Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của liposome doxorubicin

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ PHƯƠNG LINH NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN CHẤT LƯỢNG CỦA LIPOSOME DOXORUBICIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ PHƯƠNG LINH NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN CHẤT LƯỢNG CỦA LIPOSOME DOXORUBICIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 Người hướng dẫn : ThS.Nguyễn Văn Lâm Nơi thực hiện : Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội Lời cảm ơn Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới: ThS. Nguyễn Văn Lâm Thầy là người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Đồng thời em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Phạm Thị Minh Huệ người trực tiếp giao đề tài và chỉ bảo, định hướng cho em thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Bào chế trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng xin được cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn động viên, cổ vũ trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận của mình. Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013. Lê Phương Linh Danh mục chữ và ký hiệu viết tắt TT Viết tắt Từ/ cụm từ đầy đủ 1 Chol Cholesterol 2 CL Conventional liposome – Liposome quy ước 3 DĐVN Dược điển Việt Nam 4 D/L Drug / lipid- Tỷ lệ dược chất / lipid. 5 DLS Dynamic Light Scattering – Tán xạ ánh sáng động 6 DSC Differenciel Scanning Calometry- Phân tích nhiệt vi sai 7 DOX Doxorubicin 8 DSPC 1,2-Distearoyl-sn -Glycero-3-Phosphocholin 9 DSPE Distearoyl phosphatidyl ethanolamin 10 DSPE- PEG 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phospho ethanolamin-N-Methoxy Polyethylene glycol 11 EE Encapsulation Efficient - Hiệu suất liposome hóa 12 GUV Giant Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp khổng lồ 13 IL Immunoliposome - Liposome miễn dịch 14 HBG HEPES Buffer Glucose – HEPES pH 7,4 trong môi trường glucose 5% 15 HBS HEPES Buffer Saline – HEPES pH 7,4 trong môi trường NaCl 9% 16 HEPES N-2- hydroxy ethyl piperazin-N-2-ethan sulfonic acid 17 HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) 18 KTTP Kích thước tiểu phân 19 LCL Long circulation liposome- Liposome tuần hoàn dài 20 LUV Large Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp lớn 21 MLV Multi Lamellar Vesicle – Liposome đa lớp 22 MSPC Monostearoyl Phosphatidyl Choline 23 MUV Medium Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp trung bình 24 MVV Multi Vesicular Vesicle – Liposome đa khoang 25 NEFA Non-esterified Fatty Acid – Acid béo không ester hóa 26 OLV Oligo Lamellar Vesicle – Liposome đa lớp nhỏ 27 PB KTTP Phân bố kích thước tiểu phân 28 PDI Polydispersity Index – Chỉ số đa phân tán 29 PEG Polyethylen glycol 30 PL Phospholipid 31 P-31NMR Phosphorus-31 Nuclear magnetic resonance- Cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị P-31 32 SPC Soy phosphatidyl cholin - Phosphatidyl cholin dầu đậu nành 33 SUV Small Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp nhỏ 34 TCCS Tiêu chuẩn cơ sở 35 TEM Transmission Electron Microscopy – Hiển vi điện tử truyền qua Mục lục CHƯƠNG1: TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về Doxorubicin 2 1.1.1. Công thức cấu tạo, tính chất lí hóa 2 1.1.2. Dược lý -cơ chế tác dụng và chỉ định 2 1.1.3. Dược động học 3 1.1.4. Các dạng thuốc chứa doxorubicin trên thị trường 3 1.2. Đại cương về liposom 3 1.2.1. Khái niệm, phân loại, ứng dụng 3 1.2.2. Phương pháp bào chế 5 1.2.3. Các phương pháp gắn dược