Nghiên cứu bào chế và đánh giá độ ổn định của viên nén alpha chymotrypsin

Các nghiên cứu ứng dụng phương pháp đông khô để tăng độ ổn định của chế phẩm sinh học trong những năm gần đây.. Điều này có thể giải thích do các phân tử dung môi hữu cơ sẽ tương tác vớ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

2 Bộ môn Công nghiệp dược

3 Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương

HÀ NỘI - 2014

Tùng, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa

luận Dưới sự hướng dẫn của thầy, em đã học hỏi được rất nhiều điều, không chỉ về kiến thức mà còn cả về sự đam mê với khoa học

Em cũng chân thành cám ơn TS Nguyễn Thị Liên và các cán bộ phòng Dược

lý, Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương Sự hướng dẫn và giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị đã giúp em có điều kiện hoàn thành khóa luận một cách thuận lợi nhất Trong quá trình làm thực nghiệm và nghiên cứu, em cũng nhận được sự giúp

đỡ và tạo điều kiện của các thầy cô giáo, kỹ thuật viên của Bộ môn Bào chế và Bộ môn Công nghiệp Dược Em xin cám ơn những sự giúp đỡ quý báu này

Cuối cùng em xin cám ơn gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và học tập

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Phạm Thanh Tùng

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về alpha-chymotrypsin 2

1.1.1 Nguồn gốc, cấu tạo 2

1.1.2 Tính chất hóa lý 2

1.1.3 Phương pháp định lượng 2

1.1.4 Đơn vị tính 3

1.1.5 Tác dụng dược lý 3

1.1.6 Chỉ định 3

1.1.7 Liều lượng và cách dùng 3

1.1.8 Tác dụng không mong muốn 4

1.1.9 Chế phẩm 4

1.2 Độ ổn định và các phương pháp cải thiện độ ổn định của enzym 4

1.2.1 Quá trình bất hoạt enzym 4

1.2.2 Các tác nhân gây bất hoạt của enzym 6

1.2.3 Các phương pháp cải thiện độ ổn định của enzym 10

1.3 Đại cương về đông khô 11

1.3.1 Khái niệm 11

1.3.2 Ảnh hưởng của các giai đoạn đông khô tới hoạt tính enzym 11

1.3.3 Các nghiên cứu ứng dụng phương pháp đông khô để tăng độ ổn định của các chế phẩm sinh học 13

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16

2.1.1 Nguyên vật liệu 16

2.1.2 Thiết bị 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3.2 Phương pháp đánh giá 20

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Nghiên cứu bào chế bột đông khô alpha – chymotrypsin 26

3.1.1 Ảnh hưởng của các yếu tố công thức 26

3.1.2 Ảnh hưởng của yếu tố quy trình 37

3.1.3 Đánh giá hoạt tính của bột đông khô 38

3.2 So sánh bột đông khô ACT với nguyên liệu ACT ban đầu 38

3.2.1 Khả năng ổn định với chu trình nhiệt-lạnh 39

3.2.2 Khả năng ổn định với yếu tố nhiệt-ẩm 39

3.2.2 Khả năng ổn định dưới tác động của lực cơ học 41

3.3 Nghiên cứu bào chế viên nén chứa bột đông khô alpha-chymotrypsin 42

3.3.1 Lựa chọn phương pháp bào chế 42

3.3.2 Ảnh hưởng của tá dược độn 43

3.3.3 Ảnh hưởng của lực dập 45

3.4 Đánh giá độ ổn định của viên nén alpha-chymotrypsin 46

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ACT Alpha-chymotrypsin

Bảng 1.1 Các loại chế phẩm trên thị trường của alpha-chymotrypsin 4

Bảng 1.2 Phân loại các dạng biến đổi cấu trúc của alpha-chymotrypsin 5

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của pH đến trạng thái của alpha-chymotrypsin 8

Bảng 1.4 Các phương pháp cải thiện độ ổn định của

Bảng 1.5 Các nghiên cứu ứng dụng phương pháp đông khô để tăng độ

ổn định của chế phẩm sinh học trong những năm gần đây 14

Bảng 3.2 Thể chất và hàm ẩm của bánh đông khô và bột đông khô khi

Bảng 3.3 Bảng khảo ảnh hưởng của tá dược A trong môi trường đệm

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tá dược A tới độ tan và pH

Bảng 3.5 Bảng khảo sát ảnh hưởng của tá dược A với các yếu tố biến

Bảng 3.8 Khảo sát ảnh hưởng của chất diện hoạt 35

Bảng 3.9 Khảo sát một số thông số quy trình 37

Bảng 3.10 Hoạt tính của alpha-chymotrypsin trước và sau đông khô 38

Bảng 3.11 Hàm ẩm và hoạt tính còn lại của ACT và ACT đông khô sau

Bảng 3.13 Hoạt tính còn lại của viên nén chứa alpha-chymotrypsin

đông khô và viên nén alpha-chymotrypsin sau khi dập 41

Bảng 3.15 Hoạt tính và hoạt tính còn lại của viên nén sử dụng isomalt,

tá dược C và carrageenan tại các thời điểm khác nhau 43 Bảng 3.16 Hoạt tính và hoạt tính còn lại của viên nén khi sử dụng các

Bảng 3.17 Kết quả khảo sát độ ổn định của công thức tối ưu 47

Hình 1.1 Cấu trúc 3 chiều của phân tử alpha chymotrypsin 2

Hình 1.2 Đường biểu diễn động học quá trình bất hoạt của

Hình 1.3 Ảnh hưởng của pH đến α-chymotrypsin 6

Hình 1.4 Ảnh hưởng của pH đến α-chymotrypsin 8 Hình 1.5 Các giai đoạn của quá trình đông khô 11

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình bào chế bột đông khô alpha

Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình bao chế viên nén

Hình 3.1 Thể chất của bánh đông khô khi sử dụng các loại tá dược

độn khác nhau trong môi trường PBS 7,8 và HCl 0,001N 28

Hình 3.2 Trạng thái hòa tan trở lại của các mẫu đông khô 32

Hình 3.3 Độ tan của alpha-chymotrypsin trong các môi trường khác

Hình 3.6 Hoạt tính còn lại của chymotrypsin và

alpha-chymotrypsin đông khô trong điều kiện nhiệt độ 40 ± 2 oC, hàm ẩm 75

± 5% theo thời gian

40

Hình 3.7 Hoạt tính còn lại của viên nén sử dụng các loại tá dược độn

khác nhau theo thời gian khi lão hóa cấp tốc trong điều kiện 40 ± 2 oC,

hàm ẩm 75 ± 5%

44

Hình 3.8 Hoạt tính còn lại của viên nén alpha-chymotrypsin sau khi

ĐẶT VẤN ĐỀ

Với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học hiện đại, việc ứng dụng các chất có nguồn gốc sinh học vào điều trị đang là một hướng đi mới và hứa hẹn mang lại hiệu quả cao Nhiều chất đã và đang đóng vai trò quan trọng trong công tác điều trị bệnh như insulin, γ-interferon, α-chymotrypsin,… Tuy nhiên, việc phát triển chế phẩm chứa các chất có nguồn gốc sinh học lại gặp phải một trở ngại lớn, đó

là độ ổn định Sự mất hoạt tính nhanh chóng của dược chất đã đặt ra một bài toán rất khó để ứng dụng rộng rãi các chế phẩm sinh học vào thực tế điều trị

Alpha-chymotrypsin là một enzym sinh học thường được thương mại hóa dưới dạng viên nén để điều trị các triệu chứng viêm Tuy nhiên, một vấn đề thường gặp phải của các chế phẩm này là khó có thể duy trì được hoạt tính cần thiết sau một thời gian lưu hành trên thị trường Điều này là do bản thân alpha-chymotrypsin rất nhạy cảm với các yếu tố môi trường, đặc biệt là trong điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm của Việt Nam Việc khắc phục nhược điểm này đang thu hút được sự quan tâm chú

ý của các nhà sản xuất và các nhà nghiên cứu

Xuất phát từ thực tế nêu trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế và đánh giá độ ổn định của viên nén alpha-chymotrypsin” được chúng tôi tiến hành với mục tiêu:

Xây dựng được công thức và quy trình bào chế viên nén alpha-chymotrypsin có khả năng duy trì được độ ổn định cao trong quá trình bào chế và bảo quản ban đầu

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về alpha-chymotrypsin

1.1.1 Nguồn gốc, cấu tạo

- α-chymotrypsin được điều chế bằng cách phân giải chymotrypsinogen bằng trypsin được chiết xuất từ tuyến tụy của bò

- α-chymotrypsin có phân tử lượng là 25000 Da được cấu tạo từ 3 chuỗi peptid: chuỗi

A (Cys1 - Leu3), chuỗi B (Ile16 – Tyr 146) và chuỗi C (Ala149 – Asn245) được nối với nhau bởi 5 cầu nối disulfit, tổng số acid amin là 245 [18]

- α-chymotrypsin thuộc nhóm serin-protease có trung tâm hoạt tính là bộ 3 acid amin Asp102-His57-Ser195

este (ATEE) của mẫu thử alpha-chymotrypsin so với alpha-chymotrypsin chuẩn trong cùng một điều kiện

𝐴𝑇𝐸𝐸 + 𝐻2𝑂𝑎𝑙𝑝ℎ𝑎−𝑐ℎ𝑦𝑚𝑜𝑡𝑟𝑦𝑝𝑠𝑖𝑛→ 𝑁 − 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑦𝑙 − 𝐿 − 𝑡𝑦𝑟𝑜𝑠𝑖𝑛 + 𝑒𝑡ℎ𝑎𝑛𝑜𝑙

 Định lượng bằng phương pháp đo quang [37] (theo Dược điển Mỹ USP 34): Tốc độ thủy phân ATEE của mẫu thử được đánh giá qua độ giảm độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch cơ chất sau những khoảng thời gian nhất định

 Định lượng bằng phương pháp phân tích thể tích [7] (theo Dược điển Anh BP 2013):

Tốc độ thủy phân ATEE của mẫu thử được đánh giá qua độ giảm pH của dung dịch cơ chất sau những khoảng thời gian nhất định

1.1.4 Đơn vị tính

- Microkatal (theo Dược điển Anh và Dược điển châu Âu)

- Đơn vị USP (theo dược điển Mỹ)

- Đơn vị FIP (theo Hiệp hội Dược quốc tế)

1.1.5 Tác dụng dược lý

- Alpha-chymotrypsin có tác dụng làm tan dây chằng thủy tinh thể, được dùng trong

nhãn khoa để bỏ nhân mắt đục trong bao và giảm chấn thương

- Alpha-chymotrypsin được sử dụng nhằm làm giảm viêm và phù mô mềm do apxe

và loét hoặc do chấn thương Enzym này còn giúp làm giảm các dịch tiết đường hô

hấp trên ở người bệnh hên, viêm phế quản, bệnh phổi và viêm xoang [1]

1.1.6 Chỉ định

- Hỗ trợ trong phẫu thuật đục thủy tinh thể để lấy bỏ nhân mắt dễ dàng

- Phù nề sau chấn thương hoặc sau phẫu thuật

- Hỗ trợ bệnh lý viêm đường hô hấp, giảm tiết dịch nhày đờm, dịch rỉ viêm [1]

1.1.7 Liều lượng và cách dùng

- Hỗ trợ phẫu thuật đục thủy tinh thể: 1-2 ml dung dịch chứa 150 U/mg hoặc 75 U/mg

bơm vào đáy mắt, có thể thêm 1-2 ml qua lỗ cắt mống mắt nếu cần thiết

- Điều trị phù nề sau chấn thương hoặc sau phẫu thuật: Tiêm bắp liều 5000 đơn vị

USP, 1-3 lần/ngày

- Nếu dùng viên nén, dùng 4-6 viên/ngày ngậm dưới lưỡi, chia làm nhiều lần hoặc

uống 2 viên/ lần, 3-4 lần/ngày

1.1.8 Tác dụng không mong muốn

- Thường gặp nhất là tăng nhất thời nhãn áp do các mảnh vụn dây chằng bị tiêu hủy làm tắc mạng bó dây Dùng trong nhãn khoa có thể gặp phù giác mạc, viêm nhẹ màng

Bảng 1.1 Các loại chế phẩm trên thị trường của alpha-chymotrypsin

Viên nén 21 μkatal Alphachoay (Sanofi Aventis),

Alphachymotrypsin GLOMED (GLOMED) Viên nén phối hợp alpha

chymotrypsin, trypsin

(100mg) và các enzym

khác

Intenzym ForteTM (Biotics)

Bột pha dung dịch tiêm bắp

5000 đơn vị

Michosin (Arrow Pharm Group) Chymotrysin Inj (Vimedimex II)

1.2 Độ ổn định và các phương pháp cải thiện độ ổn định của enzym

1.2.1 Quá trình bất hoạt enzym

Cấu trúc 3 chiều tinh vi và phức tạp của enzym là yếu tố quyết định hoạt tính xúc tác của chúng Bất kỳ yếu tố nào làm biến đổi cấu trúc đặc biệt này đều ảnh hưởng đến hoạt tính enzym

Sự bất hoạt enzym bao gồm sự biến đổi về mặt vật lý và hóa học:

Bảng 1.2 Phân loại các dạng biến đổi cấu trúc của alpha-chymotrypsin [3]

α1, α2: tỷ số hoạt tính riêng E1/E và E2/E (α2 = 0 trong trường hợp của ACT)

Hoạt tính còn lại của alpha-chymotrypsin được tính theo công thức:

1.2.2 Các tác nhân gây bất hoạt của enzym

Các loại tác nhân gây bất hoạt alpha chymotrypsin thường được chia làm 3 nhóm chính: tác nhân vật lý, tác nhân hóa học và tác nhân sinh học

1.2.2.1 Tác nhân vật lý

a) Nhiệt độ

Ở nhiệt độ thấp, việc tăng nhiệt độ sẽ làm tăng tốc độ phản ứng xúc tác của enzym cho tới một mức độ nhất định Sau đó, tăng nhiệt độ sẽ làm tăng cả tốc độ và mức độ mất hoạt tính của enzym

Với alpha chymotrypsin, khi trong đệm phosphat pH 7,0, enzym có hoạt tính cao nhất ở khoảng 40oC và mất hoàn toàn hoạt tính khi tăng nhiệt độ tới 50-60oC [19]

b) Lực cơ học

Lực cơ học là tác nhân gây mất hoạt tính này thường gặp trong quá trình dập viên Bên cạnh việc cung cấp năng lượng để hình thành các liên kết cần thiết tạo thành viên, việc tác động lực còn gây ra biến dạng cấu trúc của phân tử enzym Ngoài ra, trong thời điểm dập, động năng chuyển hóa nhanh chóng thành nhiệt năng cũng gây phá vỡ cấu trúc của phân tử enzym [29] Lực dập và tốc độ dập càng lớn, hoạt tính của enzym mất trong quá trình dập viên càng nhiều [28][29]

hoạt bởi ánh sáng [3] Do đó người ta thường bảo quản alpha-chymotrypsin và các chế phẩm của nó trong điều kiện tránh ánh sáng [37]

- Tuy nhiên, sự có mặt của nước là điều kiện thuận lợi cho phản ứng thủy phân, ACT trong dung dịch sẽ mất hoạt tính nhanh chóng do phản ứng tự thủy phân các liên kết peptid Sự có mặt của nước cũng làm tăng ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ ổn định của enzym [13] Ngoài ra, nước cũng là môi trường thuận lợi cho sự phát triển của các vi sinh vật Chính vì các lý do này mà người ta thường tìm cách loại nước và hạn chế sự tiếp xúc với ẩm của alpha-chymotrypsin và các chế phẩm của nó

 Dung môi hữu cơ

Sự có mặt của các dung môi hữu cơ sẽ làm giảm hoạt tính và độ ổn định của enzym Tuy chỉ cần một lượng rất nhỏ nước để tạo lớp áo nước duy trì cấu trúc của phân tử enzym, nhưng nếu thêm dung môi hữu cơ vào dung dịch thì enzym sẽ mất hoạt tính nhanh chóng Điều này có thể giải thích do các phân tử dung môi hữu cơ sẽ tương tác với các liên kết hydro giữa enzym và nước, làm biến đổi cấu trúc tự nhiên của enzym, do đó làm giảm hoạt tính và độ ổn định của chúng [18]

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của pH đến trạng thái của alpha-chymotrypsin [18]

< 2 Có khoảng 7% tổng số phân tử protein mất cấu trúc không gian

2 Alpha chymotrypsin không hòa tan một phần ở mọi nhiệt độ

3 Enzym bị bất hoạt thuận nghịch và có độ ổn định cao nhất [7]

3,5 – 5,5 Các phân tử ACT bị dimer hóa

7,5 – 8,0 Các phân tử ACT tồn tại dưới dạng monomer và thể hiện hoạt tính cao

nhất

>8,5 Hoạt tính enzym giảm rất nhanh theo sự tăng pH

Sự bất hoạt do tăng pH thấp hơn so với tăng nhiệt độ Hoạt tính bị mất do tăng

10oC lớn hơn rất nhiều so với tăng pH lên 1 đơn vị [19]

Hình 1.4 Ảnh hưởng của pH đến α-chymotrypsin ở 40oC (A) Sự mất hoạt tính ở pH 6,0

(□), 6,5 (●), 7,0 (▲),7,5 (○) và 8,0 (■) (B) Ảnh hưởng pH đến hoạt tính xúc tác của chymotrypsin ở 40 o C [19]

α-Ngoài ra, pH trong một số trường hợp còn xúc tác cho quá trình oxy hóa, làm giảm độ ổn định của enzym [3]

Do đó, việc lựa chọn khoảng pH thích hợp với từng loại enzym là rất quan trọng

để đảm bảo độ ổn định

c) Ảnh hưởng của các chất oxy hóa

Oxy hóa là một trong những nguyên nhân phổ biến nhất gây nên biến tính protein Các amino acid thường bị ảnh hưởng nhiều nhất là các acid amin có chứa lưu huỳnh (Cys và Met) và các acid amin có nhân thơm (His, Tyr và Tryp) Trong phân

tử ACT có các amino acid nhạy cảm này nên dễ bị ảnh hưởng bởi các chất oxy hóa

Sự oxy hóa có thể xảy ra tự phát hoặc do xúc tác là các ion kim loại hoặc pH [3] Vì vậy, các chế phẩm của ACT thường được đóng chân không (với thuốc tiêm) và được chứa trong các bao bì không thấm khí (với viên nén và bột)

d) Ảnh hưởng của các ion

Ảnh hưởng của ion đối với enzym rất phức tạp Có một số ion làm ổn định và tăng hoạt tính của ACT như Ca2+ nhưng nhiều ion lại gây mất hoạt tính enzym

Để đánh giá ảnh hưởng đến độ ổn định của enzym, các ion được phân loại theo dãy Hofmeister:

Anion: F- ~ SO42- > HPO42- > acetat> Cl- > NO3- > Br - > ClO3- > I- > ClO4- > SCN-

Cation: NH4+ > K+ > Na+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > urea > guanidin+

- Muối được tạo bởi các ion đầu dãy được gọi là “muối ngoại” Các ion “muối ngoại”

sẽ tương tác với các phân tử nước, làm các liên kết protein-nước trở nên yếu hơn các liên kết protein-protein, khi đó, các phân tử protein sẽ đông tụ lại với nhau nhưng không ảnh hưởng tới hoạt tính enzym Người ta thường lợi dụng tính chất này để tách enzym ra khỏi tạp tan trong nước

- Muối được tạo bởi các ion cuối dãy được gọi là “muối nội” Các ion này làm yếu

đi các liên kết nước-nước, do đó làm các phân tử nước trở nên linh hoạt hơn Các ion này còn tương tác với các khung peptid và các nhóm không phân cực trong phân tử protein làm các nhóm này trở nên dễ tan hơn, do đó làm thay đổi cấu trúc ban đầu của protein Ngoài ra, các ion này sẽ bám lên bề mặt của enzym và cản trở hoạt động

và làm mất hoạt tính của các phân tử này [5][18]

- Chính vì các lý do trên, việc loại bỏ hoặc thêm các ion thích hợp cần được cân nhắc

và khảo sát kỹ lưỡng để duy trì độ ổn định tối đa cho enzym

1.2.2.3 Các tác nhân sinh học

a) Các protease

Các protease là các enzym xúc tác cho quá trình thủy phân các liên kết peptid của alpha-chymotrypsin làm giảm độ ổn định Do cũng là một protease, điều này cũng

xảy ra với chính trường hợp của alpha-chymotrypsin Vì vậy, enzym thường được tinh chế để loại bỏ các tạp, đặc biệt là tạp protease và được tách ra khỏi môi trường thuận lợi cho phản ứng tự thủy phân (loại nước và bảo quản ở nhiệt độ thấp)

b) Vi sinh vật

Trong quá trình bảo quản, vi sinh vật và nấm mốc là yếu tố ảnh hưởng rất lớn tới độ ổn định của một dược chất nhạy cảm như alpha-chymotrypsin

