Nghiên cứu định lượng flavonoid và polysaccharid trong cây ô đầu (a carmichaeli debx ) trồng ở tỉnh hà giang

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU ÐỊNH LƯỢNG FLAVONOID VÀ POLYSACCHARID TRONG CÂY Ô ÐẦU (A. carmichaeli Debx.) TRỒNG Ở TỈNH HÀ GIANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU ÐỊNH LƯỢNG FLAVONOID VÀ POLYSACCHARID TRONG CÂY Ô ÐẦU (A.carmichaeli Debx.) TRỒNG Ở TỈNH HÀ GIANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Nguyễn Tiến Vững 2. ThS. Đỗ Thị Thanh Thủy Nơi thực hiện: 1. Bộ môn hóa dược 2. Khoa Y Dược, ĐHQGHN HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Tiến Vững - Phó Viện trưởng Viện Pháp y Quốc gia và ThS. Đỗ Thị Thanh Thủy - Giảng viên bộ môn Hóa Dược, đã hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS.Vũ Đức Lợi – Giảng viên Khoa Y Dược Đại học Quốc gia Hà Nội, các anh chị kĩ thuật viên bộ môn Hóa Dược Trường Đại học Dược Hà Nội và khoa Y dược Trường Đại học Quốc gia Hà Nội, đã giúp đỡ em trong suốt quá trình làm thực nghiệm. Xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các phòng ban đã tạo mọi điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận. Cảm ơn các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm dìu dắt và truyền thụ kiến thức cho em trong 5 năm học vừa qua. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên và khích lệ em trong quá trình học tập và làm khóa luận. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Nhung MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về cây Ô Đầu 2 1.1.1. Đặc điểm thực vật 2 1.1.2. Phân bố và trồng hái 3 1.1.3. Bộ phận dùng 3 1.1.4. Thành phần hóa học 3 1.2. Tổng quan về Flavonoid 4 1.2.1. Định nghĩa, cấu trúc và phân loại 4 1.2.2. Tính chất 4 1.2.3. Các phương pháp định lượng flavonoid trong dược liệu 5 1.3. Tổng quan về polysaccharid 7 1.3.1. Định nghĩa, cấu trúc và phân loại 7 1.3.2. Tính chất 7 1.3.3. Phương pháp định lượng polysaccharid trong dược liệu 8 1.4. Tổng quan về phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) …… 9 1.4.1. Nguyên tắc 9 1.4.2. Các kỹ thuật định lượng bằng phương pháp đo quang 11 1.5. Thẩm định phương pháp phân tích 13 1.5.1. Độ đặc hiệu 13 1.5.2. Độ tuyến tính 13 1.5.3. Độ lặp lại 13 1.5.4. Độ đúng 14 1.5.5. Giới hạn phát hiện (LOD) 14 1.5.6. Giới hạn định lượng (LOQ) 15 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 16 2.1.1. Nguyên vật liệu 16 2.1.2. Dụng cụ thiết bị 16 2.2. Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp đo quang để định lượng flavonoid toàn phần trong lá cây Ô đầu 17 2.2.2. Xây dựng và thẩm định phương pháp đo quang để định lượng polysaccharid toàn phần trong phụ tử 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Xây dựng phương pháp phân tích 18 2.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích 18 2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu 19 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 20 3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Flavonoid toàn phần trong lá Ô Đầu 20 3.1.1. Xây dựng phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong lá Ô Đầu ….…… 20 3.1.2. Thẩm định phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong lá Ô đầu …………… 22 3.1.3. Ứng dụng phương pháp định lượng đã xây dựng và thẩm định để định lượng flavonoid toàn phần trong mẫu lá Ô đầu Hà Giang 27 3.2. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Polysaccharid toàn phần trong phụ tử 28 3.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng polysaccharid toàn phần trong phụ tử…………. 28 3.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng polysaccharid toàn phần trong phụ tử…………… 30 3.2.3. Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để xác định hàm lượng polysaccharid toàn phần trong mẫu phụ tử Hà Giang 35 BÀN LUẬN 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 A. KẾT LUẬN 38 B. KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT EtOH: Ethanol MeOH: Methanol 2,4-DNP: 2,4- dinitrophenylhydrazin UV-VIS: Ultraviolet-Visible (Tử ngoại-khả kiến) HPLC: High Performance Liquid Chromatography ( Sắc kí lỏng hiệu năng cao) PA: Pure Analysis ( Tinh khiết phân tích) PTN: Phòng thí nghiệm LOD: Limit of detection (giới hạn phát hiện) LOQ: Limit of quanlity (giới hạn định lượng) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số nghiên cứu định lượng flavonoid toàn phần trong dược liệu bằng phương pháp đo quang 6 Bảng 1.2. Một số nghiên cứu định lượng polysaccharid toàn phần trong dược liệu bằng phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử phenol-acid sulfuric 8 Bảng 3.1. Cách pha dãy chuẩn quercetin để đo quang 21 Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ của dung dịch chuẩn quercetin 24 Bảng 3.3 : Kết quả độ lặp lại của phương pháp định lượng flavonoid toàn phần 25 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng flavonoid toàn phần 26 Bảng 3.5. Kết quả xác định độ lệch chuẩn của mẫu trắng khi định lượng flavonoid toàn phần 26 Bảng 3.6. Kết quả xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong mẫu lá Ô đầu Hà Giang 27 Bảng 3.7. Cách pha dãy chuẩn glucose để đo quang 29 Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ của dung dịch chuẩn glucose 32 Bảng 3.9. Kết quả độ lặp lại của phương pháp định lượng polysaccharid toàn phần 33 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng polysaccharid toàn phần 34 Bảng 3.11. Kết quả xác định độ lệch chuẩn của mẫu trắng khi định lượng polysaccharid toàn phần 35 Bảng 3.12. Kết quả xác định hàm lượng polysaccharid toàn phần trong mẫu Phụ tử Hà Giang 36 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Tiêu bản cây Ô đầu 2 Hình 1.2. Cành mang hoa, quả của cây Ô đầu 2 Hình 1.3. Rễ củ ô đầu, phụ tử 3 Hình 1.4. Lá của cây Ô đầu 3 Hình 3.1. Phổ hấp thụ của mẫu trắng, mẫu chuẩn quercetin và mẫu thử 23 Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của độ hấp thụ và nồng độ quercetin. 24 Hình 3.3. Phổ hấp thụ của mẫu trắng, mẫu chuẩn glucose và mẫu thử 31 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của độ hấp thụ và nồng độ glucose….33 1 ÐẶT VẤN ÐỀ Cây Ô đầu (Aconitum sp.) là một loại cây thuốc quý được sử lâu đời trong y học cổ truyền dân tộc với tên vị thuốc là Ô đầu (Radix aconiti) và phụ tử hay củ con của cây Ô đầu (Radix aconiti lateralis). Ô đầu, phụ tử chưa chế biến chủ yếu dùng ngoài để xoa bóp khi nhức đầu, mỏi tay chân, đau khớp, bong gân; phụ tử chế (diêm phụ, bạch phụ, hắc phụ) y học cổ truyền coi là một vị thuốc hồi dương khử phong hàn, dùng trong một số triệu chứng nguy cấp (trụy tim mạch, ra nhiều mồ hôi, chân tay giá lạnh…) [3]. Cây Ô đầu Việt Nam (Aconitum carmichaeli) mọc hoang và được trồng ở các vùng núi cao như Hà Giang, Lào Cai, Sa Pa [10], [11]. Trong cây Ô đầu hoạt chất chính và có tác dụng dược lý mạnh nhất là alcaloid đã được ứng dụng nhiều trong y học cổ truyền. Ngày nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật đã và đang có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng sinh học của các thành phần khác trong cây Ô đầu để ứng dụng trong y học như: flavonoid trong lá và polysaccharid trong rễ củ cây Ô đầu. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy thành phần flavonoid trong lá Ô đầu có tác dụng chống oxy hóa và khả năng dọn dẹp gốc tự do [24], [27], [35], [37]. Polysacharaid trong rễ củ ô đầu có tác dụng: chống oxy hóa, tăng khả năng miễn dịch, có hoạt động kháng u tốt, giảm cholesterol máu…cho kết quả khả quan [25], [28], [34], [40], [41], [42]. Song song với việc nghiên cứu về tác dụng sinh học của các thành phần trong dược liệu thì việc nghiên cứu xây dựng các phương pháp định lượng các thành phần này cũng rất cần thiết cho công tác kiểm tra chất lượng dược liệu. Tuy nhiên trong Dược điển Việt Nam chưa có các phương pháp định lượng hai thành phần flavonoid và polysaccharid trong cây ô đầu. Xuất phát từ các yêu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài "Nghiên cứu định lượng flavonoid và polysaccharid trong cây Ô đầu (Aconitum carmichaeli Debx.) trồng ở tỉnh Hà Giang" với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp đo quang để định lượng flavonoid toàn phần trong lá cây Ô đầu. 2. Xây dựng và thẩm định phương pháp đo quang để định lượng polysaccharid toàn phần trong phụ tử [...]