3.1.1.1. Chuẩn bị dung dịch thử gốc
Flavonoid toàn phần trong Ô đầu có thể chiết xuất bằng dung môi methanol [31] hoặc ethanol [35]. Để chiết flavonoid toàn phần từ dược liệu có các phương pháp sau: phương pháp ngâm, phương pháp siêu âm, chiết soxhlet… Trong đó phương pháp chiết bằng siêu âm chiết kiệt được flavonoid toàn phần trong dược liệu, rút ngắn thời gian chiết, cách tiến hành đơn giản [20], [32]. Qua tham khảo tài liệu và sau khi khảo sát sơ bộ chúng tôi lựa chọn chiết flavonoid toàn phần trong lá Ô đầu bằng phương pháp siêu âm sử dụng dung môi ethanol 96%.
Dung dịch thử gốc: Cân chính xác khoảng 2,0 g lá ô đầu đã xay nhỏ cho vào cốc có mỏ, thêm 20,0 ml ethanol 96%, đem siêu âm 30 phút, lọc lấy dịch. Phần dược liệu được chiết thêm 2 lần nữa, mỗi lần 12,0 ml ethanol 96%. Gộp dịch lọc, chuyển toàn bộ vào bình định mức 50,0ml, thêm ethanol 96% đến vạch, lắc đồng nhất được dung dịch thử . Từ dung dịch này hút chính xác 1,0 ml cho vào bình định mức 10,0 ml, thêm ethanol 96% đến vạch được dung dịch thử gốc.
3.1.1.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc
Nhóm flavonol là nhóm flavonoid thuộc nhóm lớn euflavonoid. Dẫn chất flavonol gặp rất phổ biến trong thực vật. Hai chất flavonol hay gặp nhất trong cây là quercetin và kaempfrol [1]. Qua các nghiên cứu xác định thành phần flavonoid trong lá cây Ô đầu cho thấy flavonoid trong lá Ô đầu thuộc nhóm flavonol và là các quercetin hoặc kaempfrol [24], [27], [35], [37]. Quercetin được dùng làm chất chuẩn phổ biến trong nghiên cứu định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp đo quang [14], [20], [30], [31]. Vì vậy trong khóa luận này chúng tôi lựa chọn quercetin là chất chuẩn để định lượng flavonoid toàn phần trong lá Ô đầu bằng phương pháp đo quang.
Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác khoảng 50,0 mg quercetin cho vào bình định mức dung tích 50,0 ml, hòa tan và thêm đến vạch bằng ethanol 96%. Thu được dung dịch quercetin chuẩn nồng độ 1mg/ml. Từ dung dịch này pha loãng bằng ethanol 96% thành dung dịch quercetin chuẩn gốc có nồng quercetin 100 µg/ml.
3.1.1.3. Chuẩn bị dung dịch để đo quang
- Chuẩn bị dung dịch thử: Lấy chính xác 1,0ml dung dịch thử gốc cho vào bình định mức dung tích 10,0 ml. Thêm vào bình 4ml nước cất; 0,3ml NaNO2 5%; 0,5 ml dung dịch AlCl3 5%/EtOH 96%; 2 ml NaOH 1M lắc đều. Sau khoảng 20 phút thêm nước cất vừa đủ 10ml lắc đều đem đi đo độ hấp thụ.
- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: pha 1 dãy dung dịch chuẩn quercetin có nồng độ biến thiên trong khoảng 5-50 µg/ml theo bảng 3.1.
Bảng 3.1. Cách pha dãy chuẩn quercetin để đo quang
Dung dịch chuẩn 1 2 3 4 5 6 Nồng độ quercetin (µg/ml) 5 10 20 30 40 50 Dung dịch gốc quercetin 100µg/ml (ml) 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 Nước cất (ml) 4,5 4 3 2 1 0 NaNO2 5% (ml) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 AlCl35%/EtOH96% (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 NaOH 1M (ml) 2 2 2 2 2 2
Lắc đều. Sau khoảng 20 phút thêm nước cất vừa đủ 10ml, lắc đều, đem đi đo độ hấp thụ.
- Chuẩn bị mẫu trắng: thay 1,0ml dung dịch thử bằng 1,0ml nước cất các bước còn lại tiến hành tương tự.
3.1.1.4. Tiến hành đo quang
- Quét phổ hấp thụ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn. Từ kết quả phổ hấp thụ xác định bước sóng định lượng là bước sóng cực đại. Thực nghiệm cho thấy cực đại ở bước sóng 425nm, lựa chọn bước sóng định lượng là 425nm.
- Tiến hành đo độ hấp thụ của dãy chuẩn tại bước sóng 425nm xây dựng đường chuẩn quercetin.
- Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch thử tại bước sóng 425nm, dựa vào phương trình đường chuẩn tính ra nồng độ của flavonoid toàn phần có trong mẫu tính theo quercetin.
3.1.1.5. Cách tính kết quả
Đo độ hấp thụ của dãy chuẩn từ đó xây dựng đường chuẩn quercetin. Do độ hấp thụ của dung dịch thử. Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong mẫu dược liệu theo công thức sau:
(%) 100 1 100 100 10 10 50 10 (%) 6 m h C F x Trong đó:
F: là hàm lượng flavonoid toàn phần có trong lá cây Ô đầu (%)
x
C : là nồng độ flavonoid toàn phần trong dung dịch thử tính theo quercetin (Giá trị này được phần mềm trong máy quang phổ UV- VIS Cary 60 tính ra dựa vào đường chuẩn quercetin và độ hấp thụ Axcủa mẫu thử ) (µg/ml)
h: là độ ẩm của dược liệu(Độ ẩm lá Ô đầu xác định trên cân hàm ẩm là: 7,8%)
m: là khối lượng mẫu ban đầu (g) 50×10×10: là độ pha loãng