- Hệ đệm hydrat hóa: bên cạnh việc sử dụng hệ đệm citrat pH 4,0 tạo môi trường bên trong liposome như các nghiên cứu trước đây tiến hành nghiên cứu thêm
39
việc dùng amoni sulfat pH 5,5. Đệm amoni cho hiệu suất liposome hóa rất cao khoảng 95% thậm chí gần 100% trong khi sử dụng citrat chỉ cho hiệu suất 85-90%. Nhưng trong quá trình bảo quản, hệ đệm citrat bền hơn so với amoni thể hiện qua quan sát cảm quan khi sử dụng môi trường bên ngoài là HEPES/ NaCl: mẫu amoni chỉ sau 1 tháng xuất hiện kết tủa, sau 6 tuần mẫu bị hỏng nhưng citrat qua 2 tháng vẫn rất ổn định. Thực tế thì các chế phẩm trên thị trường đều sử dụng cả 2 loại đệm là citrat (Myocet) và amoni sulfat (Doxil) để làm môi trường đệm bên trong. Như vậy, có thể sử dụng cả 2 loại đệm trên để chế tạo liposome. Việc sử dụng loại đệm nào lại phụ thuộc vào khả năng cải thiện độ ổn định của liposome.
- Môi trường đẳng trương bên ngoài liposome: qua khảo sát, liposome dùng môi trường đệm là glucose ở bên ngoài sẽ bền hơn là dùng NaCl, sự thay đổi về KTTP cũng như PDI sau 2 tháng không đáng kể, mẫu không xuất hiện kết tủa trong khi NaCl mẫu chỉ ổn định sau 1 tháng, cấu trúc liposome bị phá hủy sau 2 tháng. Điều này có liên quan tới khả năng tương tác của các nhóm OH trên phân tử glucose với bề mặt liposome sự hình thành liên kết hydro giữa phân tử glucose với lớp kép lipid tạo thành lớp áo ngoài bảo vệ cho liposome tránh khỏi các tác động bất lợi của môi trường bên ngoài trong quá trình bảo quản. Ngoài ra sử dụng glucose làm tăng độ nhớt của môi trường làm giảm lực tương tác giữa các tiểu phân.
Các tài liệu nghiên cứu cũng chỉ ra những ảnh hưởng của glucose và oligome của nó (maltodextrins) trên sự ổn định của các liposome được bào chế bằng phương pháp đông khô. Kết quả cho thấy mẫu bào chế không sử dụng đường có sự gia tăng kích thước tiểu phân cũng như sự rò rỉ dược chất một cách đáng kể do các phân tử này có khả năng làm ổn định màng cũng như giảm tính thấm, tránh rò rỉ dược chất [10],[19]. Qua tìm hiểu, các chế phẩm liposome doxorubicin trên thị trường đều dùng saccharose làm chất đẳng trương ở môi trường bên ngoài, tuy nhiên các nghiên cứu được công bố trên các tạp chí quốc tế lại sử dụng đệm HBS để làm môi trường bên ngoài. Điều này có thể do giá cả của saccharose dùng cho chế phẩm tiêm cao hơn rất nhiều so với NaCl, cho nên các sản phẩm thực tế dùng saccharose. Còn liposome sử dụng trong các nghiên cứu chỉ cần ổn định trong thời gian nghiên cứu nên sử dụng NaCl để tiết kiệm chi phí. Vì vậy, quyết định lựa chọn môi trường đẳng trương bên
40
ngoài liposome là dung dịch glucose 5% thay vì NaCl 0,9% như những nghiên cứu trước.