chất vào liposome 6 1.2.4. Một số chỉ tiêu chất lượng hỗn dịch liposome 7 1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng hỗn dịch liposome 7 1.2.5.1. Kích thước và cấu trúc 7 1.2.5.2. Thành phần lớp vỏ 8 1.2.5.3. Môi trường bên trong và bên ngoài liposome 12 1.2.6. Một số biện pháp tăng độ ổn định của liposome 13 1.2.7. Liposome doxorubicin 14 1.2.7.1. Ưu điểm so với dạng thông thường 14 1.2.7.2. Một số nghiên cứu gần đây về liposome DOX 14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu 17 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2 Nguyên vật liệu 17 2.1.3 Phương tiện nghiên cứu 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1. Phương pháp bào chế liposome doxorubicin 18 2.2.1.1. Bàochế liposome trắng chưa mang dược chất 18 2.2.1.2. Làm giảm kích thước tiểu phân 19 2.2.1.3.Tiến hành đổi hệ đệm bên ngoài liposome 19 2.2.1.4.Đưa DOX vào liposome 20 2.2.2. Phương pháp đánh giá cấu trúc và hình thái liposome 21 2.2.3. Phương pháp đánh giá kích thước và phân bố kích thước của liposome 22 2.2.4. Phương pháp định lượng 22 2.2.4.1. Xây dựng đường chuẩn bằng phương pháp đo quang UV-VIS 22 2.2.4.2. Định lượng dược chất toàn phần 22 2.2.4.3. Định lượng dược chất tự do 23 2.2.4.4. Hiệu suất liposome hóa 23 2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu 24 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1. Xây dựng đường chuẩn 25 3.2. Lựa chọn quy trình làm giảm KTTP liposome bằng phương pháp nén qua màng 26 3.3. Ảnh hưởng của phương pháp làm giảm KTTP 28 3.4. Ảnh hưởng của yếu tố công thức 33 3.4.1. Ảnh hưởng của loại muối đệm đến hiệu suất liposome hóa 35 3.4.1.1. Ảnh hưởng của muối đệm bên trong 35 3.4.1.2. Ảnh hưởng của muối đệm bên ngoài 36 3.4.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ dược chất lipid 37 3.5. Bàn luận 38 3.5.1. Về quy trình bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2 mg/ml 38 3.5.2. Về công thức bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2 mg/ml 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42 Danh mục bảng biểu Số hiệu Tên bảng biểu Trang Bảng 1.1 Phân loại dựa trên thành phần phospholipid khác nhau 4 Bảng 1.2 Một số chỉ tiêu chất lượng của liposome 7 Bảng 2.1 Nguyên vật liệu chính dùng trong nghiên cứu 17 Bảng 3.1 Kết quả đo mật độ quang các mẫu dung dịch doxorubicin ở bước sóng 233 và 481 nm 25 Bảng 3.2 Công thức các quy trình nén đẩy qua màng 26 Bảng 3.3 Sự phân bố KTTP phụ thuộc vào quy trình nén đẩy qua màng 27 Bảng 3.4 Các công thức mẫu sử dụng phương pháp giảm KTTP và đưa dược chất khác nhau 28 Bảng 3.5 Chất lượng hỗn dịch liposome qua các phương pháp giảm kích thước tiểu phân 29 Bảng 3.6 Các công thức bào chế liposome DOX 33 Bảng 4.1 Tỷ lệ dược chất / lipid của một số biệt dược trên thị trường 40 Danh mục hình vẽ, đồ thị Số hiệu Tên hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1 Cấu trúc liposome 4 Hình 1.2 Các phương pháp tạo chênh lệch pH qua màng liposom 6 Hình 1.3 Một số trạng thái tập hợp của phospholipid 8 Hình 2.1 Sơ đồ hệ thống lọc tiếp tuyến tự động 19 Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn của quy trình bào chế liposom doxorubicin bằng phương pháp tráng film 21 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ doxrubicin và mật độ quang ở các bước sóng khác nhau 25 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn phân bố KTTP phụ thuộc vào quy trình nén đẩy qua màng 27 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP (A) và hiệu suất liposome (B) theo thời gian 30 Hình 3.4 Sự thay đổi hiệu suất liposome