Dãy dung dịch chuẩn được chuẩn bị như sau: cân chính xác 100 mg DOX.HCl hòa tan hoàn toàn trong 100 ml dung dịch đệm phosphat pH 4,0 sử dụng thiết bị khuấy từ. Cho vào bình định mức 100 ml thêm từ từ dung dịch phosphate tới vạch thu được dung dịch DOX với hàm lượng 1000 μg/ml. Từ dung dịch gốc đem pha loãng bằng đệm phosphat pH 4,0 để thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 μg/ml. Các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 1 tới 12 μg/ml được đo quang ở bước sóng 233 nm từ đó định lượng DOX tự do. Các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 6 đến 20 μg/ml được đo quang ở bước sóng 481 nm để định lượng DOX toàn phần. Cả 2 trường hợp đều sử dụng mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat pH 4,0.
Từ kết quả thu được, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính , vẽ đồ thị biểu hiện mối quan hệ tương quan giữa nồng độ DOX và mật độ quang [1], [4].
2.2.4.2.Định lượng dược chất toàn phần
Mẫu thử: hút 1ml mẫu liposom, thêm 1ml dd Triton X100 10% (tt/tt) vào bình định mức 10 ml. Lắc kỹ, để yên 5 phút. Thêm đệm phosphat pH 4,0 đến vạch. Để
23
lạnh 2h. Đem ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút, điều kiện 6oC để loại bỏ phần lipid. Phần dịch trong được pha loãng tiếp bằng dung dịch đệm phosphat pH 4,0 với tỷ lệ pha loãng phù hợp để đạt nồng độ khoảng 10 µg/ml. Đo quang ở bước sóng 481 nm.
Mẫu trắng: dung dịch đệm phosphat pH 4,0.
Mẫu chuẩn: dung dịch DOX chuẩn hàm lượng 10 μg/ml [1], [4]. Tính nồng độ doxorubicin hydroclorid toàn phần theo công thức:
CTP =DTP / DC x CC x K
DTP, DC: mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn đem đo
CTP: hàm lượng doxorubicin toàn phần của mẫu liposom doxorubicin (mg/ml) CC: nồng độ doxorubicin trong dung dịch dung dịch chuẩn (mg/ml).
K: hệ số pha loãng.
2.2.4.3.Định lượng dược chất tự do
Mẫu thử: hút 1ml mẫu liposome DOX cho vào túi thẩm tích rồi treo túi trong bình thủy tinh có chứa 100 ml dung dịch đệm phosphat pH 4,0 túi ngập trong dung dịch. Để sau 15h và duy trì nhiệt độ < 10oC. Lấy dịch bên ngoài màng thẩm tích, đem đo quang tại bước sóng 233 nm.
Mẫu chuẩn: chuẩn bị mẫu chuẩn bằng cách pha DOX.HCl với lượng biết trước trong dung dịch đệm phosphat pH 4,0 tới nồng độ biết trước nằm trong khoảng nồng độ của đường chuẩn đã xây dựng [1], [4].
Tính nồng độ doxorubicin tự do theo công thức:
CN=DN / D’C x C’C x K’
DN, D’C: mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn đem đo. CN: hàm lượng doxorubicin tự do của mẫu liposom doxorubicin (mg/ml). C’C: nồng độ doxorubicin trong dung dịch dung dịch chuẩn (µg/ml). K’: hệ số pha loãng.
2.2.4.4.Hiệu suất liposome hóa
Hiệu suất liposome hóa chính là tỉ lệ phần trăm hàm lượng DOX gắn vào liposome so với hàm lượng DOX toàn phần. Hàm lượng DOX gắn vào liposome
24
được tính thông qua trung gian DOX tự do và DOX toàn phần đã được trình bày ở trên mục 2.2.4.2 và 2.2.4.3
Tính hiệu suất liposome hóa theo công thức:
100 . . . . 0 0 V C V C V C H TP N N TP (%)
H: hiệu suất liposome hóa (%).
CN, CTP: hàm lượng doxorubicin tự do và doxorubicin toàn phần (mg/ml). VN, V0: thể tích dung dịch doxorubicin tự do và doxorubicin toàn phần (ml).