Xây dựng công thức và quy trình bào chế bột đông khô alpha chymotrypsin.
Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố thành phần công thức (bột đông khô, tá dược ổn định, tá dược độn, bao bì) và quy trình đến độ ổn định của viên nén chứa bột đông khô alpha-chymotrypsin.
2.3. Phương pháp nghiên cứu.
2.3.1. Phương pháp bào chế.
2.3.1.1. Phương pháp bào chế bột đông khô alpha-chymotrypsin.
Qua tham khảo tài liệu kết hợp với một số khảo sát sơ bộ, bột đông khô (BĐK) alpha chymotrypsin được tiến hành bào chế theo công thức cơ bản như sau:
Alpha chymotrypsin………..5mg. Tá dược………..vừa đủ. Dung môi………...vừa đủ 5ml.
Quy trình bào chế:
Hòa tan tá dược vào dung môi
Đông lạnh Điều chỉnh đủ thể tích
Hòa tan dược chất Đo và điều chỉnh pH
Làm khô
Kiểm nghiệm chất lượng
Kiểm soát điều kiện môi trường
(Nhiệt độ 25oC,
hàm ẩm 40%)
Mô tả quy trình:
Kiểm soát điều kiện môi trường (nhiệt độ 25oC, hàm ẩm 40%) bằng các thiết bị điều hòa nhiệt độ TOSHIBA và máy hút ẩm EDISON ED-12B trước khi tiến hành pha chế.
Cân dược chất và tá dược theo tỷ lệ đã định.
Hòa tan tá dược vào khoảng 80% thể tích dung môi có trong công thức. Siêu âm ở nhiệt độ phòng trong 15 phút cho tá dược tan hoàn toàn. Điều chỉnh pH nếu cần thiết.
Hòa tan ACT vào dung dịch, bổ sung dung môi vừa đủ. Lọc dung dịch qua màng lọc thô (loại bỏ 20 ml dịch lọc đầu).
Đóng 3-5 mldung dịch vào lọ thủy tinh đã xử lý, đậy hờ bằng nút cao su có xẻ rãnh ở phần dưới nút, đặt lọ vào buồng đông lạnh của thiết bị đông khô.
Tiến hành chạy chương trình đông khô với các thông số quá trình:
- Giai đoạn đông lạnh: Làm đông đặc mẫu ở nhiệt độ -65oC duy trì trong 3 giờ - Giai đoạn làm khô sơ cấp: Tăng dần nhiệt độ của mẫu lên -15oC với tốc độ 0,25oC/phút. Duy trì trong 24 giờ ở áp suất 0,45 mBar.
- Giai đoạn làm khô thứ cấp: Tăng dần nhiệt độ của mẫu lên 25oC với tốc độ 0,5oC/phút. Duy trì trong 24h giờ ở ấp suất 0,45 mBarr.
Kết thúc chu trình, đóng nút trong buồng đông khô. Lấy sản phẩm, đóng nắp nhôm.
Kiểm tra chất lượng của bột đông khô (về cảm quan, hình thức, hàm ẩm và hoạt tính còn lại) như trình bày ở mục 2.3.2.
2.3.1.2. Phương pháp dập viên
Qua tham khảo tài liệu kết hợp với một số khảo sát sơ bộ, viên nén alpha chymotrypsin sẽ được bào chế theo công thức (cho 1 viên):
ACT hoặc BĐK…………... ……….. 4200 đơn vị USP. Tá dược………vừa đủ 140 mg.
Quy trình bào chế:
Mô tả quy trình:
- Kiểm soát điều kiện môi trường (nhiệt độ 25oC, hàm ẩm 40 %) trước khi tiến hành dập viên.
- Cân dược chất và tá dược theo tỷ lệ đã định. Rây dược chất và tá dược trơn qua rây 180 µm. Alpha chymotrypsin (Nguyên liệu/ Bột đông khô) Rây Trộn đồng lượng Dập viên Ghi nhãn sản phẩm Kiểm nghiệm thành phẩm Tá dược trơn chảy
Rây
Kiểm soát điều kiện môi trường: Nhiệt độ 25oC Hàm ẩm 40 %
Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt quy trình bao chế viên nén alpha-chymotrypsin. Ép vỉ
- Thực hiện trộn đồng lượng dược chất và tá dược.