1.2.3 Các phương pháp cải thiện độ ổn định của enzym

Nghiên cứu cái thiện độ ổn định của protein là một hướng nghiên cứu nhận được rất nhiều quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới Mục đích chung của hướng nghiên cứu này là duy trì cấu trúc tự nhiên của enzym dưới sự tác động của các tác nhân gây bất hoạt Đã có rất nhiều hướng tiếp cận khác nhau được sử dụng và mang lại hiệu quả đáng kể Một số phương pháp chính để cái thiện độ ổn định của alpha-chymotrypsin được liệt kê trong bảng 1.4

Bảng 1.4 Các phương pháp cải thiện độ ổn định của alpha-chymotrypsin

Biến đổi về mặt

hóa học

- Tạo liên kết đồng hóa trị với poly(ethylen glycol) [8]

- Tạo các liên kết glycosylation [13][35]

- Gắn thêm các gốc thân nước trên bề mặt phân tử để tăng tính thân nước [12][23]

Cố định enzym

trong các hệ bảo

vệ

- Đưa ACT vào trong hệ polyme silicon [33]

- Đưa ACT vào vi cầu poly(lactic-co-glycolic) [8]

- Cố định ACT trong gel poly-acrylamid bằng cách tạo các liên kết đa điểm [24]

- Cố định ACT trong micell anthraniloyl [11]

Loại nước - Đông khô [3][10][38]

- Thêm các muối: Ca2+, “muối nội” [18][21][28]

- Tá dược ổn định về lực: Các tá dược có khả năng biến dạng đàn hồi như carragenan, chitosan,…[27][28][29]

- Các tá dược làm tăng độ tan: chất diện hoạt,…[18]

 Các hướng tiếp cận để cải thiện độ ổn định của alpha-chymotrypsin trên thế giới rất đa dạng Tuy nhiên, để phù hợp với thiết bị và hóa chất hiện có nên chúng tôi định hướng sử dụng phương pháp đông khô và thêm tá dược để cải thiện độ ổn định của viên nén alpha-chymotrypsin

1.3 Đại cương về đông khô

1.3.1 Khái niệm

Đông khô là quá trình làm khô chế phẩm trong các điều kiện đặc biệt, trong đó chế phẩm được đông lạnh và được loại dung môi sau đó bằng cách thăng hoa trực tiếp (giai đoạn làm khô sơ cấp) và giải hấp phụ (giai đoạn làm khô thứ cấp) để ngăn chặn các phản ứng hóa học và sự phát triển của vi sinh vật từ đó tăng độ ổn định của chế phẩm [10] [16]

1.3.2 Ảnh hưởng của các giai đoạn đông khô tới hoạt tính enzym

Hình 1.5 Các giai đoạn của quá trình đông khô

1.3.2.1 Giai đoạn đông lạnh

Trong giai đoạn này, dung môi (thường là nước) sẽ chuyển từ pha lỏng sang pha rắn, tạo thành các tinh thể băng Các chất tan được tách ra và phân bố vào khoảng trống giữa các tinh thể đó [16][26][31]

Thông số chính ảnh hưởng tới hoạt tính của protein trong giai đoạn này là tốc

độ làm lạnh Tốc độ làm lạnh nhanh sẽ dẫn tới tăng tốc độ lớn lên của các tinh thể băng [16] Điều này dẫn tới tăng diện tích bề mặt phân cách pha nước-băng, dễ gây biến tính các protein có mặt trong hệ [38] Ngược lại, nếu tốc độ làm lạnh chậm, thời

gian protein tồn tại trong trạng thái dung dịch kéo dài, dễ làm ảnh hưởng tới độ ổn định của hoạt chất

Để khắc phục hiện tượng hoạt tính enzym bị mất trong quá trình đông lạnh, người ta thường bổ sung các tá dược ổn định về mặt nhiệt lạnh (cryoprotectants): sucrose, propylen glycol, glycerol,…

1.3.2.2 Giai đoạn làm khô sơ cấp

Trong giai đoạn này, dung môi sẽ được thăng hoa trực tiếp từ pha rắn sang pha hơi bằng cách hạ áp suất của buồng đông khô xuống thấp hơn áp suất hơi của dung môi Bằng cách đó, phần dung môi không liên kết sẽ được tách ra khỏi sản phẩm Tốc

độ thăng hoa của nước đá được tính theo công thức:

𝑑𝑚

𝑑𝑡 =

𝑃𝑖𝑐𝑒− 𝑃𝑐

𝑅𝑝+ 𝑅𝑠Trong đó:

dm/dt: Tốc độ thăng hoa nước đá (g/cm2/giờ)

Pice: Áp suất hơi bão hòa của nước đá tại nhiệt độ của buồng đông khô (mmHg)

Pc: Áp suất của buồng đông khô (mmHg)

Rp: Hệ số cản trở thăng hoa của sản phẩm

Rs: Hệ số cản trở thăng hoa của nắp

Các yếu tố chính ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym trong quá trình này: Áp suất buồng đông khô, nhiệt độ làm khô, thời gian làm khô

- Áp suất buồng đông khô càng thấp, tốc độ thăng hoa của dung môi càng nhanh

nhưng áp suất quá thấp có thể gây nhiễm các tạp dễ bay hơi từ bao bì và thiết bị vào chế phẩm Áp suất buồng đông khô càng cao, hiệu suất quá trình làm khô sơ cấp càng giảm Nếu lượng dung môi không liên kết chưa được loại hết thì sẽ dẫn tới hiện tượng phá vỡ cấu trúc khi chuyển sang giai đoạn sấy thứ cấp Điều này ảnh hưởng tới hàm

ẩm và độ ổn định lâu dài của chế phẩm

- Nhiệt độ làm khô càng cao thì Pice càng tăng, hiệu suất quá trình sấy sơ cấp càng tăng Tuy nhiên, nếu nhiệt độ làm khô lớn hơn nhiệt độ chuyển kính Tg (hệ vô định

hình) hoặc nhiệt độ eutecti Teu (hệ kết tinh) sẽ dẫn tới hiện tượng vỡ cấu trúc của hệ Kết quả là hàm ẩm tăng và giảm độ ổn định của chế phẩm

- Thời gian làm khô không đủ để loại phần dung môi không liên kết cũng dẫn tới phá

vỡ cấu trúc của hệ khi chuyển sang giai đoạn làm khô thứ cấp

1.3.2.3 Giai đoạn làm khô thứ cấp

Trong giai đoạn này, phần dung môi liên kết với dược chất sẽ được loại bỏ bằng cách tiếp tục nâng nhiệt độ của buồng đông khô trong điều kiện áp suất thấp Các yếu

tố cần quan tâm đến trong giai đoạn này là: Nhiệt độ làm khô và thời gian làm khô Nhiệt độ làm khô phải đảm bảo loại được phần nước liên kết nhưng không được ảnh hưởng tới hoạt tính enzym Thời gian làm khô cũng phải đủ dài để chế phẩm đạt được hàm ẩm cần thiết để duy trì độ ổn định lâu dài

 Ngoài ra, cả 2 quá trình làm khô cũng ảnh hưởng tới cấu trúc của protein do làm mất lớp áo nước bên ngoài phân tử Để khắc phục hiện tượng này, người ta thường thêm các tá dược ổn định (lyoprotectants): manitol, trehalose, sucrose,…

1.3.3 Các nghiên cứu ứng dụng phương pháp đông khô để tăng độ ổn định của các chế phẩm sinh học

Phương pháp đông khô đang được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về các chế phẩm có nguồn gốc sinh học gần đây Đông khô có thể được sử dụng độc lập hoặc phối hợp với một số phương pháp khác để cải thiện độ ổn định của chế phẩm Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp đông khô trong những năm gần đây được liệt kê trong bảng 1.5

Bảng 1.5 Các nghiên cứu ứng dụng phương pháp đông khô để tăng độ ổn định của chế phẩm sinh học trong những năm gần đây

Mẫu đông khô có các đặc tính vượt trội:

- Thể tích bảo quản giảm 2-3 lần

- Có khả năng duy trì được đặc tính sinh học cao hơn trong điều kiện nhiệt độ 4oC và nhiệt độ phòng

- Hạn chế hiện tượng nhiễm vi sinh vật

Việc sử dụng sucrose không cho sự khác biệt

2014 [34]

- OPH đông khô cải thiện độ ổn định của enzym tuy nhiên ở mức dưới 45% hoạt tính ban đầu sau 3 tháng

- Mục đích đông khô OPH-F127 để giảm thể tích vận chuyển và tăng

độ ổn định dài hạn của chế phẩm

2014 [36]

Kháng nguyên

ovalbumin (OVA)

- Ovalbumin được hấp phụ vào trong

mesoporous silica nanoparticle có nhóm chức amino (AM-41) tạo thành phức hợp OVA-41

- Mẫu sử dụng 20%

trehalose có cấu trúc giống như tuyết ở phần trên của bánh đông khô;

mẫu sử dụng 1% PEG

8000 bị co thể tích 50%;

2014 [22]

-Phức hợp được đông khô không sử dụng tá dược,

sử dụng 20% trehalose hoặc 1% PEG 8000 hoặc 5% trehalose+ 1% PEG

8000

-Đông lạnh mẫu trong nitơ lỏng và làm khô ở nhiệt độ 24oC, áp suất 0,1 mBar trong 17h

trehalose và 1% PEG

8000 có thể chất tốt và không có hiện tượng vỡ cấu trúc

- OVA bị biến tính khi đông khô không sử dụng

tá dược và duy trì được hoạt tính khi sử dụng các

tá dược

Tiểu phân nano protein

huỳnh quang xanh lục

80 và 5% (kl/kl) sucrose

- Mẫu được đông lạnh từ

từ xuống nhiệt độ -80oC trong 3 giờ, làm khô sơ cấp ở -10oC trong 1 giờ, làm khô thứ cấp ở 20oC trong 5 giờ