- Nồng độ lipid: tỉ lệ D/L ảnh hưởng đáng kể tới hiệu suất liposome hóa. Giữ nguyên hàm lượng DOX là 2 mg/ml thay đổi nồng độ lipid trong lipisome dẫn tới thay đổi tỷ lệ D/L. Để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ D/L tới chất lượng của liposome dùng 2 tỷ lệ D/L là 1:4 và 1:8. Khi sử dụng đệm amoni hiệu suất đưa thuốc ở cả 2 mẫu là như nhau. Khi sử dụng citrat D/L 1:8 cho hiệu suất đưa thuốc cao hơn 1:4. Tuy nhiên theo kết quả nghiên cứu, tỷ lệ D/L 1:4 vẫn cho hiệu suất liposome hóa cao trên 85% khi sử dụng cả 2 hệ đệm citrat và amoni, và ít nguy cơ gặp hiện tượng chuyển trạng thái tập hợp của phospholipid. Thực tế trên thị trường hiện nay sử dụng cả 2 tỷ lệ này.
Bảng 4.1: Tỷ lệ dược chất / lipid của một số biệt dược trên thị trường
Biệt dược Nhà sản xuất Môi trường bên ngoài KTTP (nm) Thành phần lipid D/L Caelyx Alza Corporation Saccharose 100 HSPC/Chol/PEG(56:39:5 1:8 EVACET The Liposome Saccharose 150 EPC/Chol(55:45 kl/kl) 1:4
Trên cơ sở các kết quả thu được, nghiên cứu để xuất một số thay đổi về công thức và quy trình bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml so với quy trình đã được ThS. Nguyễn Văn Lâm đưa ra theo sơ đồ sau:
41
Hình 3.10:Công thức và quy trình bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml
Lắc kĩ hòa tan hết DOX SPC: 1000mg Chol: 300mg CHCl3: 100ml
Lọ thủy tinh chứa 20mg DOX đông khô Thiết bị Microkros Màng PS 50 kD Diện tích màng lọc 28 cm2 Nhiệt độ: 50oC Qua màng 400: 10 lần Qua màng 100: 20 lần 100 ml dung dịch đệm citrat pH 4 hoặc amoni sulfat pH 5,5 Đun cách thủy 50oC/15 phút Bốc hơi dung môi trong 12h trên thiết bị
cất quay Lọc qua màng cellulose nitrat 0,2 µm Hydrat hóa Đổi hệ đệm Nén qua màng polycarbonat Nhiệt độ: 40oC Tốc độ: 50 vòng/phút Hút chân không Nhiệt độ: 50oC Tốc độ: 80 vòng/phút Hút chân không 1l dung dịch đệm HBG pH 7,4
Bơm vào mỗi lọ 10 ml hỗn dịch
liposome
Ủ ở 50oC trong 15 phút
42
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã thu được các kết quả sau:
Đã khảo sát được tính ưu việt của phương pháp nén qua màng so với phương pháp siêu âm ảnh hưởng lớn tới chất lượng liposome thể hiện rõ ràng nhất qua hiệu suất liposome, PDI và độ ổn định của chế phẩm. Cải tiến được quy trình bào chế để nâng cao chất lượng liposome. Lựa chọn phương pháp giảm kích thước tiểu phân là nén qua màng với quy trình thông qua 2 bước: lọc thô ở màng 400 nm và đồng nhất hóa ở màng 100 nm sau 20 - 30 chu kỳ bào chế được liposome LUV kích thước 150 nm, PDI 0,05-0,15. Hiệu suất liposome tăng đáng kể trên 95% DOX được vận chuyển vào liposome. Kết quả này thu được tương đương với các báo cáo nghiên cứu nước ngoài cũng như các chỉ tiêu của chế phẩm đang lưu hành.
Đã khảo sát được ảnh hưởng của công thức bào chế: hệ đệm sử dụng để hydrat hóa, môi trường đẳng trương bên ngoài liposome, tỷ lệ dược chất/ lipid ảnh hưởng tới chất lượng của liposome. Kết quả cho thấy:
Sử dụng hệ đệm amoni sulfat cho hiệu suất liposome hóa (95%) cao hơn citrat 85-90% nhưng sử dụng hệ đệm citrat liposome bền vững hơn.
Sử dụng môi trường đẳng trương bên ngoài liposome là glucose cho mẫu ổn định hơn NaCl.
Lựa chọn tỷ lệ D/L là 1:4 với hàm lượng DOX 2 mg/ml, PC 10 mg/ml, Chol 3 mg/ml là tỷ lệ hợp lý vừa có hiệu suất liposome hóa cao, vừa tiết kiệm chi phí sản xuất tránh lãng phí nguyên liệu.
Đã đề xuất một số cải tiến về công thức và quy trình bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml trên cơ sở các kết quả đạt được.
ĐỀ XUẤT
Đánh giá lại các chỉ tiêu chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml theo công thức và quy trình bào chế mới.
.TÀI LIỆU THAM KHẢO (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT:
1. Nguyễn Chí Đức Anh, (2012), “Nghiên cứu ảnh hưởng của kỹ thuật bào chế ảnh hưởng đến đặc tính của liposome doxorubicin”, Khóa luận Dược sỹ Đại học, Đại học Dược Hà Nội.
2. Nguyễn Văn Lâm, (2012), ”Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật”, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội.
3. Lê Thị Thu, (2011), "Nghiên cứu phương pháp nạp doxorubicin vào tiểu phân liposome", Khóa luận Dược sỹ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
4. Đào Thanh Tùng, (2011), “Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin”, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội
5. Nguyễn Thị Cẩm Vân, (2012),”Nghiên cứu đánh giá độ ổn định của chế phẩm liposome Doxorubicin, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
6. Abraham S. A. et al.,(2005), "The liposomal formulation of doxorubicin",
Methods in enzymology, 391, p. 71.
7. Accardo A. et al., (2012), "Peptide-modified liposomes for selective targeting of bombesin receptors overexpressed by cancer cells: a potential theranostic agent",
International journal of nanomedicine, 7, p. 2007.
8. Barenholz Y. et al., (1993), "Stability of liposomal doxorubicin formulations: problems and prospects", Medicinal research reviews, 13(4), pp. 449-491.
9. Betageri G., Parsons D. (1992), "Drug encapsulation and release from multilamellar and unilamellar liposomes", International journal of pharmaceutics, 81(2-3), pp. 235-241.
10. Chiu G. N. et al., (2005), "Encapsulation of doxorubicin into thermosensitive liposomes via complexation with the transition metal manganese", Journal of controlled release, 104(2), pp. 271-288.
11. Glavas-Dodov M. et al., (2005), "The effects of lyophilization on the stability of liposomes containing 5-FU", International journal of pharmaceutics, 291(1), pp. 79-86.
12. Grit M., Crommelin D. J., (1993), "Chemical stability of liposomes: implications for their physical stability", Chemistry and physics of lipids, 64(1), pp. 3-18.
13. Hantel C. et al., (2012), "Liposomal doxorubicin-based treatment in a preclinical model of adrenocortical carcinoma", Journal of Endocrinology, 213(2), pp. 155-161.
14. Johnston M. J. et al., (2008), "Influence of drug-to-lipid ratio on drug release properties and liposome integrity in liposomal doxorubicin formulations", Journal of liposome research, 18(2), pp. 145-157.
15. Meure L. A. et al., (2008), "Conventional and dense gas techniques for the production of liposomes: a review", Aaps Pharmscitech, 9(3), pp. 798-809.
16. Samad A., Sultana Y., Aqil M. (2007), "Liposomal drug delivery systems: an update review", Current drug delivery, 4(4), pp. 297-305.
17. Samuni A. M., Lipman A., Barenholz Y. (2000), "Damage to liposomal lipids: protection by antioxidants and cholesterol-mediated dehydration", Chemistry and physics of lipids, 105(2), pp. 121-134.
18. Seynhaeve A. L., Hoving S., Schipper D., Vermeulen C. E., Aan De Wiel- Ambagtsheer G., Van Tiel S. T., et al. (2007), "Tumor necrosis factor α mediates homogeneous distribution of liposomes in murine melanoma that contributes to a better tumor response", Cancer research, 67(19), pp. 9455-9462.
19. Suzuki T., Komatsu H. (1996), "Effects of glucose and its oligomers on the stability of freeze-dried liposomes", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Biomembranes, 1278(2), pp. 176-182.
