatus N E Br và

Amorphophallus paeoniifolius (Dennst.) Nicolson Trong đó loài Amorphophallus konjac C Koch mới được phát hiện ở Việt Nam năm 2012 Hàm lượng glucomannan

trong thân (củ) của mỗi loài Nưa tại Việt Nam đã được nghiên cứu và xác định bằng phương pháp so màu thuốc thử 3,5-DNS Kết quả của nghiên cứu là cơ sở xây dựng quy trình tách chiết glucomannan quy mô phòng thí nghiệm từ 3 loài Nưa trên Trong nghiên

cứu này cấu trúc hóa học tính chất hóa lý của sản phẩm cũng đã được xác định [29]

Năm 2014, trong “Nghiên cứu hàm lượng, chất lượng, tác dụng dược lý và xây

dựng quy trình sản xuất glucomannan trong củ Nưa-Amorphophallus sp (họ

Ráy-Araceae) trồng tại tỉnh Thừa Thiên Huế” thuộc Sở KH&CN tỉnh Thừa Thiên Huế đã xác định được các đặc điểm sinh học, các chỉ tiêu sinh trưởng, điều kiện sinh thái và quy mô trồng trọt của loài Nưa hiện có tại Thừa Thiên Huế Mẫu nghiên cứu lấy tại

xã Quảng Thọ Tại đó hiện nay có gần 10ha Nưa được trồng trong vụ đông, đem lại thu nhập 5-7 triệu đồng/sào/vụ, bình quân mỗi ha Nưa thu nhập trên 100 triệu đồng/vụ Cây Nưa là cây có khả năng chịu được điều kiện khắc nghiệt, thời gian sinh trưởng ngắn, và có thể trồng trái vụ nên được người dân đưa vào trồng và đã mang lại giá trị kinh tế cao Đề tài đã làm sáng tỏ thành phần hóa học, tính chất của glucomannan, sản phẩm bột glucomannan thu được có dạng hạt mịn, trắng, hiệu suất tách chiết đạt tỷ lệ 30,4% trên khối lượng củ Nưa khô Đề tài cũng đã nghiên cứu được tác dụng hạ đường huyết của glucomannan từ củ Nưa trên chuột bị gây đái tháo đường bằng streptozocin, tác dụng hạ cholesterol máu bằng thử nghiệm trên chuột đã gây tăng cholesterol ngoại sinh và thỏ đã gây tăng cholesterol nội sinh và khả năng

chống béo phì theo phương pháp Kobayasshi-xác định lượng mỡ quanh thận, mỡ mào tinh hoàn trên chuột cống trắng [29]

Cùng năm 2014, “Nghiên cứu sinh trưởng của cây Nưa Chuông

(Amorphophallus Paeoniifolius (Denst.) Nicols) Ở Thừa Thiên Huế” của trường

Đại học Huế đã xác định: Năng suất lý thuyết của củ Nưa khoảng 92 tấn/ha, năng suất thực tế đạt 82,8 tấn/ha Kết quả này cho thấy năng suất củ Nưa cao hơn rất nhiều so với khi trồng những đối tượng khác như khoai Lang và khoai Môn (năng suất khoai Lang được coi là có triển vọng đạt khoảng 11-23,6 tấn/ha, năng suất củ trung bình của giống khoai Môn cao sản KM-1 khoảng 50-60 tấn/ha (Nguyễn Văn Mùi, 2001)) [15] Đề tài cũng nghiên cứu hàm lượng glucomannan trong củ Nưa, kết quả nghiên cứu cho thấy rằng hàm lượng glucomannan trong củ chính chiếm 35,4%, trong củ nhánh là 30,7% cao hơn hàm lượng glucomannan mà Liu và cộng

sự đã công bố ở củ Nưa được trồng ở Pinglan (đạt khoảng 20,1%) và cao hơn so với Nưa được trồng ở anyuan, Qijiang (12,5%) trong nghiên cứu của cùng tác giả trên ở Trung Quốc (Liu Pei-Ying, Wang Yulan, 1990; Liu Pei-Ying và nnk., 1998) [25] Trong khi đó, hàm lượng tinh bột của khoai tây dao động từ 8-30%, của khoai lang

là 15-31%, của sắn là 20-25% (Nguyễn Thị Phương, 2011) Nghiên cứu đã xác định được tiềm năng cung cấp tinh bột thực phẩm của củ Nưa là rất lớn, có thể mở ra một hướng mới trong việc dùng củ Nưa làm nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất tinh bột [13]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Nguyên liệu nghiên cứu gồm 8 mẫu dược liệu sau:

- Mẫu Nưa 1 (ký hiệu mẫu N1) thu hái ở Đan Phượng- Hà Nội vào 10/2013

- Mẫu Nưa 2 (ký hiệu mẫu N2) thu hái ở Nho Quan-Ninh Bình vào 1/2014

- Mẫu Nưa 3 (ký hiệu mẫu N3)thu hái ở Nho Quan-Ninh Bình vào tháng 1/2014 (mẫu này có nguồn gốc ở Hà Tĩnh và được trổng ở Ninh bình một năm tính đến thời điểm thu hái)

- Mẫu Nưa 4 (ký hiệu mẫu N4)thu hái ở Nho Quan-Ninh Bình vào tháng 1/2014 (mẫu này có nguồn gốc ở Huế và được trổng ở Ninh bình một năm tính đến thời điểm thu hái)

- Mẫu Nưa 5 (ký hiệu mẫu N5) thu hái tại vườn Quốc Gia Ba Vì vào tháng 2/2014

- Mẫu Nưa 6 (ký hiệu mẫu N6) thu hái tại vườn Quốc Gia Ba Vì vào tháng 2/2014

- Mẫu Nưa 7 (ký hiệu mẫu N7) thu hái tại vườn Quốc Gia Ba Vì vào tháng 2/2014

- Mẫu Nưa 8 (ký hiệu mẫu N8) thu hái tại Phú Quốc vào tháng 4/2014

Các mẫu sau khi thu hái, một phần được trồng ở vườn Thực Vật trường Đại học Dược Hà Nội và ở Nho Quan-Ninh Bình để lưu mẫu để tiếp tục nghiên cứu và giám định tên khoa học của các loài

Các mẫu nghiên cứu được rửa sạch, cạo bỏ lớp bần, thái lát và sấy khô, nghiền thô bằng thuyền tán để lấy mẫu nghiên cứu

Sau khi nghiên cứu 8 mẫu Nưa trên, chọn 2 mẫu N2 và mẫu N6 để so sánh và phân biệt trong đề tài

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Hóa chất và dụng cụ

- Hóa chất và thuốc thử trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích theo Dược Điển

Việt Nam IV [8]

- Hóa chất: Javen, acid acetic, xanh methylen, đỏ son phèn, nước cất, cloral hydrat

25%, natri sulfat khan

- Dung môi hữu cơ: Cloroform, n-butanol, ethyl acetat, acid formic, ether dầu hỏa,

toluen…

- Thuốc thử: Các thuốc thử dùng trong phản ứng định tính và sắc ký

- Bản mỏng tráng sẵn silicagel 60F254 của Merck

- Dụng cụ: Dụng cụ thủy tinh và các dụng cụ khác dùng trong phòng thí nghiệm

(cốc có mỏ, bát sứ, chày, cối, thuyền tán, đũa thủy tinh, lam kính, bình nón…)

2.1.2.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

- Kính hiển vi Labomed

- Cân kỹ thuật Sartorius

- Cân phân tích Precisa

- Tủ sấy

- Máy chấm sắc ký CAMAG LINOMAT 5

- Máy chụp ảnh sắc ký CAMAG REPROSTAR 3

- Máy vi tính với phần mềm winCATS và VideoScan

- Máy ảnh Canon, Sony

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm và kiểm định theo tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV [8]

2.2.1 Nghiên cứu về mặt cảm quan của hai loài Nưa

Quan sát, mô tả dược liệu về đặc điểm thực vật, hình dạng, màu sắc, mùi vị, kích thước bằng mắt thường và chụp ảnh [4]

2.2.2 Nghiên cứu về vi phẫu củ và vi học bột củ của hai loài Nưa

Đặc điểm vi phẫu: Mẫu Nưa (củ) được cắt vi phẫu bằng dụng cụ cắt cầm tay,

tẩy và nhuộm theo phương pháp nhuộm kép, quan sát dưới kính hiển vi xác định đặc điểm vi phẫu và chụp ảnh các đặc điểm vi phẫu dưới kính hiển vi sau đó vẽ sơ

đồ tổng quát [2], [4], [17]

Soi bột: Mẫu Nưa (củ) được thu hoạch, sửa sạch, sấy khô, được nghiền nhỏ

thành bột bằng thuyền tán và cối sứ, rây lấy bột mịn, lên tiêu bản và quan sát, chụp ảnh dưới kính hiển vi để xác định các đặc điểm bột [2], [17]