- Dập viên trên máy dập viên tâm sai với bộ chày cối có đường kính là 7 mm, khối lượng trung bình viên là 140 ± 10 mg, độ cứng 6-8 kP.
- Ép vỉ.
- Kiểm nghiệm thành phẩm.
2.3.2. Phương pháp đánh giá.
2.3.2.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính của alpha-chymotrypsin
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp định lượng bằng phương pháp đo quang theo tiêu chuẩn dược điển Mỹ USP 37.
a)Chuẩn bị
- Dung dịch đệm phosphat pH 7,0:
Hòa tan 4,54 g kali dihydro phosphat vào nước thành 500 ml dung dịch A. Hòa tan 4,73 g dinatri hydrophosphat khan vào nước thành 500 ml dung dịch B. Trộn 38,9 ml dung dịch A với 61,1 ml dung dịch B. Điều chỉnh tới pH 7,0 bằng cách thêm nhỏ giọt dung dịch dinatri hydro phosphat (nếu cần).
- Dung dịch cơ chất:
Hòa tan 23,7 mg cơ chất N-acetyl-L-tyrosin ethyl este (loại thích hợp để định lượng alpha chymotrypsin) trong khoảng 50 ml dung dịch đệm pH 7,0 bằng cách làm ấm. Khi dung dịch nguội, pha loãng bằng dung dịch đệm pH 7,0 cho tới vừa đủ 100 ml. Lưu ý có thể bảo quản đông lạnh cơ chất và sử dụng sau khi rã đông nhưng phải bảo quản ngay sau khi pha.
- Dung dịch thử:
Đối với alpha-chymotrypsin: Cân chính xác một lượng alpha-chymotrypsin hòa tan trong dung dịch acid hydrocloric 0,0012 N để thu được dung dịch chứa từ 12-16 đơn vị USP chymotrypsin/ml.
Đối với bột đông khô: Cân chính xác một lượng bột đông khô thích hợp hòa tan trong dung dịch acid hydrocloric 0,0012 N để thu được dung dịch chứa từ 12-16 đơn vị USP chymotrypsin/ml.
Đối với viên nén: Cân chính xác 20 viên, tính khối lượng trung bình và nghiền mịn. Cân chính xác một lượng bột viên thích hợp hòa tan trong dung dịch acid hydrocloric 0,0012 N để thu được dung dịch chứa từ 12-16 đơn vị USP chymotrypsin/ml.
Dùng dung dịch có nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn (nếu cần) để trong quá trình định lượng sự thay đổi độ hấp thụ trong khoảng từ 0,008-0,012 sau mỗi 30s.
b) Cách tiến hành
- Lưu ý: Xác định sự thích hợp của cơ chất và kiểm tra sự điều chỉnh của máy quang phổ tử ngoại bằng cách tiến hành sử dụng alpha chymotrypsin chuẩn thay thế cho mẫu thử.
- Định lượng bằng máy quang phồ tử ngoại thích hợp có hệ thống điều nhiệt để duy trì nhiệt độ buồng chứa cốc đo ở 25 ± 0,1oC. Xác định nhiệt độ cốc đo trước và sau khi xác định độ hấp thụ để đảm bảo nhiệt độ không thay đổi quá 0,5oC.
- Hút chính xác 0,2 ml dung dịch acid hydrocloric 0,0012 N và 3,0 ml dung dịch cơ chất
vào cốc đo dày 1 cm. Đặt cốc đo vào máy quang phổ tử ngoại và điều chỉnh thiết bị để có độ hấp thụ là 0,200 ở 237 nm.
- Hút chính xác 0,2 ml dung dịch thử cho vào cốc đo dày 1 cm, thêm chính xác 3,0 ml dung dịch cơ chất. Đặt cốc đo vào máy quang phổ tử ngoại (Chú ý: Thực hiện thêm mẫu vào cốc đo đúng theo thứ tự này, và bắt đầu ghi thời gian phản ứng ngay sau khi thêm dung dịch cơ chất).
