Cân 5g bột củ Nưa cho vào bình nón dung tích 250ml. Thêm 100ml ethanol 25% rồi ngâm trong 24 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100ml. Thêm vài ml chì acetat 30%, khuấy đều. Để lắng, lọc dịch vào một cốc có mỏ dung tích 100ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm tiếp chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat.
Chuyển dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100ml. Lắc dịch chiết với hỗn hợp cloroform – ethanol (4:1), lắc 2 lần, mỗi lần 8ml. Gạn lớp dịch chiết cloroform trong ethanol vào một cốc có mỏ đã được sấy khô. Gộp các dịch chiết cloroform và loại nước bằng natri sulfat khan.
Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô. Đem cô cách thủy đến khô. Cắn thu được đem tiến hành làm các phản ứng định tính.
Phản ứng của khung steroid: Phản ứng Liebermann – Burchardt
Tiến hành:
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 450. Thêm từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Kết quả:
Mẫu N2: Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ (phản ứng dương tính).
Mẫu N6: Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ (phản ứng dương tính).
Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh - Phản ứng Baljet
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%). So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim.
Kết quả:
Mẫu N2: Ống thử có màu đỏ cam không đậm hơn ống chứng (phản ứng âm tính).
Mẫu N6: Ống thử có màu đỏ cam không đậm hơn ống chứng (phản ứng âm tính).
- Phản ứng Legal
Tiến hành:
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều sẽ xuất hiện màu đỏ cam. So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim.
Kết quả:
Mẫu N2: Ống thử có màu đỏ cam không đậm hơn ống chứng (phản ứng âm tính).
Mẫu N6: Ống thử có màu đỏ cam không đậm hơn ống chứng (phản ứng âm tính).
- Phản ứng của phần đường 2,6 – desoxy: Phản ứng Keller – Kiliani
Tiến hành:
Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Kết quả:
Mẫu N2: Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu đỏ tím (phản ứng dương tính).
Mẫu N6: Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu đỏ tím (phản ứng dương tính).
3.2.2. Định tính saponin trong dƣợc liệu
Quan sát hiện tượng tạo bọt
Tiến hành:
Cho 1g bột củ Nưa vào ống nghiệm lớn. Thêm 10ml nước. Lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 5 phút. Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt.
Kết quả: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu N2: Cột bọt bền sau khi ngừng lắc 45 phút (phản ứng dương tính).
Mẫu N6: Cột bọt bền sau khi ngừng lắc 45 phút (phản ứng dương tính). Phản ứng phân biệt saponin steroid và saponin triterpenoid
Tiến hành:
Cho 1g bột củ Nưa vào ống nghiệm lớn (10ml). Thêm 5ml cồn đun sôi cách thủy trong 15 phút, lọc lấy dịch chiết. Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0,1N (pH=1) và ống thứ hai 5ml NaOH 0,1N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dung dịch dịch chiết rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 15 giây. Để yên nếu cột bọt trong 2 ống cao bằng nhau và bền như nhau thì sơ bộ xác định dược liệu có saponin triterpenoid. Nếu ống kiềm có cột bọt cao hơn ống kia thì sơ bộ xác định là saponin steroid.
Kết quả:
Mẫu N2: Ống kiềm có cột bọt cao và bền hơn ống acid.
Mẫu N6: Ống kiềm có cột bọt cao và bền hơn ống acid.
Kết luận sơ bộ: Trong củ của hai loài Nưa đều có chứa saponin steroid.
3.2.3. Định tính anthranoid
Phản ứng Borntraeger
- Định tính anthranoid dạng tự do
Tiến hành:
Cho 2g bột củ Nưa vào ống nghiệm lớn (10ml). Thêm 5ml nước cất. Đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi. Lọc dịch chiết còn nóng qua một lớp bông mỏng vào bình gạn dung tích 50ml. Để nguội dịch lọc. Thêm 5ml cloroform. Lắc nhẹ.
Gạn bỏ lớp nước. Giữ lớp cloroform để làm phản ứng.Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ.
Kết quả:
Mẫu N2: Lớp nước không có màu đỏ sim (phản ứng âm tính).