2.2.2 Nghiên cứu về hóa học bột củ của hai loài Nƣa

Hai mẫu Nưa sau khi thu hái được rửa sạch, cạo vỏ, sấy khô và nghiền thô bằng thuyền tán để làm các phản ứng kiểm nghiệm bằng phương pháp hóa học như sau:

- Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong dược liệu bằng phản ứng hóa học theo

các tài liệu dược liệu học [5], [6], thực tập dược liệu phần kiểm nghiệm bằng phương pháp hóa học [3], phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc [11], hóa học saponin [16]

- Sắc ký lớp mỏng [11]:

Chuẩn bị dịch chiết methanol và dịch chiết thủy phân

Sử dụng bản mỏng Silicagel 60F254 tráng sẵn của Merck, hoạt hóa ở 110oC

trong 1 giờ, bảo quản trong bình hút ẩm

Chấm sắc ký bằng máy chấm sắc ký CAMAG LINOMAT 5

Hiện vết ở các bước sóng 254nm và 366nm, phun thuốc thử hiện màu Vanilin 1%/ H2SO4

Chụp ảnh sắc ký và phân tích sắc ký đồ

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 NGHIÊN CỨU VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA HAI LOÀI NƯA

3.1.1 Mô tả về đặc điểm hình thái của hai loài Nưa

Mẫu N 2: Cây cỏ cao 1-1,5m, sống hàng năm có thân củ Củ hình cầu có mặt trên lõm mặt dưới lồi, xung quanh có nhiều rễ con, trên thân củ có nhiều nốt sần như củ khoai tây Lá mọc từ thân củ Cuống lá hơi sần có nhiều đốm trắng trên nền xanh nhạt Phiến lá có màu xanh nhạt, chẻ thùy 3, thùy xẻ lông chim nhiều lần Cụm hoa mọc từ củ, cụm hoa mo màu đỏ xanh có đốm trắng, mặt trong đỏ thẫm, bao lấy một bông mo là một phần mang phần hoa cái ở dưới phần hoa đực ở trên Quả mọng hình bầu dục, màu vàng cam

Dược liệu là thân củ, có đường kính 20cm, màu nâu nhạt, củ non có thịt trắng,

củ già có thịt màu trắng vàng Củ gây ngứa nhẹ, ăn không ngứa chỉ hơi tê đầu lưỡi Hình ảnh đặc điểm hình thái của mẫu N2 được trình bày ở các hình 3.1.1, 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 (tr.19)

Mẫu N 6: Cây cỏ cao 50-70cm, sống hàng năm có thân củ một phần nổi lên trên mặt đất Củ dài, chia thành từng đốt, màu nâu đến đen, đường kính của mặt cắt ngang củ khoảng 3-6cm Lá mọc từ thân củ Cuống lá nhẵn Cuống và phiến lá có màu xanh đậm Phiến lá chẻ thùy 3, thùy xẻ lông chim nhiều lần Cụm hoa mọc từ

củ, cụm hoa mo màu trắng xanh Quả mọng màu xanh

Dược liệu là thân củ dài, khi cắt bề mặt các lát cắt nhớt, màu nâu vàng chia thành từng khúc hình cầu Củ non có thịt màu trắng xám, củ già có thịt màu trắng vàng Củ gây ngứa nhẹ

Hình ảnh đặc điểm hình thái của mẫu N6 được trình bày ở các hình 3.2.1, 3.2.2, 3.2.3, 3.2.4 (tr.20)

Nhận xét: Sau khi quan sát các đặc điểm thực vật của 2 mẫu Nưa ta có thể sơ

bộ phân biệt được các đặc điểm thực vật của 2 mẫu Nưa dựa vào các đặc điểm được trình bày ở bảng 3.1 (tr 18)

Sau khi phân tích các đặc điểm hình thái của các bộ phận của hai loài Nưa mẫu N2

và N6, căn cứ vào các tài liệu hiện có tại trường Đại học Dược Hà Nội, cùng với sự

tư vấn của TS Nguyễn Quốc Huy, chúng tôi đã xác định tên khoa học của 2 mẫu nghiên cứu như sau:

Mẫu N2: Amorphophallus paeoniifolius (Dennst.) Nicolson, họ Ráy (Araceae)

Mẫu N6: Amorphophallus coaetaneus S Y Liu & S J Wei, họ Ráy (Araceae)