- Đo độ hấp thụ sau mỗi 30 giây trong ít nhất 5 phút. Lặp lại thí nghiệm cùng độ pha loãng ít nhất một lần. Giá trị tuyệt đối của độ hấp thụ ít quan trọng bằng tốc độ suy giảm không đổi của độ hấp thụ. Nếu tốc độ suy giảm không đổi của độ hấp thụ này không đạt được trong khoảng thời gian ít hơn 3 phút, phải làm lại thí nghiệm, nếu cần, sử dụng dung dịch thử có nồng độ thích hợp. Khi xác định lại lần thứ hai các dung dịch thử có cùng độ pha loãng phải có tốc độ suy giảm của độ hấp thụ như lần đầu
- Để xác định sự thay đổi độ hấp thụ trung bình trong mỗi phút, chỉ sử dụng các giá trị nằm trên đường biểu diễn sự suy giảm độ hấp thụ theo thời gian, đoạn có tốc độ suy giảm độ hấp thụ không đổi trong 3 phút.
- Một đơn vị chymotrypsin USP là hoạt tính làm thay đổi độ hấp thụ là 0,0075 trong mỗi phút với các điều kiện quy định của phương pháp định lượng này.
- Số đơn vị alpha-chymotrypsin USP/1mg tính theo công thức sau:
𝑋 = 𝐴2− 𝐴1 0,0075. 𝑇. 𝑊
X: Số đơn vị alpha-chymotrypsin trong 1 mg bột (đơn vị USP). A2: Độ hấp thụ đầu.
A1: Độ hấp thụ cuối.
T: Khoảng thời gian giữa điểm hấp thụ đầu và điểm hấp thụ cuối (phút). W: khối lượng bột trong thể tích dung dịch đo độ hấp thụ (mg).
2.3.2.2.. Phương pháp đánh giá bột đông khô alpha-chymotrypsin a) Hình thức, cảm quan
- Bột đông khô alpha – chymotrypsin phải đảm bảo các yêu cầu về thể chất bánh thuốc, tốc độ tan, độ trong của dung dịch tạo thành.
b) Phương pháp xác định hàm ẩm
Phương pháp sấy khô: Tiến hành trên máy xác định hàm ẩm nhanh SATORIUS. Cân khoảng 1g bột đông khô / bột viên dàn đều trên đĩa cân, đặt nhiệt độ ở 105oC, theo dõi và đọc kết quả.
c) Đánh giá hoạt tính của bột đông khô
Thực hiện như trong mục 2.3.2.1.
d) Đánh giá độ trơn chảy của khối bột
Do lượng bột đông khô thu được tương đối nhỏ nên chúng tôi tiến hành đánh giá độ trơn chảy bằng phương pháp đo góc nghỉ theo tiêu chuẩn BP 2013.
- Tiến hành với các loại bột: Bột đông khô, bột đông khô trộn với tá dược độn (isomalt, tá dược C, Avicel, carrageenan) vừa đủ, bột đông khô + 1% magnesi stearat + tá dược độn vừa đủ.
- Thiết bị thí nghiệm như trong hình 2.3:
Hình 2.3. Cấu tạo thiết bị đo độ trơn chảy của khối bột.
- Lấy khoảng 1 g bột dàn đều thành một lớp mỏng trên mặt phẳng A. Phễu B đặt vuông góc với mặt phẳng A và cố định ở độ cao sao cho đáy phễu cách đỉnh khối bột < 4cm. Đường kính đáy phễu là 1 cm.
- Cho khoảng 10g bột chảy tự do qua phễu sao cho khối bột tạo thành có đỉnh. Đo góc nghỉ α là góc tạo bởi cạnh khối bột với mặt phẳng A.
- α được đo 3 lần và lấy giá trị trung bình.
- Khối bột cuối cùng đem dập thẳng cần có góc nghỉ <40o.
2.4.2.2. Phương pháp đánh giá viên nén alpha chymotrypsin a) Hình thức cảm quan
Viên rắn màu trắng, hai mặt nhẵn.
a)Độ cứng
Tiến hành đo trên 10 viên bằng máy đo lực gây vỡ viên ERWEKA, lấy kết quả trung bình.
b)Thời gian rã
Tiến hành đo thời gian rã của 6 viên ngẫu nhiên bằng máy thử độ rã. Viên đạt yêu cầu khi tất cả các viên có thời gian rã không quá 15 phút.