hóa của các mẫu M1→M4 theo thời gian 31 Hình 3.5 Ảnh chụp TEM của liposome DOX citrat khi sử dụng các phương pháp giảm KTTP 32 Hình 3.6 Sự thay đổi KTTP theo thời gian giữa các mẫu bào chế 34 Hình 3.7 Sự thay đổi PDI theo thời gian giữa các mẫu bào chế 34 Hình 3.8 Ảnh hưởng của hệ đệm đến hiệu suất liposome hóa. 35 Hình 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ D/L đến hiệu suất liposome hóa. 37 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay căn bệnh ung thư đang là một trong những nguyên nhân tử vong hàng đầu trên thế giới. Ở Việt Nam, theo thống kê của Dự án Mục tiêu quốc gia phòng chống ung thư ước tính mỗi năm có khoảng 150 nghìn ca mắc mới và 75 nghìn ca tử vong. Việc điều trị ung thư đã và đang là một thách thức to lớn đối với nền y học hiện đại. Doxorubicin là một dược chất chống ung thư phổ biến hiện nay, tuy nhiên thuốc gây ra nhiều tác dụng không mong muốn nghiêm trọng vì gây độc trên cả tế bào ung thư và tế bào lành. Để giảm độc tính cũng như tăng hiệu quả điều trị của doxorubicin và các hóa trị liệu khác, các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát triển liposome như một hệ mang thuốc đến tế bào ung thư đầy triển vọng. Các chế phẩm liposome doxorubicin đang có mặt trên thị trường Việt Nam hiện nay như Cealyx, Doxil, Lipo-Dox, Myocet… Mặc dù dạng thuốc liposome có nhiều ưu điểm về khả năng mang thuốc, kiểm soát giải phóng thuốc và khả năng đưa thuốc tới đích nhưng việc ứng dụng trong thực tế còn nhiều hạn chế do liposome không ổn định. Trong những năm gần đây liposome cũng là một trong những đề tài được quan tâm nghiên cứu nhiều ở trường Đại học Dược Hà Nội. Chúng ta đã dần nắm vững các quy trình kỹ thuật bào chế liposome cũng như tiềm năng ứng dụng trong lâm sàng, tuy nhiên vẫn chưa có được biện pháp hiệu quả cải thiện chất lượng liposome. Đề tài “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng của liposome Doxorubicin” được thực hiện tại bộ môn Bào chế trường Đại học Dược Hà Nội dựa trên các kết quả nghiên cứu từ trước đó nhằm hoàn thiện hơn dạng thuốc tiêm liposome với mục tiêu:  Nghiên cứu ảnh hưởng của kỹ thuật bào chế và thành phần công thức đến một số chỉ tiêu chất lượng của liposome doxorubicin.  Đề xuất các cải tiến về công thức và quy trình bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2 mg/ml. [...]... hiệu suất đưa thuốc bị ảnh hưởng nhiều bởi pH Trạng thái tồn tại của dược chất là ion hóa hay không ion hóa; độ tan của dược chất, … đều chịu nhiều tác động của pH Mặt khác, độ chênh lệch pH giữa 2 bên màng cũng ảnh hưởng tới tốc độ thấm của dược chất qua màng Theo các nghiên cứu, tốc độ thấm dược chất vào trong liposome sẽ giảm dần theo thời gian do đó, chênh lệch pH 2 bên màng phải tối thiểu là 3 đơn... mắt) 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng hỗn dịch liposome 1.2.5.1 Kích thước và cấu trúc Kích thước của liposome ảnh hưởng tới tác dụng sinh học, hiệu quả đưa thuốc tới đích cũng như hiệu quả lâm sàng Ann L.B Seynhaeve và các cộng sự, đã nghiên cứu hiệu quả điều trị khối u rắn đã nhận thấy liposome có kích thước gần 100 nm có khả năng tập trung vào khối u rắn hơn 5-6 lần khi sử dụng liposome kích... suất liposome hóa cao [8], [16] Độ ổn định của liposome: quá trình thủy phân PL chịu sự ảnh hưởng của pH Theo như kết quả nghiên cứu của Grit et al về ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân của PC đậu tương trong một phạm vi pH từ 4,0-9,0 ở 400C và 700C cho thấy tốc độ thủy phân tối thiểu ở pH 6,5 [8] Kết quả tương tự cũng được báo cáo về sự thủy phân của