Mẫu N6: Lớp nước không có màu đỏ sim (phản ứng âm tính).
- Định tính anthranoid dạng toàn phần
Tiến hành:
Cho 2g bột củ Nưa vào ống nghiệm lớn. Thêm 5ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Tiếp tục lọc và chiết như ở trên. Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Phản ứng dương tính nếu lớp nước có màu đỏ sim.
Kết quả:
Mẫu N2: Lớp nước không có màu đỏ sim (phản ứng âm tính).
Mẫu N6: Lớp nước không có màu đỏ sim (phản ứng âm tính). Vi thăng hoa
Tiến hành:
Trải bột dược liệu thành lớp mỏng trong một nắp chai bằng nhôm, đốt nhẹ trên đèn cồn để loại nước. Sau đó đậy lên nắp nhôm một miếng lam kính, bên trên có miếng bông đã thấm nước, tiếp tục đun nóng trong khoảng 5-10 phút. Lấy lam kính ra để nguội, soi kính hiển vi. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tinh thể trên lam kính.
Kết quả:
Mẫu N2: Không xuất hiện tinh thể trên lam kính (phản ứng âm tính).
Mẫu N6: Không xuất hiện tinh thể trên lam kính (phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: Trong củ của hai loài Nưa không chứa anthranoid.
3.2.4. Định tính tanin (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành: Cho 2g bột củ Nưa vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất. Đun sôi trực tiếp 5 phút. Lọc qua giấy lọc gấp nếp. Lấy dịch lọc chia làm 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml, đem làm các phản ứng định tính.
Ống 1: Thêm vào 1 giọt dung dịch gelatin 1% mới pha.
Kết quả:
Mẫu N2: Ống nghiệm không xuất hiện kết tủa bông trắng (phản ứng âm tính).
Mẫu N6: Ống nghiệm không xuất hiện kết tủa bông trắng (phản ứng âm tính). Phản ứng với ion kim loại nặng
Thêm vào vài giọt FeCl3 5%.
Kết quả:
Mẫu N2: Ống nghiệm không xuất hiện kết tủa xanh đen (phản ứng âm tính).
Mẫu N6: Ống nghiệm không xuất hiện kết tủa xanh đen (phản ứng âm tính).
Ống 3: Thêm vào vài giọt chì acetat 10%.
Kết quả:
Mẫu N2: Ống nghiệm xuất hiện kết tủa bông (phản ứng dương tính).
Mẫu N6: Ống nghiệm xuất hiện kết tủa bông (phản ứng dương tính).
Kết luận sơ bộ:Trong củ của hai loài Nưa không chứa tanin.
3.2.5. Định tính đƣờng khử
Tiến hành:
Cân khoảng 2g bột củ Nưa cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất, đun sôi vài phút. Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác. Thêm 1ml dung dịch thuốc thử Felling A và 1ml dung dịch Felling B. Đun cách thủy sôi vài phút.
Kết quả:
Mẫu N2: Ống nghiệm xuất hiện kết tủa đỏ gạch (phản ứng dương tính).
Mẫu N6: Ống nghiệm xuất hiện kết tủa đỏ gạch (phản ứng dương tính).
Kết luận sơ bộ: Trong củ của hai loài Nưa có chứa đường khử
3.2.6. Định tính polysaccharid
Tiến hành: Lấy 2g bột củ Nưa cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất. Đun sôi cách thủy vài phút. Lọc lấy dịch. Cho vào 3 ống nghiệm:
Ống 1: 4ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol. Ống 2: 4ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol. Ống 3: 4ml dịch chiết.
Kết quả:
Mẫu N2: Màu của ống 1 đậm hơn màu ống 2, màu ống 2 đậm hơn ống 3 (phản ứng dương tính).
Mẫu N6: Màu của ống 1 đậm hơn màu ống 2, màu ống 2 đậm hơn ống 3 (phản ứng dương tính).
Kết luận sơ bộ: Trong củ của hai loài Nưa có chứa polysaccharid.