- Mẫu đông khô duy trì được 80% hoạt tính sinh học sau 4 tuần ở nhiệt độ

25oC và 37oC trong khi mẫu không đông khô chỉ duy trì được ở mức 40%

- Các mẫu sử dụng tá dược duy trì được hình dạng cầu của nano trong

4 tuần và chỉ có mẫu sử dụng sucrose và Tween

80 duy trì được hình dạng sau 10 tuần

2011 [17]

Alpha - chymotrypsin

- Tạo liên kết glycosylation với dextran

và lactose hoạt hóa mDEX và SS-mLAC)

(SS Đông khô sản phẩm thu được

-Sản phẩm thu được sau đông khô cải thiện được

độ ổn định của enzym với tác động của ẩm

2010 [13]

 Từ các nghiên cứu trên ta thấy phương pháp đông khô có hiệu quả rất tốt trong việc ổn định cấu trúc và hoạt tính của protein khi dùng độc lập cũng như phối hợp với các phương pháp khác Chính vì lý do trên, chúng tôi sử dụng phương pháp đông khô kết hợp với một số biện pháp khác để cải thiện độ ổn định của chế phẩm viên nén

alpha-chymotrypsin

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu

19 Lọ thủy tinh, nút cao su, nút nhôm Trung Quốc Nhà sản xuất

2.1.2 Thiết bị

- Máy đông khô Freezone Triad 740030

- Máy quang phổ SHIMADZU UV 2600, HITACHI U180

- Máy dập viên thủy lực PYE UNICAM, máy dập viên tâm sai KORSCH EKO.

- Máy đo pH: EUTECH PH 510

- Tủ vi khí hậu CLIMACEL

- Máy hút ẩm Edison ED-12B

- Cân phân tích, cân kỹ thuật SARTORIUS

- Máy xác định hàm ẩm nhanh SARTORIUS

- Máy đo lực gây vỡ viên ERWEKA

2.2 Nội dung nghiên cứu

 Xây dựng công thức và quy trình bào chế bột đông khô alpha chymotrypsin

 Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố thành phần công thức (bột đông khô, tá dược

ổn định, tá dược độn, bao bì) và quy trình đến độ ổn định của viên nén chứa bột đông khô alpha-chymotrypsin

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế

2.3.1.1 Phương pháp bào chế bột đông khô alpha-chymotrypsin

Qua tham khảo tài liệu kết hợp với một số khảo sát sơ bộ, bột đông khô (BĐK) alpha chymotrypsin được tiến hành bào chế theo công thức cơ bản như sau:

Đo và điều chỉnh pH

Làm khô

Kiểm nghiệm chất lượng

Kiểm soát điều kiện môi trường (Nhiệt độ 25oC, hàm ẩm 40%)

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình bào chế bột đông khô alpha - chymotrypsin

 Mô tả quy trình:

Kiểm soát điều kiện môi trường (nhiệt độ 25oC, hàm ẩm 40%) bằng các thiết bị điều hòa nhiệt độ TOSHIBA và máy hút ẩm EDISON ED-12B trước khi tiến hành pha chế

Cân dược chất và tá dược theo tỷ lệ đã định

Hòa tan tá dược vào khoảng 80% thể tích dung môi có trong công thức Siêu

âm ở nhiệt độ phòng trong 15 phút cho tá dược tan hoàn toàn Điều chỉnh pH nếu cần thiết

Hòa tan ACT vào dung dịch, bổ sung dung môi vừa đủ Lọc dung dịch qua màng lọc thô (loại bỏ 20 ml dịch lọc đầu)

Đóng 3-5 mldung dịch vào lọ thủy tinh đã xử lý, đậy hờ bằng nút cao su có xẻ rãnh ở phần dưới nút, đặt lọ vào buồng đông lạnh của thiết bị đông khô

Tiến hành chạy chương trình đông khô với các thông số quá trình:

- Giai đoạn đông lạnh: Làm đông đặc mẫu ở nhiệt độ -65oC duy trì trong 3 giờ

- Giai đoạn làm khô sơ cấp: Tăng dần nhiệt độ của mẫu lên -15oC với tốc độ 0,25oC/phút Duy trì trong 24 giờ ở áp suất 0,45 mBar

- Giai đoạn làm khô thứ cấp: Tăng dần nhiệt độ của mẫu lên 25oC với tốc độ 0,5oC/phút Duy trì trong 24h giờ ở ấp suất 0,45 mBarr

Kết thúc chu trình, đóng nút trong buồng đông khô Lấy sản phẩm, đóng nắp nhôm

Kiểm tra chất lượng của bột đông khô (về cảm quan, hình thức, hàm ẩm và hoạt tính còn lại) như trình bày ở mục 2.3.2

Tá dược trơn chảy

Rây

Kiểm soát điều kiện môi trường: Nhiệt độ 25oC Hàm ẩm 40 %

Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình bao chế viên nén alpha-chymotrypsin

Ép vỉ

Tá dược độn Trộn bột kép

- Thực hiện trộn đồng lượng dược chất và tá dược

- Dập viên trên máy dập viên tâm sai với bộ chày cối có đường kính là 7 mm, khối lượng trung bình viên là 140 ± 10 mg, độ cứng 6-8 kP

- Ép vỉ

- Kiểm nghiệm thành phẩm

2.3.2 Phương pháp đánh giá

2.3.2.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính của alpha-chymotrypsin

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp định lượng bằng phương pháp đo quang theo tiêu chuẩn dược điển Mỹ USP 37

ấm Khi dung dịch nguội, pha loãng bằng dung dịch đệm pH 7,0 cho tới vừa đủ 100

ml Lưu ý có thể bảo quản đông lạnh cơ chất và sử dụng sau khi rã đông nhưng phải bảo quản ngay sau khi pha

- Dung dịch thử:

Đối với alpha-chymotrypsin: Cân chính xác một lượng alpha-chymotrypsin hòa tan trong dung dịch acid hydrocloric 0,0012 N để thu được dung dịch chứa từ 12-16 đơn vị USP chymotrypsin/ml

Đối với bột đông khô: Cân chính xác một lượng bột đông khô thích hợp hòa tan trong dung dịch acid hydrocloric 0,0012 N để thu được dung dịch chứa từ 12-16 đơn

vị USP chymotrypsin/ml

Đối với viên nén: Cân chính xác 20 viên, tính khối lượng trung bình và nghiền mịn Cân chính xác một lượng bột viên thích hợp hòa tan trong dung dịch acid hydrocloric 0,0012 N để thu được dung dịch chứa từ 12-16 đơn vị USP chymotrypsin/ml

Dùng dung dịch có nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn (nếu cần) để trong quá trình định lượng sự thay đổi độ hấp thụ trong khoảng từ 0,008-0,012 sau mỗi 30s

b) Cách tiến hành

- Lưu ý: Xác định sự thích hợp của cơ chất và kiểm tra sự điều chỉnh của máy quang phổ tử ngoại bằng cách tiến hành sử dụng alpha chymotrypsin chuẩn thay thế cho mẫu thử

- Định lượng bằng máy quang phồ tử ngoại thích hợp có hệ thống điều nhiệt để duy trì nhiệt độ buồng chứa cốc đo ở 25 ± 0,1oC Xác định nhiệt độ cốc đo trước và sau khi xác định độ hấp thụ để đảm bảo nhiệt độ không thay đổi quá 0,5oC

- Hút chính xác 0,2 ml dung dịch acid hydrocloric 0,0012 N và 3,0 ml dung dịch cơ chất

vào cốc đo dày 1 cm Đặt cốc đo vào máy quang phổ tử ngoại và điều chỉnh thiết bị

để có độ hấp thụ là 0,200 ở 237 nm

- Hút chính xác 0,2 ml dung dịch thử cho vào cốc đo dày 1 cm, thêm chính xác 3,0

ml dung dịch cơ chất Đặt cốc đo vào máy quang phổ tử ngoại (Chú ý: Thực hiện

thêm mẫu vào cốc đo đúng theo thứ tự này, và bắt đầu ghi thời gian phản ứng ngay sau khi thêm dung dịch cơ chất)

- Đo độ hấp thụ sau mỗi 30 giây trong ít nhất 5 phút Lặp lại thí nghiệm cùng độ pha loãng ít nhất một lần Giá trị tuyệt đối của độ hấp thụ ít quan trọng bằng tốc độ suy giảm không đổi của độ hấp thụ Nếu tốc độ suy giảm không đổi của độ hấp thụ này không đạt được trong khoảng thời gian ít hơn 3 phút, phải làm lại thí nghiệm, nếu cần, sử dụng dung dịch thử có nồng độ thích hợp Khi xác định lại lần thứ hai các dung dịch thử có cùng độ pha loãng phải có tốc độ suy giảm của độ hấp thụ như lần đầu

- Để xác định sự thay đổi độ hấp thụ trung bình trong mỗi phút, chỉ sử dụng các giá trị nằm trên đường biểu diễn sự suy giảm độ hấp thụ theo thời gian, đoạn có tốc độ suy giảm độ hấp thụ không đổi trong 3 phút

- Một đơn vị chymotrypsin USP là hoạt tính làm thay đổi độ hấp thụ là 0,0075 trong mỗi phút với các điều kiện quy định của phương pháp định lượng này

- Số đơn vị alpha-chymotrypsin USP/1mg tính theo công thức sau:

𝑋 = 𝐴2− 𝐴10,0075 𝑇 𝑊X: Số đơn vị alpha-chymotrypsin trong 1 mg bột (đơn vị USP)

A2: Độ hấp thụ đầu

A1: Độ hấp thụ cuối

T: Khoảng thời gian giữa điểm hấp thụ đầu và điểm hấp thụ cuối (phút)

W: khối lượng bột trong thể tích dung dịch đo độ hấp thụ (mg)

2.3.2.2 Phương pháp đánh giá bột đông khô alpha-chymotrypsin

c) Đánh giá hoạt tính của bột đông khô

Thực hiện như trong mục 2.3.2.1

d) Đánh giá độ trơn chảy của khối bột

Do lượng bột đông khô thu được tương đối nhỏ nên chúng tôi tiến hành đánh giá độ trơn chảy bằng phương pháp đo góc nghỉ theo tiêu chuẩn BP 2013

- Tiến hành với các loại bột: Bột đông khô, bột đông khô trộn với tá dược độn (isomalt, tá dược C, Avicel, carrageenan) vừa đủ, bột đông khô + 1% magnesi stearat + tá dược độn vừa đủ