20. Use F., Use H., Actions P., Side-Effects T., Contra-Indications W. (2007), "Martindale: the complete drug reference".
21. Wang Z., Yu Y., Dai W., Lu J., Cui J., Wu H., et al. (2012), "The use of a tumor metastasis targeting peptide to deliver doxorubicin-containing liposomes to highly metastatic cancer", Biomaterials.
22. Xu X., Burgess D. J. (2012), "Liposomes as carriers for controlled drug delivery", Long Acting Injections and Implants, Springer, pp. 195-220.
23. Xu X., Khan M. A., Burgess D. J. (2012), "Predicting hydrophilic drug encapsulation inside unilamellar liposomes", International journal of pharmaceutics, 423(2), pp. 410-418.
24. Zalba S., Navarro I., Trocóniz I. F., Tros De Ilarduya C., Garrido M. J. (2012), "Application of different methods to formulate PEG-liposomes of oxaliplatin: Evaluation< i> in vitro</i> and< i> in vivo</i>", European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 81(2), pp. 273-280.
25. Zhao Y., Alakhova D. Y., Kim J. O., Bronich T. K., Kabanov A. V. (2013), "A Simple Way to Enhance Doxil® Therapy: Drug Release from Liposomes at the Tumor Site by Amphiphilic Block Copolymer", Journal of controlled release.
PHỤ LỤC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phụ lục 1: Đồ thị phân bố kích thước liposom được làm giảm KTTP bằng các quy trình nén qua màng khác nhau
Phụ lục 2: So sánh đồ thị phân bố kích thước liposom được làm giảm KTTP bằng phương pháp nén qua màng và siêu âm
Phụ lục 3: Hình chụp TEM của Liposome DOX được làm giảm KTTP bằng phương pháp nén qua màng
Phụ lục 4: Hình chụp TEM của Liposome DOX được làm giảm KTTP bằng phương pháp siêu âm
Phụ lục 5: Bảng thay đổi KTTP theo thời gian của các mẫu bào chế
Thời gian 1ngày 3 ngày 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày
Z -a v er a g e CG142 152,45 151,35 152,90 163,95 159,00 183,95 CG182 163,45 159,85 144,15 129,05 147,90 148,90 CM142 148,80 154,05 154,75 162,20 159,90 163,20 CM182 146,60 172,80 159,85 158,25 164,90 163,20 AG142 157,85 150,35 148,20 163,20 159,4 161,10 AG182 146,75 145,05 143,97 157,95 156,75 170,40 AM142 154,75 150,2 151,73 143,7 144,15 140,2 AM182 147,10 143,70 150,20 151,35 151,9 166,40
Phụ lục 6: Bảng thay đổi PDI theo thời gian của các mẫu bào chế
Thời gian 1 ngày 3 ngày 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày
P D I CG142 0,079 0,085 0,092 0,070 0,100 0,100 CG182 0,073 0,091 0,064 0,116 0,073 0,070 CM142 0,066 0,054 0,055 0,086 0,108 0,106 CM182 0,073 0,059 0,065 0,111 0,058 0,076 AG142 0,075 0,084 0,079 0,059 0,080 0,043 AG182 0,081 0,078 0,049 0,080 0,085 0,082 AM142 0,071 0,093 0,093 0,079 0,081 0,115 AM182 0,104 0,068 0,083 0,071 0,103 0,043
Phụ lục 7: Bảng thay đổi hiệu suất liposome hóa theo thời gian của các mẫu bào chế
Thời gian 1 ngày 3 ngày 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày
Hiệu suất liposome hóa CG142 89,43 87,42 87,18 87,03 83,89 78,78 CG182 89,88 90,46 91,16 91,09 87,97 84,29 CM142 86,23 92,96 89,55 89,62 92,08 90,26 CM182 94,85 95,79 91,50 94,30 91,64 90,60 AG142 > 95 > 95 > 95 94,90 94,64 94,12 AG182 > 95 > 95 > 95 > 95 > 95 > 95 AM142 > 95 > 95 > 95 > 95 > 95 > 95 AM182 > 95 > 95 > 95 > 95 > 95 94,61
1. Anh N. C. Đ. (2012), Nghiên cứu ảnh hưởng của kỹ thuật bào chế ảnh hưởng đến đặc tính
của liposome doxorubicin, Khóa luận Dược sỹ Đại học Đại học Dược Hà Nội.
2. Lâm N. V. (2012), Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin và đánh giá tác
dụng trên khối u động vật, Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội.
3. Thu L. T. (2011), Nghiên cứu phương pháp nạp doxorubicin vào tiểu phân liposome, Khóa luận Dược sỹ Đại học Trường Đại học Dược Hà Nội.
4. Tùng Đ. T. (2012), Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin, Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, Đại học Dược Hà Nội.
5. Vân C. N. T. (2012), Nghiên cứu đánh giá độ ổn định của chế phẩm liposome Doxorubicin, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ.
6. Abraham S. A., Waterhouse D. N., Mayer L. D., Cullis P. R., Madden T. D., Bally M. B. (2005), "The liposomal formulation of doxorubicin", Methods in enzymology, 391, p. 71.
7. Accardo A., Salsano G., Morisco A., Aurilio M., Parisi A., Maione F., et al. (2012), "Peptide- modified liposomes for selective targeting of bombesin receptors overexpressed by cancer cells: a potential theranostic agent", International journal of nanomedicine, 7, p. 2007. 8. Barenholz Y., Amselem S., Goren D., Cohen R., Gelvan D., Samuni A., et al. (1993), "Stability
of liposomal doxorubicin formulations: problems and prospects", Medicinal research reviews, 13(4), pp. 449-491.
9. Chiu G. N., Abraham S. A., Ickenstein L. M., Ng R., Karlsson G., Edwards K., et al. (2005), "Encapsulation of doxorubicin into thermosensitive liposomes via complexation with the transition metal manganese", Journal of controlled release, 104(2), pp. 271-288.
10. Glavas-Dodov M., Fredro-Kumbaradzi E., Goracinova K., Simonoska M., Calis S., Trajkovic- Jolevska S., et al. (2005), "The effects of lyophilization on the stability of liposomes containing 5-FU", International journal of pharmaceutics, 291(1), pp. 79-86.
11. Gregoriadis G. (1984), "Liposome technology. Volume I: Preparation of liposomes".
12. Grit M., Crommelin D. J. (1993), "Chemical stability of liposomes: implications for their physical stability", Chemistry and physics of lipids, 64(1), pp. 3-18.
13. Hantel C., Lewrick F., Reincke M., Süss R., Beuschlein F. (2012), "Liposomal doxorubicin- based treatment in a preclinical model of adrenocortical carcinoma", Journal of
Endocrinology, 213(2), pp. 155-161.
14. Johnston M. J., Edwards K., Karlsson G., Cullis P. R. (2008), "Influence of drug-to-lipid ratio on drug release properties and liposome integrity in liposomal doxorubicin formulations", (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Journal of liposome research, 18(2), pp. 145-157.
15. Meure L. A., Foster N. R., Dehghani F. (2008), "Conventional and dense gas techniques for the production of liposomes: a review", Aaps Pharmscitech, 9(3), pp. 798-809.
16. Samad A., Sultana Y., Aqil M. (2007), "Liposomal drug delivery systems: an update review",
Current drug delivery, 4(4), pp. 297-305.
17. Samuni A. M., Lipman A., Barenholz Y. (2000), "Damage to liposomal lipids: protection by antioxidants and cholesterol-mediated dehydration", Chemistry and physics of lipids, 105(2), pp. 121-134.
18. Seynhaeve A. L., Hoving S., Schipper D., Vermeulen C. E., Aan De Wiel-Ambagtsheer G., Van Tiel S. T., et al. (2007), "Tumor necrosis factor α mediates homogeneous distribution of liposomes in murine melanoma that contributes to a better tumor response", Cancer research, 67(19), pp. 9455-9462.