3.2.7. Định tính acid amin
Tiến hành: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lấy 2g bột củ Nưa cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất, đun sôi vài phút. Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác. Thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 3%. Đun cách thủy sôi vài phút.
Kết quả:
Mẫu N2: Ống nghiệm xuất hiện màu xanh (phản ứng dương tính).
Mẫu N6: Ống nghiệm xuất hiện màu xanh tím (phản ứng dương tính).
Kết luận sơ bộ:Trong củ của hai loài Nưa có acid amin.
3.2.8. Định tính acid hữu cơ
Tiến hành:
Cho 2g bột củ Nưa vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất. Đun sôi trực tiếp vài phút trên ngọn lửa đèn cồn. Để nguội và lọc. Thêm vào dịch lọc một ít bột Na2CO3.
Kết quả:
Mẫu 1: Ống nghiệm xuất hiện bọt khí CO2 bay lên (phản ứng dương tính).
Mẫu 2: Ống nghiệm xuất hiện bọt khí CO2 bay lên (phản ứng dương tính).
Kết luận sơ bộ: Trong củ của hai loài Nưa có chứa acid hữu cơ.
3.2.9. Định tính flavonoid
Lấy 2g bột củ Nưa cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 20ml ethanol 90%. Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch chiết đem tiến hành các phản ứng định tính.
Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda)
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt). Để yên một vài phút.
Kết quả:
Mẫu N2: Dung dịch không chuyển từ màu vàng sang màu đỏ (phản ứng âm tính).
Mẫu N6: Dung dịch không chuyển từ màu vàng sang màu đỏ (phản ứng âm tính). Phản ứng với kiềm
Tiến hành:
Bước 1: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% sau đó thêm 1ml nước cất.
Kết quả: Mẫu N2: Không xuất hiện tủa vàng.
Mẫu N6: Không xuất hiện tủa vàng.
Bước 2: Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút. Nhỏ một giọt khác lên giấy lọc để so sánh.
Kết quả:
Mẫu N2: Màu vàng của vết dịch chiết không tăng lên (phản ứng âm tính).
Mẫu N6: Màu vàng của vết dịch chiết không tăng lên (phản ứng âm tính). Phản ứng với FeCl3
Tiến hành:
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%.
Kết quả: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu N2: Không xuất hiện kết tủa xanh đậm (phản ứng âm tính).
Mẫu N6: Không xuất hiện kết tủa xanh đậm (phản ứng âm tính). Phản ứng diazo hóa
Tiến hành:
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (dung dịch NaOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha,
lắc đều, đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút.
Kết quả:
Mẫu N6: Không xuất hiện màu đỏ (phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ:Trong củ của hai loài Nưa không chứa flavonoid.
3.2.10. Định tính coumarin
Lấy 2g bột củ Nưa rồi cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 20ml ethanol 90%. Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch chiết đem tiến hành các phản ứng định tính.
Phản ứng mở đóng vòng lacton
Tiến hành:
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết: Ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Ống 2 để nguyên.
Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi. Để nguội rồi quan sát: Ống 1 có tủa vàng.
Ống 2 trong.
Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều rồi quan sát: Ống 1 trong.
Ống 2 đục.
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, quan sát: Ống 1 đục.
Ống 2 trong. (phản ứng âm tính). Phản ứng diazo hóa
Tiến hành:
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vào 2ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội. Nhỏ vào giọt thuốc thử diazo.
Kết quả:
Mẫu N2: Không xuất hiện màu đỏ (phản ứng âm tính).
Mẫu N6: Không xuất hiện màu đỏ (phản ứng âm tính).
Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm (phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans dưới tác dụng của tia tử ngoại)
Tiến hành:
Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm. Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5%. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại (chìa khóa, đồng xu…) rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại.
Kết quả:
Mẫu N2: Phần không bị che có huỳnh quang không sáng hơn phần bị che (phản ứng âm tính).
Mẫu N6: Phần không bị che có huỳnh quang không sáng hơn phần bị che (phản ứng âm tính). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết luận sơ bộ: Trong củ của hai loài Nưa không chứa coumarin.
3.2.11. Định tính alcaloid
Tiến hành:
Cân 5g bột củ Nưa, cho vào bình nón dung tích 50ml, thấm ẩm bằng dung dịch ammoniac đặc. Đậy kín để khoảng 30 phút. Cho 15ml chloroform lắc đều trong 1h. Lọc lấy dịch chiết cho vào bình gạn. Sau đó lắc kỹ 2 lần, mỗi lần với 10ml dung dịch H2SO4 1N. Để phân lớp, gạn lấy dịch chiết acid, chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:
Ống 1: Thuốc thử Mayer.
Kết quả:
Mẫu N2: Không xuất hiện kết tủa trắng (phản ứng âm tính).
Mẫu N6: Không xuất hiện kết tủa trắng (phản ứng âm tính). Ống 2: thuốc thử Bouchardat.
Kết quả:
Mẫu N2: Không xuất hiện kết tủa nâu (phản ứng âm tính).
Mẫu N6: Không xuất hiện kết tủa nâu (phản ứng âm tính). Ống 3: Thuốc thử Dragendorff.
Mẫu N2: Không xuất hiện kết tủa đỏ cam (phản ứng âm tính).
Mẫu N6: Không xuất hiện kết tủa đỏ cam (phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: Trong củ của hai loài Nưa không chứa alcaloid.
3.2.12. Định tính chất béo, steroid, caroten
Tiến hành:
Lấy 5g bột củ Nưa vào bình nón dung tích 50ml, đổ ngập ether dầu hỏa, bọc kín, ngâm 24 giờ. Lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Chia dịch lọc làm 3 phần để định tính như sau:
Định tính chất béo
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên mảnh giấy trắng, sấy nhẹ cho bay hết hơi dung môi.
Kết quả:
Mẫu N2: Không để lại vết mờ trên giấy (phản ứng âm tính).
Mẫu N6: Không để lại vết mờ trên giấy (phản ứng âm tính). Định tính steroid
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, cô cách thủy đến cắn. Thêm vào ống nghiệm khoảng 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn. Để nghiêng ống nghiệm 450, thêm từ từ H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm.
Kết quả:
Mẫu N2: Mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá (Phản ứng dương tính).
Mẫu N6: Mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá (Phản ứng dương tính).
Định tính caroten
Tiến hành:
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, cô cách thủy đến cắn, nhỏ vài giọt H2SO4 đặc vào cắn.
Kết quả: Mẫu N2: Không xuất hiện màu xanh lá (phản ứng âm tính). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu N6: Không xuất hiện màu xanh lá (phản ứng âm tính).
Bảng 3.3. Kết quả định tính các nhóm chất trong củ của hai loài Nƣa
STT Nhóm chất Phản ứng với thuốc thử
Kết quả Kết luận
Mẫu N2 Mẫu N6 Mẫu N2 Mẫu N6
1 Glycosid P/ư Liebermann + + Không có Không có P/ư Legal _ _ P/ư Baljet _ _ P/ư Keller-Kiliani + +
2 Saponin Hiện tượng tạo bọt + + Có Có
3 Anthranoid
Vi thăng hoa _ _ Không
có Không có P/ư Borntraeger _ _ 4 Flavonoid P/ư Cyanidin _ _ Không có Không có
P/ư với dd NaOH _ _
Hơi NH3 _ _ dd FeCl3 5% _ _ 5 Coumarin P/ư mở vòng lacton _ _ Không có Không có
P/ư diazo hóa _ +
P/ư di chuyển dạng đồng phân cis-trans _ _ 6 Tanin Chì acetat + + Không có Không có FeCl3 _ _ dd Gelantin 1% _ _ 7 Alcaloid TT Mayer _ _ Không có không có TT Bouchardat _ _ TT Dragendoff _ _
8 Acid hữu cơ P/ư với bột Na2CO3 + + Có Có
10 Acid amin TT Ninhydrin 0,1% + + Có Có 11 Polysaccharid TT Lugol + + Có Có 12 Caroten TT H2SO4 đậm đặc _ _ Không có Không có
13 Sterol P/ư Liebermann + + Có Có