3.1.2 Nghiên cứu vi học bột của hai loài Nƣa

Tiến hành:

Sấy khô dược liệu ở nhiệt độ 60, nghiền bằng thuyền tán và chày cối sứ thành bột Rây bột qua rây 180 µm Dùng kim mũi mác lấy bột dược liệu cho lên phiến kính đã nhỏ sẵn một giọt nước cất, đặt lamen lên và quan sát trên kính hiển vi Chọn các đặc điểm đặc trưng để chụp ảnh Các đặc điểm được tập hợp thành nhóm theo

độ phóng đại

Kết quả và nhận xét:

Mẫu N 2:

- Đặc điểm bột: Bột màu trắng hơi nâu, không mùi, không vị

- Soi trên kính hiển vi thấy các đặc điểm sau:

Tinh bột xếp riêng lẻ hay thành đám Có tinh bột đơn và tinh bột kép bội Tinh bột có nhiều hình dạng (hình tròn, hình đa giác…) kích thước từ 0,008mm đến 0,024mm (8), (9), (10) Mảnh mô mềm có thành mỏng chứa tinh bột và tinh thể canxi oxalat (1), (2) Có 2 loại tinh thể canxi oxalat hình kim đứng riêng rẽ hoặc thành đám Loại 1 có kích thước 0,148mm (4) Loại 2 có kích thước 0,048mm (5)

Có nhiều mảnh mạch (5), (6), (7) (hình 3.3 tr.21)

Mẫu N 6 :

- Đặc điểm bột: Bột màu xám đen, không mùi, không vị

- Soi trên kính hiển vi thấy có các đặc điểm sau:

Tinh bột xếp riêng lẻ hay thành đám, có dạng kép bội Tinh bột đơn có kích thước từ 0,004mm đến 0,006mm (9), (10) Mảnh mô mềm có thành mỏng chứa tinh bột và tinh thể canxi oxalat (1), (2) Có hai loại tinh thể canxi oxalat hình kim đứng riêng rẽ hoặc thành đám Loại 1 có kích thước 0,328mm (6) Loại 2 có kích thước

0,036mm (8) Tinh thể canxi oxalat hình cầu gai có kích thước 0,024 mm (7) Và có nhiều mảnh mạch (3), (4), (5) (hình 3.4 tr.21)

Nhận xét:

Khi quan sát hai bột trên kính hiển vi, ta cơ bản phân biệt được 2 bột dựa vào các đặc điể m được thống kê trong bảng 3.2 (tr.18)

Bảng 3.1 Sự khác nhau về đặc điểm hình thái của hai loài Nƣa

Cuống lá Hơi sần, có nhiều đốm trắng Xanh nhẵn

Hoa Bông mo màu đỏ thẫm, lá mo

xòe ngang

Bông mo màu trắng xanh,

lá mo ôm lấy trục hoa

Bàng 3.2 Sự khác nhau về đặc điểm vi học bột của hai loài Nƣa

Cảm quan Bột có màu trắng nâu Bột có màu xám đen

Tinh bột

Có nhiều hình dạng (hình tròn, hình đa giác, tinh bột kép đôi, kép ba và kép nhiều lần…) và

có kích thước lớn hơn

Có hình đa giác, ít tinh bột đơn, thường là tinh bột kép và có kích thước nhỏ hơn

Tinh thể

canxi oxalate

Có 2 loại tinh thể canxi oxalate hình kim Loại 1 có kích thước 0,148mm Loại 2

có kích thước 0,048mm

Có 3 loại tinh thể canxi oxalat gồm 2 loại hình kim Loại 1 có kích thước 0,328mm Loại 2 có kích thước 0,036mm Tinh thể canxi oxalat hình cầu gai có kích thước 0,024 mm

Mẫu

Mẫu

Chú thích: H 3.1.1: Cây Nưa mẫu N2 H 3.1.2: Củ Nưa mẫu N2

H 3.1.3: Cụm hoa Nưa mẫu N2 H 3.1.4: Cụm quả Nưa mẫu N2

H 3.1.1 H 3.1.2

H 3.1.4

H 3.1.3

Chú thích: H 3.2.1: Cây Nưa mẫu N6 H 3.2.2: Củ Nưa mẫu N6

H 3.2.3: Cụm hoa Nưa mẫu N6 H 3.2.4: Cụm quả Nưa mẫu N6

H 3.2.1 H 3.2.2

H 3.2.3 H 3.2.4