Sử dụng 1 trong 2 phương pháp sau:
Phương pháp siêu âm: cho vào lọ thủy tinh hỗn dịch liposome ở trên, nhúng đầu siêu âm của thiết bị Labsonic ngập 1/3 hỗn dịch, siêu âm với tần số 30 kHz, biên độ 100%. Làm mát bằng nước lạnh để đảm bảo nhiệt độ siêu âm không vượt quá 60oC. Sau khi siêu âm, lọc hỗn dịch qua màng cellulose acetat 0,45 μm rồi 0,2 μm.
Phương pháp nén qua màng (extrusion). Mỗi lần hút 1ml hỗn dịch vào xilanh rồi lần lượt đẩy qua các màng polycarbonat với kích thước lỗ lọc giảm dần từ 1000 nm đến 100 nm. Duy trì nhiệt độ khi nén qua màng ở nhiệt độ chuyển pha của lipid.
2.2.1.3. Tiến hành đổi hệ đệm bên ngoài liposome
Sử dụng phương pháp lọc tiếp tuyến để đổi môi trường. Sử dụng 1 trong 2 loại dung dịch đệm sau để thay đổi môi trường bên ngoài liposome:
Đệm HBS (HEPES buffer saline): hòa tan 20mM HEPES trong 1l dung dịch NaCl 0,9%.
Đệm HBG (HEPES buffer glucose): hòa tan 20mM HEPES trong 1l dung dịch glucose 5%.
Tiến hành: bố trí hệ thống lọc tiếp tuyến như hình 2.1
Hình 2.1: Sơ đồ hệ thống lọc tiếp tuyến tự động [2].
Bơm tuần hoàn hỗn dịch liposome qua cột lọc, liposome không qua được màng liên tục chạy qua cột.nước và các phân tử chất tan thấm qua màng thoát ra ngoài bị
20
loại bớt khiến áp suất trong lọ thủy tinh chứa hỗn dịch liposome giảm tạo lực hút đệm HEPES sang để bù vào lượng nước bị loại mất. Kết quả là bao nhiêu thể tích dung dịch cũ bị loại thì được bù vào bằng bấy nhiêu thể tích dung dịch đệm HEPES. Quá trình sẽ diễn ra cho tới khi thể tích dung dịch đổi gấp 8-10 lần thể tích liposome thì có thể loại được hoàn toàn môi trường cũ.
Khi pH dịch lọc đạt 7,2 - 7,4 mà dung tích HEPES vẫn nhỏ hơn 8 lần thể tích hỗn dịch thì vẫn tiếp tục chạy bơm tới khi đủ 8-10 lần thể tích để đảm bảo loại bỏ gần như hoàn toàn anion citrat hoặc sulfat có mặt trong môi trường ngoài liposome có khả năng gây tủa DOX khi nạp thuốc.
2.2.1.4.Đưa DOX vào liposome
Sử dụng 2 phương pháp nạp DOX dựa trên chênh lệch pH và chênh lệch amoni + Chênh lệch pH: môi trường bên trong liposome là đệm citrat.
+ Chênh lệch amoni: môi trường bên trong liposome là đệm amoni sulfat Quá trình đổi môi trường bên ngoài liposome bằng đệm HEPES kết thúc sẽ thu được được liposome có sự chênh lệch pH hoặc chênh lệch amoni giữa 2 bên màng. Quá trình gắn DOX vào liposome được tiến hành như sau:
Cân chính xác một lượng doxorubicin hydrochlorid rồi hòa tan từ từ vào hỗn dịch trên bằng máy khuấy từ và khuấy liên tục trong khoảng 15 phút ở 50oC để DOX có thể hòa tan và khuếch tán vào trong liposome.
21
Hình 2.2: Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn của quy trình bào chế liposom doxorubicin bằng phương pháp tráng film