DSPC và phosphatidyl hydrogen hóa pH cũng ảnh. .. hóa pH cũng ảnh hưởng đến quá trình suy thoái gián tiếp bởi sự tương tác của DOX với các ion kim loại… Ngoài ra, pH còn ảnh hưởng đến khả năng tích điện tiểu phân, thế zeta do đó ảnh hưởng tới độ ổn định hóa lý của liposome [8], [12] Loại muối đệm sử dụng để tạo chênh lệch pH Các loại muối đệm sử dụng để tạo chênh lệch pH ảnh hưởng lớn tới hiệu suất liposome hóa do cơ chế đưa thuốc vào liposome khác... VIS U-1800 (Hitachi - Nhật Bản)  Máy đo pH InoLab  Bơm nhu động 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp bào chế liposome doxorubicin Dựa theo các kết quả của các nghiên cứu về liposome DOX đã đạt được[1], [ 2], liposome doxorubicin được bào chế qua các giai đoạn sau: 2.2.1.1 Bào chế liposome trắng chưa mang dược chất Tạo lớp film lipid: hòa tan SPC : Chol (7:3) trong Choloroform Tiến hành bốc... dụng liposome kích thước 400 nm Ngoài ra liposome có kích thước nhỏ hơn 200 nm có khả năng lưu hành trong 7 máu lâu hơn liposome kích thước lớn Độ ổn định của liposome giảm theo sự tăng kích thước tối ưu với kích thước từ 80 đến 200 nm [6],[18] Cấu trúc của liposome cũng ảnh hưởng tới hiệu suất đưa thuốc Với dược chất tan trong dầu chủ yếu nằm ở phần vỏ lipid của liposome, MLV với cấu tạo gồm nhiều lớp... tiêu chất lượng hỗn dịch liposome Sau khi bào chế và trước khi sử dụng liposome phải đạt được một số chỉ tiêu chất lượng cơ bản gồm các chỉ tiêu vật lý, hóa học và sinh học [8],[16] Bảng1.2: Một số chỉ tiêu chất lượng của liposome Phương pháp đánh giá Chỉ tiêu Tiêu chuẩn sinh học Độ vô khuẩn Môi trường hiếu khí/kị khí Nội độc tố vi khuẩn Phản ứng sốt trên thỏ Độc tính trên động vật Theo dõi số lượng. .. glycerol phosphoric acid Các sản phẩm này hòa tan trong nước do đó sẽ phân vùng vào môi trường nước trong hoặc ngoài liposome. Tuy nhiên, các acid béo và lysophospholipid sẽ là một phần của liposome trong lớp màng lipid kép sẽ ảnh hưởng đến các đặc tính vật lý của liposome [12] 9 Cholesterol Cholesterol có vai trò tăng độ cứng, giảm tính thấm của màng (giúp tránh rò rỉ dược chất trong thời gian bảo... Doxorubicin khi gắn với liposome đã PEG hóa có thời gian tồn tại trong vòng tuần hoàn kéo dài hơn và ít phân bố tới các mô hơn Các liposome doxorubicin phân bố nhiều tới các mô ung thư có hệ mạch máu không bình thường Do đó giảm độc tính khi điều trị 1.2.7.2 Một số nghiên cứu gần đây về liposome DOX Yi Zhao và các cộng sự (2013) đã có phương pháp bào chế nhằm tăng hiệu quả điều trị của Doxil bằng cách... liposome không đặc hiệu (36%) [7] Tại Việt Nam, trường Đại học Dược Hà Nội là đơn vị tiên phong đầu tiên trong nghiên cứu về liposome ứng dụng làm chất mang thuốc Các nghiên cứu về liposome doxorubicin được thực hiện tại 2 đơn vị là Bộ môn Bào chế và Bộ môn Hóa sinh và đã thu được nhiều kết quả quan trọng [2],[4],[5] Tại Bộ môn Bào chế, ThS Nguyễn Văn Lâm và các cộng sự sau 1 thời gian dài nghiên cứu . thiện chất lượng liposome. Đề tài Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng của liposome Doxorubicin được thực hiện tại bộ môn Bào chế trường Đại học Dược Hà Nội dựa trên các kết quả nghiên. pháp bào chế 5 1.2.3. Các phương pháp gắn dược chất vào liposome 6 1.2.4. Một số chỉ tiêu chất lượng hỗn dịch liposome 7 1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng hỗn dịch liposome 7 1.2.5.1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ PHƯƠNG LINH NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN CHẤT LƯỢNG CỦA LIPOSOME DOXORUBICIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