... dụng phương pháp định lượng đã xây dựng và thẩm định để định lượng flavonoid toàn phần trong mẫu lá Ô đầu Hà Giang Tiến hành định lượng 6 mẫu mẫu lá Ô đầu Hà Giang cách tiến hành chuẩn bị dung dịch thử đã trình bày ở mục 3.1.1.1 và mục 3.1.1.3., tiến hành đo quang và tính toán kết quả theo công thức đã trình bày ở mục 3.1.1.5 Kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần trong mẫu lá Ô đầu Hà Giang tính theo... 1000µl (±5µl) Hirschman - Đức - Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, cốc có mỏ,… 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp đo quang để định lượng flavonoid toàn phần trong lá cây Ô đầu 2.2.1.1 Xây dựng quy trình định lượng flavonoid toàn phần trong lá cây Ô đầu - Quy trình chiết: Chiết flavonoid toàn phần từ lá cây Ô đầu để tiến hành định lượng - Lựa chọn dung môi pha... của cây Ô đầu 3 Hình 1.3 Rễ củ ô đầu, phụ tử Hình 1.4 Lá của cây Ô đầu 1.1.2 Phân bố và trồng hái Ô đầu là cây của vùng ôn đới ẩm Cây trồng ở Việt Nam thích nghi cao với điều kiện khí hậu ẩm mát của vùng nhiệt đới núi cao như Sa Pa, Bắc Hà, Sìn Hồ, Đồng Văn, Quảng Bạ… Cây ưa sáng, khi còn nhỏ là cây chịu bóng [8], [9], [15] Ô đầu được trồng bằng hạt hoặc củ con Người ta thường thu hoạch khi cây trồng. .. cây là quercetin và kaempfrol [1] Qua các nghiên cứu xác định thành phần flavonoid trong lá cây Ô đầu cho thấy flavonoid trong lá Ô đầu thuộc nhóm flavonol và là các quercetin hoặc kaempfrol [24], [27], [35], [37] Quercetin được dùng làm chất chuẩn phổ biến trong nghiên cứu định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp đo quang [14], [20], [30], [31] Vì vậy trong khóa luận này chúng tôi lựa chọn quercetin... sát và lựa chọn bước sóng phù hợp để định lượng flavonoid toàn phần trong lá ô đầu - Khảo sát và lựa chọn nồng độ định lượng thích hợp 2.2.1.2 Thấm định phương pháp đo quang để định lượng flavonoid toàn phần trong lá cây Ô đầu - Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng với các chỉ tiêu: + Độ đặc hiệu + Độ tuyến tính + Độ lặp lại + Độ đúng + Giới hạn phát hiện (LOD) + Giới hạn định lượng (LOQ) 2.2.2... thử Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong mẫu dược liệu theo công thức sau: F ( %)  Cx  10  6  50  10  10  100 1   100( %) 100  h m Trong đó: F: là hàm lượng flavonoid toàn phần có trong lá cây Ô đầu ( %) Cx : là nồng độ flavonoid toàn phần trong dung dịch thử tính theo quercetin (Giá trị này được phần mềm trong máy quang phổ UV- VIS Cary 60 tính ra dựa vào đường chuẩn quercetin và độ hấp... tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại cho pic trên sắc ký đồ - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có thể ứng dụng định lượng flavonoid trong dược liệu cho kết quả tin cậy và độ chính xác cao Tuy nhiên chỉ định lượng được một vài chất cụ thể, không xác định hàm lượng toàn phần được Ví dụ : Định lượng flavonoid (baicalein) trong vỏ cây núc nác (Oroxylum indicum) bằng... thử ) (µg/ml) h: là độ ẩm của dược liệu(Độ ẩm lá Ô đầu xác định trên cân hàm ẩm là: 7,8 %) m: là khối lượng mẫu ban đầu (g) 50×10×10: là độ pha loãng 3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng flavonoid toàn phần trong lá Ô đầu 3.1.2.1 Độ đặc hiệu Tiến hành quét phổ của dung dịch mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn quercetin trong khoảng bước sóng từ 200-800nm , kết quả phổ hấp thụ của 3 mẫu được thể hiện ở hình... hay sấy khô Nếu cần thu lấy hạt thì đợi khi thu hạt xong tiếp tục chăm sóc để thu củ vào mùa hoa năm sau Ở nước ta thu hái vào khoảng tháng 9, tháng 10 khi cây đang ra hoa Trồng vào tháng 1, tháng 2 [3], [8], [18] 1.1.3 Bộ phận dùng Bộ phận dùng của cây Ô đầu là rễ củ [2], [8] : - Ô đầu là rễ củ mẹ của cây Ô đầu phơi hay sấy khô - Phụ tử là củ nhánh (củ con) của cây Ô đầu Từ phụ tử có thể chế thành diêm... bày ở bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết quả xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong mẫu lá Ô đầu Hà Giang Lượng mẫu Độ ẩm Độ hấp Hàm lượng flavonoid Tính thống (g) TT ( %) thụ (Abs) toàn phần tính theo kê quercetin ( %) 1 2,0245 7,8 0,238 1,64 2 2,1307 7,8 0,244 1,59 SD= 0,02 3 2,1038 7,8 0,248 1,63 RSD=1,14% 4 2,0826 7,8 0,245 1,63 5 2,0659 7,8 0,242 1,63 6 2,1035 7,8 0,249 1,63 X = 1,62 % Nhận xét: Hàm lượng . thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài " ;Nghiên cứu định lượng flavonoid và polysaccharid trong cây Ô đầu (Aconitum carmichaeli Debx. ) trồng ở tỉnh Hà Giang& quot; với các mục. HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU ÐỊNH LƯỢNG FLAVONOID VÀ POLYSACCHARID TRONG CÂY Ô ÐẦU (A. carmichaeli Debx. ) TRỒNG Ở TỈNH HÀ GIANG. TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU ÐỊNH LƯỢNG FLAVONOID VÀ POLYSACCHARID TRONG CÂY Ô ÐẦU (A. carmichaeli Debx. ) TRỒNG Ở TỈNH HÀ GIANG KHÓA LUẬN TỐT