Cân riêng biệt 20 viên ngẫu nhiên, cân cả 20 viên tính khối lượng trung bình. Tính % chênh lệch giữa khối lượng từng viên so với khối lượng trung bình.
Viên đạt yêu cầu khi có không quá 2 viên có khối lượng vượt quá 7,5% khối lượng trung bình và không có đơn vị nào có khối lượng vượt quá 15% khối lượng trung bình [2].
d ) Hoạt tính của viên nén.
Hoạt tính của viên nén được xác định như trong mục 2.3.2.1
2.3.2.3. Phương pháp đánh giá độ ổn định của bột đông khô so với alpha- chymotrypsin.
a) Phương pháp đánh độ ổn định với chu trình nhiệt-lạnh.
Lấy khoảng 1g bột đông khô (BĐK) hoặc 1g alpha-chymotrypsin cho vào lọ thủy tinh đậy nút cao su và nắp nhôm. Đặt các mẫu vào trong điều kiện nhiệt độ 80oC trong 24 giờ, sau đó đó tiếp tục đặt các mẫu trên vào trong điều kiện nhiệt độ -20oC trong 24 giờ. Tiến hành 3 chu trình nhiệt-lạnh như trên. Đánh giá hoạt tính trước và sau chu trình. Hoạt tính còn lại của mẫu được tính theo công thức:
𝑋 =𝐴1
𝐴0× 100%
Trong đó:
X: Hoạt tính còn lại của ACT hoặc BĐK (%).
A1: Hoạt tính của ACT hoặc BĐK sau chu trình nhiệt lạnh (đơn vị USP/mg). Ao: Hoạt tính của ACT hoặc BĐK trước chu trình nhiệt lạnh (đơn vị USP/mg).
b) Phương pháp đánh giá độ ổn định với nhiệt-ẩm.
Lấy khoảng 1g ACT hoặc 1g BĐK dàn đều trên mặt kính đồng hồ. Đặt các mẫu vào trong điều kiện lão hóa cấp tốc: nhiệt độ 40 ± 2oC và hàm ẩm 75 ± 5% trong tủ vi khí hậu CLIMATE. Xác định lại hàm ẩm và hoạt tính còn lại của mỗi mẫu tại thời điểm ban đầu, sau lão hóa 1 ngày, 5 ngày và 3 tuần. Xây dựng đường biểu diễn động học quá trình bất hoạt enzym với ACT và BĐK.
Hoạt tính còn lại của ACT và BĐK được xác định theo công thức:
𝑋% =(100 − 𝐻𝑜) × 𝐴𝑡
X%: Hoạt tính còn lại của ACT hoặc BĐK.
At, Ao: Hoạt tính của ACT hoặc BĐK tại thời điểm t và thời điểm ban đầu. Ht, Ho: Hàm ẩm của ACT hoặc BĐK tại thời điểm t và thời điểm ban đầu.
c) Phương pháp đánh giá độ ổn định với lực dập.
Tiến hành dập viên theo công thức (1 viên 140 mg):
ACT hoặc BĐK………..………. 4200 đơn vị USP. Isomalt………..vừa đủ 140 mg.
trên máy dập thủy lực PYE Unicam với lực dập 1,5 T. Đánh giá hoạt tính trước và sau khi dập từ đó tính được hoạt tính còn lại của enzym theo công thức:
𝑋 =𝐴1
𝐴0× 100%
Trong đó:
X: Hoạt tính còn lại của ACT hoặc BĐK (%).
A1: Hoạt tính của ACT hoặc BĐK sau khi dập (đơn vị USP/mg). Ao: Hoạt tính của ACT hoặc BĐK trước khi dập (đơn vị USP/mg).
2.3.2.4. Đánh giá độ ổn định của viên nén chứa bột đông khô
Đánh giá 3 lô, mỗi lô 500 viên, ép vỉ PVC-nhôm và đánh giá lại hoạt tính, cảm quan, hàm ẩm, độ cứng, độ rã của các lô sau khi lão hóa trong điều kiện lão hóa cấp tốc 40 ± 2oC, hàm ẩm 75 ± 5% tại các thời điểm 0 ngày, 5 ngày, 7 ngày và 12 ngày.
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN