ĐẶT VẤN ĐỀCùng với sự phát triển của Y học hiện đại, Y học cổ truyền cũng ngày càngđóng vai trò quan trọng trong việc phòng và chữa bệnh. Các thuốc có nguồn gốcthiên nhiên của Y học cổ truyền có nhiều ưu điểm, đó là nguồn nguyên liệu có thểtự trồng trọt, tự khai thác, ít tác dụng phụ, tương đối an toàn khi sử dụng, có thểdùng lâu dài.Long đởm là một trong những dược liệu được sử dụng trong y học cổ truyềnđể điều trị vàng da, viêm gan, viêm miệng, chán ăn và các bệnh viêm nhiễm khác24,27. Long đởm đã được sử dụng rộng rãi, có thể kết hợp cùng nhiều vị thuốckhác trong các bài thuốc đông y và có tác dụng phòng và chữa nhiều loại bệnh,... Đểgóp phần từng bước hiện đại hóa thuốc cổ truyền nhằm tạo ra sản phẩm trung gianvà tiêu chuẩn hóa được nguyên liệu đầu vào để bào chế các dạng bào chế thuốc hiệnđại khác, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật điều chế vàxây dựng một số tiêu chuẩn cho cao đặc long đởm” với các mục tiêu sau:1. Nghiên cứu kỹ thuật điều chế cao đặc long đởm.2. Xây dựng một số tiêu chuẩn cho cao đặc long đởm.3. Đánh giá độ ổn định của cao đặc long đởm.
Trang 1BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
Trang 2BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô giáo KS.DS Nguyễn Thị Việt Hương, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình
và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này
Em xin chân thành cảm ơn Th.S Ma Thị Hồng Nga, Th.S Nguyễn Thị Hạnh Thủy,
DS Trần Ngọc Bảo, những người đã giúp đỡ và chỉ bảo em rất nhiều trong thời gian làm khóa luận Đồng thời xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công Nghiệp Dược đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận đúng thời hạn
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy dỗ và chỉ bảo em tận tình trong suốt những năm tháng học tập tại trường
Cuối cùng với lòng biết ơn vô hạn, xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè và đặc biệt là người mẹ của em đã luôn luôn động viên và khích lệ em trong suốt thời gian qua
Em xin chân thành cảm ơn!
Trang 4MỤC LỤC
Danh mục các kí hiệu, chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Đặt vấn đề 1
Chương 2 Tổng quan 2
1.1 Tổng quan về cây long đởm 2
1.1.1 Nguồn gốc và phân bố 2
1.1.2 Đặc điểm thực vật 3
1.1.3 Bộ phận dùng 4
1.1.4 Thành phần hóa học 4
1.1.5 Công dụng - tác dụng 6
1.1.5.1 Công năng - chủ trị theo YHCT 6
1.1.5.1 Công dụng – tác dụng theo y học hiện đại 7
1.2 Cao thuốc 8
1.2.1 Định nghĩa 8
1.2.2 Một số đặc điểm của cao thuốc 8
1.2.3 Kỹ thuật điều chế cao thuốc 8
1.3 Độ ổn định của thuốc 9
1.3.1 Định nghĩa 9
1.3.2 Tiêu chuẩn đánh giá độ ổn định 10
1.3.3 Các kiểu thử nghiệm đánh giá độ ổn định 10
1.3.3.1 Thử nghiệm khắc nghiệt 10
1.3.3.2 Thử nghiệm dài hạn (trong điều kiện thực) 10
Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 12
2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 12
2.1.1 Nguyên liệu 12
2.1.2 Hóa chất, dung môi 12
Trang 52.1.3 Thiết bị, dụng cụ 12
2.2 Nội dung nghiên cứu 13
2.2.1 Nghiên cứu kỹ thuật điều chế cao đặc long đởm 13
2.2.1.1 Nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất dược liệu long đởm 13
2.2.1.2 Nghiên cứu kỹ thuật cô dịch chiết thành cao đặc 14
2.2.2 Xây dựng một số tiêu chuẩn của cao 14
2.2.3 Đánh giá độ ổn định của cao 14
2.3 Phương pháp thực nghiệm 14
2.3.1 Phương pháp điều chế cao đặc 14
2.3.1.1 Qui trình điều chế chung cho cao đặc long đởm 14
2.3.1.2 Định tính bằng phương pháp SKLM 16
2.3.1.3 Phương pháp định lượng 16
2.3.1.4 Phương pháp chiết xuất 18
2.3.1.5 Phương pháp cô dịch chiết 19
2.3.2 Xây dựng một số tiêu chuẩn của cao 19
2.3.3 Phương pháp đánh giá độ ổn định của cao đặc long đởm 20
Chương 3 Thực nghiệm, kết quả và bàn luận 21
3.1 Kiểm tra chất lượng của dược liệu long đởm 21
3.1.1 Mô tả 21
3.1.2 Soi bột 21
3.1.3 Định tính bằng SKLM 21
3.1.4 Định lượng bằng HPLC 22
3.2 Điều chế cao đặc long đởm 23
3.2.1 Giai đoạn chiết xuất dược liệu long đởm 23
3.2.1.1 Lựa chọn tỷ lệ dược liệu và dung môi 23
3.2.1.2 Xác định thời gian chiết 26
3.2.2 Giai đoạn cô dịch chiết thành cao đặc 28
3.2.2.1 PP cô chân không 28
3.2.2.2 PP cô thường 28
Trang 63.3 Xây dựng một số tiêu chuẩn cho cao đặc long đởm 31
3.3.1 Tiêu chuẩn vật lý 31
3.3.2 Tiêu chuẩn hóa học 33
3.4 Đánh giá độ ổn định của cao đặc long đởm 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Trang 7DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Trang 8DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Kết quả SKLM gentiopicrin long đởm 22
Bảng 3.2 Khối lượng cao đặc ứng với các tỷ lệ dược liệu và dung môi 24
Bảng 3.3 Hàm ẩm cao đặc ứng với các tỷ lệ dược liệu và dung môi 24
Bảng 3.4 Hiệu suất qui trình ứng với các tỷ lệ dược liệu và dung môi 24
Bảng 3.5 Hàm lượng gentiopicrin ứng với các tỷ lệ dược liệu và dung môi 25
Bảng 3.6 Hiệu suất qui trình và hàm lượng hoạt chất ứng với các tỷ lệ DL/DM 25
Bảng 3.7 Kết quả định lượng hoạt chất gentiopicrin qua thời gian chiết 27
Bảng 3.8 Thời gian cô ứng với 2 phương pháp 29
Bảng 3.9 Khối lượng cao đặc ứng với 2 phương pháp 29
Bảng 3.10 Hàm ẩm của cao đặc ứng với 2 phương pháp 29
Bảng 3.11 Hiệu suất qui trình ứng với 2 phương pháp 29
Bảng 3.12 Hàm lượng gentiopicrin ứng với 2 phương pháp 30
Bảng 3.13 Hiệu suất qui trình, hàm lượng hoạt chất và thời gian cô của 2 pp 30
Bảng 3.14 kết quả thử tính chất cảm quan 31
Bảng 3.15 Kết quả hàm ẩm cao đặc long đởm 32
Bảng 3.16 Kết quả đo pH của dung dịch cao đặc long đởm 1% (kl/tt) 33
Bảng 3.17 Kết quả thử độ tan của cao trong nước 33
Bảng 3.18 Kết quả SKLM cao đặc long đởm 34
Bảng 3.19: Hàm lượng gentiopicrin trong cao đặc long đởm 35
Bảng 3.20 Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của hàm lượng gentiopicrin 35
Bảng 3.21 Chỉ tiêu theo dõi độ ổn định của cao đặc long đởm 36
Bảng 3.22 Kết quả theo dõi độ ổn định của mẻ 1 ở điều kiện thường 37
Bảng 3.23 Kết quả theo dõi độ ổn định của mẻ 2 ở điều kiện thường 37
Bảng 3.24 Kết quả theo dõi độ ổn định của mẻ 3 ở điều kiện thường 3
Trang 9DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1 Hoa và lá của cây long đởm (Gentiana scabra Bunge.) 3
Hình 1.2: Rễ và thân rễ Long đởm (Gentiana scabra Bunge.) 4
Hình 1.3 Công thức một số hoạt chất từ long đởm 5
Hình 2.1 Rễ long đởm thu mua từ công ty TNHH Đông Dược Phúc Hưng 12
Hình 2.2 Sơ đồ qui trình điều chế cao đặc long đởm 15
Hình 3.1 Đặc điểm vi học của bột long đởm 21
Hình 3.2 Sắc ký đồ dược liệu 22
Hình 3.3 Sắc ký đồ HPLC của dược liệu 22
Hình 3.4 Sắc ký đồ HPLC của chuẩn gentiopicrin 23
Hình 3.5 Đồ thị hiệu suất qui trình và hàm lượng gentiopicrin qua các tỷ lệ DL/DM 26
Hình 3.6 Sắc ký đồ cao long đởm 33
Hình 3.7 Sắc ký đồ HPLC của cao đặc long đởm 34
Trang 10ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển của Y học hiện đại, Y học cổ truyền cũng ngày càng đóng vai trò quan trọng trong việc phòng và chữa bệnh Các thuốc có nguồn gốc thiên nhiên của Y học cổ truyền có nhiều ưu điểm, đó là nguồn nguyên liệu có thể
tự trồng trọt, tự khai thác, ít tác dụng phụ, tương đối an toàn khi sử dụng, có thể dùng lâu dài
Long đởm là một trong những dược liệu được sử dụng trong y học cổ truyền
để điều trị vàng da, viêm gan, viêm miệng, chán ăn và các bệnh viêm nhiễm khác [24],[27] Long đởm đã được sử dụng rộng rãi, có thể kết hợp cùng nhiều vị thuốc khác trong các bài thuốc đông y và có tác dụng phòng và chữa nhiều loại bệnh, Để góp phần từng bước hiện đại hóa thuốc cổ truyền nhằm tạo ra sản phẩm trung gian
và tiêu chuẩn hóa được nguyên liệu đầu vào để bào chế các dạng bào chế thuốc hiện
đại khác, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật điều chế và xây dựng một số tiêu chuẩn cho cao đặc long đởm” với các mục tiêu sau:
1 Nghiên cứu kỹ thuật điều chế cao đặc long đởm
2 Xây dựng một số tiêu chuẩn cho cao đặc long đởm
3 Đánh giá độ ổn định của cao đặc long đởm
Trang 11
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về cây long đởm
Long đởm thuộc họ Long đởm (Gentianaceae) bao gồm nhiều loài
[2],[5],[11],[18],[22]
- Cây Long đởm (Gentiana scabra Bunge.)
- Cây Điều diệp long đởm (Gentiana manshurica Kitag.)
- Cây Tam hoa long đởm (Gentiana triflora Pall.)
- Cây Kiên long đởm (Gentiana rigescens Franch.)
Trong dân gian cũng dùng cả cây Thanh ngâm (Curanga amara, họ hoa
mõm chó) làm “nam long đởm thảo”, rễ trắng ngà, không có tua, giống long đởm ở
chất đắng [20] nhưng trong tây y lại dùng một loại khác là Gentiana lutea L có hoa
màu vàng, rễ to hơn, thái thành từng miếng mỏng, có người dịch nhầm là khổ sâm
vì là vị thuốc bổ mà lại đắng [14] Long đởm còn có tên gọi khác như: Lăng Du (Bản Kinh), Thảo Long Đởm, Sơn Lương Đởm (Tục Danh), Đởm Thảo, Khổ Đởm, Quan Âm Thảo, Tà Chi Đại Phu, Tà Chi Đại Sĩ (Hòa Hán Dược Thảo), Trì Long
Đởm (Nhật Bản) [28], Chinese gentian (Anh), Gentiane (Pháp) [11],[20]
Long là rồng, đởm là mật, vì vị thuốc này trông giống râu rồng, có vị đắng như mật [14]
1.1.1 Nguồn gốc và phân bố
Chi Gentiana L gồm một số loài phân bố rải rác ở vùng ôn đới ấm và cận
nhiệt đới, chủ yếu thuộc Bắc bán cầu Ở Việt Nam chi này có khoảng 4-5 loài
(Phạm Hoàng Hộ, 1981; Nguyễn Tiến Bân, 1997) [2]
Long đởm thảo có nguồn gốc từ vùng Xiberi (Liên Bang Nga) và phân bố đến tận các tỉnh Hắc Long Giang, Phúc Kiến, Quảng Đông của Trung Quốc Ở Việt Nam có 2 loài khác (cũng có tên gọi là “long đởm”) đều được dùng làm thuốc là
Gentiana loureirii (D.Don) Griseb phân bố ở cao nguyên Lang Biang - Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng và Gentiana rigescens Franch ex Hemsl có ở Tây Nguyên (Võ Văn Chi, 1997) Năm 1980, Viện Dược liệu đã thu tập được mẫu của loài G loureirii ở
Trang 12chân núi Lang Biang thuộc Xã Lát, huyện Đơn Dương, tỉnh Lâm Đồng [2] Tuy nhiên, hiện nay ta cũng phải nhập từ Trung Quốc [14]
Các loài long đởm nói chung đều là những cây nhỏ, thường mọc lẫn trong các tràng cỏ thấp Cây ưa ẩm, ưa khí hậu mát của vùng á nhiệt đới núi cao, hay vùng ôn đới ẩm, sinh trưởng nhanh trong vụ xuân hè
1.1.2 Đặc điểm thực vật
Long đởm là loại cây thảo, sống lâu năm, cao 40-60 cm Thân rễ ngắn, rễ nhiều, mọc tua tủa thành chùm, dài đến 20 cm, vỏ ngoài màu vàng nhạt Thân mọc đứng, nhiều đốt Lá mọc đối, không cuống, lá ở gốc thường nhỏ, những lá phía trên lớn hơn dài từ 3-8 cm, rộng 1-3 cm, gốc tròn, đầu thuôn nhọn, hai mặt nhẵn, gân hình cung Hoa tụ tập ở kẽ lá, hình chuông, màu lam, đài và tràng hình trụ, có 4-5 thùy, nhị 4-5 đính ở giữa hoặc ở gốc tràng, không thò ra ngoài tràng, bầu 1 ô Quả nang, hạt nhiều [2],[14],[18] Mùa hoa tháng 9-10, mùa quả tháng 10 [14],[18]
Hình 1.1 Hoa và lá của cây long đởm (Gentiana scabra Bunge.)
Trang 131.1.3 Bộ phận dùng
Vị thuốc từ cây long đởm là thân rễ và rễ (Radix et Rhizoma Gentianae)
[2],[3],[4],[5],[14],[20] Thu hái vào mùa xuân và mùa thu, mùa thu là tốt nhất [5],[14], đào lấy thân rễ và rễ, rửa sạch và phơi âm can, cắt đoạn 2-3 cm phơi hoặc sấy khô Bảo quản nơi khô thoáng [5] Theo Mascre’: rễ long đởm tươi chứa 2,48% gentiopicrin, sấy bằng tủ sấy tỉ lệ này còn 2,10%, rễ sấy trên gác bếp còn 1,61%, trong khi đó rễ đã để lên men thì chỉ còn lại vết gentiopicrin Do đó, khi thu hái rễ long đởm phải rửa và sấy khô sớm (dưới 3 ngày) [18]
Hình 1.2 Rễ và thân rễ long đởm (Gentiana scabra Bunge.)
1.1.4 Thành phần hóa học
Các loài trong chi Gentiana thường chứa thành phần chính là gentiopicrosid
(gentiopicrin) Chất secoiridoid glucosid này lần đầu tiên được phân lập từ loài
G.lutea [2]
Hàm lượng gentiopicrosid trong rễ và thân rễ là 0,35% Ngoài ra, còn có gentioflavin, gentisin, scabrosid, triflorosid, swertiamarin, swerosid, amarogentin, amaroswerin [2]
Hàm lượng gentiopicrosid phụ thuộc vào tuổi cây và thời gian thu hái Với
loài G scabra, hàm lượng gentiopicrosid cao nhất vào lúc cây 3 tuổi (7,8%), phần
trên mặt đất chứa khoảng 1% [2]
Trang 14Rễ của loài G scabra có gentiopicrosid, swerosid, 2’-(O,m-dihydroxybenzyl) swerosid, daucosterol (β-sitosterol glucosid) [2] Ngoài ra, có hai secoiridoid đã được phân lập là 4”’–O –β –D-glucopyranosyltrifloroside, 4’’’–O –β–D–glucopyranosyl scabraside [26]
Theo Đỗ Ngọc Thanh, loài long đởm ở Việt Nam có chất iridoid chính là gentiopicrosid, chiếm 70% trong số iridoid toàn phần, alkaloid chính là gentianin,
chiếm 70% lượng alkaloid toàn phần Rễ các loài G triflora, G rigescens, G manshurica, G scabra chứa gentiopicrosid và chất đắng toàn phần 4,1% - 6,7% Rễ thứ G triflora var japonica và G scabra var buergeri chứa triflorosid và scabrasid
[2]
Theo tác giả Đỗ Tất Lợi, trong long đởm có một glycosid đắng chừng 2% gọi là gentiopicrin C16H20O9, và một chất đường gọi là gentianoza C18H32O16 chừng 4% Thủy phân gentiopicin ta thu được gentiogenin C10H10O4 và glucoza Gentianoza gồm hai phân tử glucoza và một phân tử fructoza [10],[14]
Hình 1.3 Công thức một số hoạt chất từ long đởm
Trang 151.1.5 Công dụng - tác dụng
1.1.5.1 Công năng - chủ trị theo YHCT
- Tính vị, qui kinh: vị đắng, tính hàn, qui vào ba kinh can, đởm, bàng quang
[2],[3],[4],[5],[10],[14],[18],[20], có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu thực, tiêu viêm, trị đơn độc, sưng mủ Những người tì vị hư nhược, đi tả và không thấp nhiệt, không thực hỏa thì không dùng được [2],[3],[4],[14],[20]
- Thanh thấp nhiệt ở hạ tiêu: Chữa các chứng viêm gan vàng da, sỏi mật,
viêm tinh hoàn, ngứa âm hộ, viêm bàng quang [3],[4]
- Thanh can hỏa: Chữa chứng đau đầu, mắt đỏ, miệng đắng, họng đau, sườn đau, tai ù Trẻ em sốt cao co giật, viêm màng tiếp hợp cấp [3]
- Bình can hạ áp: Dùng chữa tăng huyết áp thể can dương thịnh [3],[4]
- Thanh phế hỏa: Dùng trong các bệnh viêm nhiễm đường hô hấp trên như
viêm họng, viêm amidan, ngoài ra còn dùng trong viêm tai giữa, tai có mủ, bệnh viêm tinh hoàn cấp tính, có thể phối hợp với chi tử [4]
- Giải độc trừ giun đũa: long đởm 40g, sắc uống vào mỗi buổi sáng, uống lúc
đói Ngoài ra còn có thể dùng để trừ sỏi gan, sỏi mật [4]
Một số bài thuốc có Long đởm
- Long đởm tả can thang: thanh thấp nhiệt ở can đởm, tả can hỏa, lợi thấp
Chữa các bệnh can hỏa như: đau mạng sườn, vàng da, mệt mỏi, ăn uống kém, miệng đắng, mặt đỏ, ù tai, viêm màng tiếp hợp cấp, viêm tai giữa, viêm túi mật, viêm gan siêu vi trùng, cao huyết áp thể thực nhiệt, tiểu ít màu vàng hay nâu [13] Bài thuốc Long đởm tả can thang là bài thuốc cổ phương được ghi trong nhiều tài liệu của YHCT [4],[9],[11],[12],[13],[14],[15],[17],[18],[21] Tất cả các tài liệu đều ghi gồm 10 vị thuốc, chỉ khác nhau về khối lượng của mỗi vị Ở đây, chúng tôi chỉ trích dẫn một bài thuốc được ghi trong tài liệu [4]
Trang 16Long đởm thảo 8g Đương qui 6g
Chi tử 8g Sài hồ 8g
Trạch tả 8g Sinh địa 8g
Hoàng cầm 8g Cam thảo 4g
Mộc thông 8g Xa tiền 4g
- Chữa ăn không tiêu, đầy bụng [2],[14]
Long đởm thảo 2g, đại hoàng 1g, hoàng bá 1g, nước 200ml, sắc lấy 100ml Chia làm 3 lần, uống trong ngày, 15 phút trước khi ăn để làm thuốc giúp sự tiêu hóa, ăn uống không tiêu
- Chữa đau dạ dày [2],[14]
Long đởm thảo 0,5g, hoàng bá 0,5g, can khương 0,3g, quế chi 0,3g, hồi hương 0,3g, kê nội kim 0,5g, sơn tra 1g (sao cháy) Tất cả trộn đều tán thành bột, chia làm 3 lần uống trong ngày (Hòa hán dược dụng nghiệm phương)
- Chữa sốt ho, khó thở [2],[14]
Long đởm thảo 2 – 3 g, hãm thêm bột hồ tiêu vào, uống
1.1.5.1 Công dụng – tác dụng theo y học hiện đại
Theo Ebeling, long đởm thảo có tác dụng phòng sự lên men, uống ít (nửa giờ trước bữa ăn) có tác dụng kích thích sự bài tiết dịch tiêu hóa, làm khỏe dạ dày Ngược lại, uống sau khi ăn cơm hay uống quá nhiều lại làm cho tiêu hóa kém sút, nhức đầu, hoa mắt, mặt đỏ [2],[14]
Theo một nghiên cứu về tác dụng chất đắng của long đởm thảo trên dạ dày nhỏ của chó cho thấy sự bài tiết dịch vị tăng tiến và lượng acid tự do cũng tăng hơn
ở chó được uống long đởm thảo [14]
Tác dụng đối với vị trường: với lượng nhỏ (liều 0,1g), long đởm thảo có thể xúc tiến sự phân tiết dịch vị làm tăng lượng acid trong dịch vị, kích thích tiêu hóa Tuy nhiên, dùng liều lớn hơn sẽ kích thích niêm mạc dạ dày, dẫn đến nôn [3],[4] Tác dụng kháng khuẩn: Do thuốc có tác dụng hạ thấp men chuyển hóa amin, trên thực tế có thể dùng thuốc dự phòng bệnh viêm não truyền nhiễm [3],[4] Nước
Trang 17sắc long đởm có tác dụng ức chế trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn lị, tụ cầu vàng [1],[3],[4]
Theo nghiên cứu, long đởm có tác dụng ức chế và thu gom các gốc tự do như peroxid, DPPH, và superoxide Long đởm có tác dụng bảo vệ tế bào gan trong mô hình gây viêm gan cấp bằng CCl4 ở chuột thực nghiệm, làm giảm sự oxi hóa tế bào, tạo điều kiện cho sự tái tạo một cách nhanh chóng tế bào nhu mô, đồng thời làm giảm nồng độ sGOT, sGPT là những enzyme có trong gan, mà sự tăng lên của chúng được đặc trưng cho sự tổn thương gan [26]
1.2 Cao thuốc
1.2.1 Định nghĩa
Cao thuốc là chế phẩm điều chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất qui định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp [5],[6],[7]
Cao đặc là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20% [5]
1.2.2 Một số đặc điểm của cao thuốc
- Đã được loại bỏ một phần hoặc hoàn toàn các tạp chất (chất nhầy, gôm, chất béo, nhựa, ) [6]
- Trong quá trình điều chế có thể hình thành một số chất là sản phẩm của quá trình oxy hóa, thủy phân, tác dụng của enzym Tỷ lệ hoạt chất trong cao thuốc (đặc, khô) thường cao hơn tỉ lệ hoạt chất trong dược liệu [6]
- Cao thuốc ít khi được sử dụng trực tiếp, thường được dùng để bào chế các dạng thuốc khác như siro, potio, viên tròn, thuốc mỡ, thuốc đạn, thuốc trứng, viên nén, thuốc bột [6]
1.2.3 Kỹ thuật điều chế cao thuốc
Quá trình điều chế cao đặc thường bao gồm những giai đoạn sau [6],[7]:
a Điều chế dịch chiết
- Chọn nguyên liệu:
+ Dược liệu được sấy khô và chia mịn tới độ mịn thích hợp
Trang 18+ Dung môi để điều chế cao thuốc tùy theo dược liệu có thể là nước, ethanol, ethanol loãng, ethanol – glycerin – nước, hoặc dùng dung môi ethanol trước, sau đó dùng nước cho dịch chiết sau rồi gộp các dịch chiết lại
- Chọn phương pháp chiết xuất:
Tùy theo bản chất của dược liệu và dung môi mà người ta chọn phương pháp chiết xuất thích hợp
độ thấp, thời gian cô ngắn, cô dịch chiết loãng trước, dịch chiết đậm đặc sau
Các phương pháp cô đặc như sau:
- Cô đặc ở áp suất thường: Người ta thường cô cách thủy, dụng cụ cô cần có bề mặt
bốc hơi lớn và nông Trong quá trình cô cần tiến hành khuấy trộn đều để tránh tạo váng trên bề mặt cản trở sự bốc hơi dung môi và tránh cháy ở đáy dụng cụ Có thể dùng quạt hoặc phương tiện thông gió để lưu thông lớp không khí bão hòa dung môi trên bề mặt dịch chiết
- Cô đặc ở áp suất giảm: Người ta dùng các thiết bị cô có bộ phận tạo chân không
Cần chú ý một số trường hợp dịch chiết sẽ sủi bọt mạnh khi áp suất nồi cô giảm Để ngăn cản quá trình tạo bọt có thể thêm vào dịch chiết một lượng nhỏ chất chống tạo bọt như bơ ca cao, parafin
1.3 Độ ổn định của thuốc
1.3.1 Định nghĩa [8]
Độ ổn định của thuốc là khả năng nguyên liệu hoặc chế phẩm được bảo quản trong điều kiện xác định có thể giữ được những đặc tính vốn có về hóa lý, vi sinh, sinh dược học…trong những giới hạn nhất định của tiêu chuẩn chất lượng thuốc
Trang 191.3.2 Tiêu chuẩn đánh giá độ ổn định [8]
Có 5 tiêu chuẩn đánh giá độ ổn định của thuốc
- Độ ổn định hóa học: các tính chất hóa học (thành phần định tính và định lượng)
của (các) hoạt chất có mặt trong chế phẩm nằm trong một giới hạn cho phép theo tiêu chuẩn chất lượng
- Độ ổn định vật lý: các đặc điểm vật lý của nguyên liệu làm thuốc như màu sắc,
trạng thái tinh thể, độ tan…không thay đổi
- Độ ổn định vi sinh: độ vô trùng hoặc giới hạn nhiễm khuẩn của chế phẩm phải đáp
ứng yêu cầu của tiêu chuẩn
- Độ ổn định điều trị: tác dụng điều trị của chế phẩm không thay đổi
- Độ ổn định độc tính: độc tính không được tăng lên trong suốt quá trình bảo quản
và lưu hành trên thị trường
1.3.3 Các kiểu thử nghiệm đánh giá độ ổn định
1.3.3.1 Thử nghiệm khắc nghiệt
Thử nghiệm khắc nghiệt được coi là đồng nghĩa với lão hóa cấp tốc Một số yếu tố tác động đến độ ổn định của thuốc áp dụng trong lão hóa cấp tốc, thử nghiệm khắc nghiệt có thể không xảy ra trong thực tế nhưng có ý nghĩa cho biết các đặc tính
ổn định của thuốc
1.3.3.2 Thử nghiệm dài hạn (trong điều kiện thực)
Thử nghiệm dài hạn là thử nghiệm bảo quản thuốc trong điều kiện thực, toàn
bộ các chỉ tiêu chất lượng theo tiêu chuẩn đều được đánh giá kéo dài theo thời gian đến khi thuốc không còn đáp ứng chất lượng đề ra Thử nghiệm dài hạn có ý nghĩa xác định chính xác tuổi thọ, thời gian sử dụng của thuốc
Để có thể tiến hành thử nghiệm dài hạn phù hợp với điều kiện khí hậu thực, thuận lợi cho việc lập kế hoạch nghiên cứu độ ổn định, chọn điều kiện bảo quản, đồ bao gói, người ta chia khí hậu của các nước làm 4 vùng:
+ Vùng khí hậu I: vùng ôn đới nhiệt độ 21ºC, độ ẩm 45%
+ Vùng khí hậu II: vùng cận nhiệt đới, lục địa, nhiệt độ 25ºC, độ ẩm 60% + Vùng khí hậu III: vùng sa mạc (nóng và khô), nhiệt độ 30ºC, độ ẩm 35%
Trang 20+ Vùng khí hậu IV: vùng nhiệt đới (nóng và ẩm), nhiệt độ 30ºC, độ ẩm 70% Nếu chế phẩm được lưu hành ở vùng I nên nghiên cứu độ ổn định trong điều kiện bảo quản ở vùng II
Nếu chế phẩm được lưu hành ở vùng III hoặc vùng IV nên nghiên cứu độ ổn định trong điều kiện bảo quản ở vùng IV [8]
Trang 21CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1 Nguyên liệu
Dược liệu long đởm (Gentiana scabra Bunge.) thu mua của công ty TNHH
Đông Dược Phúc Hưng Độ ẩm 8,5% Hàm lượng hoạt chất chính gentiopicrin là 1,86 %
Hình 2.1 Rễ long đởm thu mua từ công ty TNHH Đông Dược Phúc Hưng
2.1.2 Hóa chất, dung môi
- Máy HPLC Shimadzu SPD-M10 Avp với detector UV (Nhật Bản)
- Máy cất quay Büchi Rotavapor R-200 (Thụy Sỹ)
- Cân phân tích Sartorius TE 214S
- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức)
- Máy soi UV
- Tủ sấy MEMMERT (Đức)
Trang 222.2 Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Nghiên cứu kỹ thuật điều chế cao đặc long đởm
Đi từ dược liệu để điều chế ra cao đặc phải trải qua 2 giai đoạn chính là: giai đoạn chiết xuất và giai đoạn cô dịch chiết thành cao đặc Trong quá trình chiết và quá trình cô, có những thông số ảnh hưởng đến hiệu suất qui trình cũng như hàm lượng hoạt chất chính có trong cao đặc được điều chế ra Nghiên cứu về kỹ thuật chiết xuất và kỹ thuật cô dịch chiết thành cao nhằm góp phần tối ưu hóa qui trình điều chế chung cho cao đặc long đởm
2.2.1.1 Nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất dược liệu long đởm
Ở đây chúng tôi áp dụng qui trình điều chế chung cho cao đặc long đởm với dung môi dùng để chiết xuất là nước và tiến hành theo phương pháp ngâm nóng Dung môi nước có ưu điểm là rẻ tiền, dễ kiếm, thiết bị cần cho chiết xuất đơn giản, đầu tư ít Khi chiết ở nhiệt độ sôi làm tăng độ tan của gentiopicrin là hoạt chất chính
có trong dược liệu long đởm do đó làm tăng hàm lượng hoạt chất này có trong cao đặc Chúng tôi tiến hành thí nghiệm để lựa chọn 2 thông số cho qui trình chiết, bao gồm các thông số: lựa chọn tỷ lệ dược liệu và dung môi, thời gian chiết
a Lựa chọn tỷ lệ dược liệu và dung môi nước (DL/DM)
Để lựa chọn tỷ lệ dược liệu và dung môi nước, chúng tôi thực hiện các thí nghiệm với các tỷ lệ dược liệu và nước khác nhau trong cùng một điều kiện chiết và điều kiện cô như nhau, dựa vào hiệu suất qui trình và hàm lượng hoạt chất chính gentiopicrin có trong cao đặc từ đó lựa chọn được tỷ lệ thích hợp
b Lựa chọn thời gian chiết xuất
Để lựa chọn thời gian chiết, chúng tôi thực hiện các thí nghiệm chiết dược liệu long đởm theo các khoảng thời gian khác nhau với tỷ lệ dược liệu và dung môi nước đã chọn và trong cùng một điều kiện chiết như nhau, dựa vào hàm lượng hoạt chất chính gentiopicrin có trong 1ml dịch chiết và phân tích những chi phí về mặt thời gian, tốn kém nhiệt lượng và ảnh hưởng của nhiệt đến hoạt chất từ đó lựa chọn được thời gian chiết thích hợp
Trang 232.2.1.2 Nghiên cứu kỹ thuật cô dịch chiết thành cao đặc
Để lựa chọn được phương pháp cô, chúng tôi chiết xuất dược liệu long đởm theo tỷ lệ dược liệu và dung môi nước, thời gian chiết đã chọn, tiến hành cô dịch chiết thu được bằng các phương pháp cô khác nhau, trong cùng một điều kiện như nhau, dựa vào thời gian cô, hiệu suất qui trình và hàm lượng hoạt chất chính gentiopicrin có trong cao đặc để từ đó lựa chọn được phương pháp cô thích hợp
2.2.2 Xây dựng một số tiêu chuẩn của cao
Sau khi điều chế thu được cao đặc long đởm, chúng tôi tiến hành xây dựng một số tiêu chuẩn vật lý, hóa học cho cao bao gồm: tính chất cảm quan (thể chất, màu sắc, mùi vị), hàm ẩm của cao, pH của dd cao 1% (kl/tt), độ tan của cao trong nước, định tính và định lượng hoạt chất gentiopicrin có trong cao, góp phần tiêu chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào cho các dạng bào chế hiện đại khác đi từ cao đặc long đởm
2.2.3 Đánh giá độ ổn định của cao
Theo dõi và đánh giá độ ổn định của cao đặc long đởm về mặt vật lý và hóa họcở điều kiện thử nghiệm dài hạn: nhiệt độ: 30 ± 2ºC và độ ẩm 75 ± 5% trong thời gian 6 tháng
2.3 Phương pháp thực nghiệm
2.3.1 Phương pháp điều chế cao đặc
Để có thể lựa chọn được các thông số thích hợp cho giai đoạn chiết xuất
và giai đoạn cô dịch chiết, chúng tôi tiến hành nhiều thí nghiệm khác nhau Các thí nghiệm đều theo 1 qui trình chung
2.3.1.1 Qui trình điều chế chung cho cao đặc long đởm
a Sơ đồ qui trình điều chế chung
Trang 24Hình 2.2 Sơ đồ qui trình điều chế cao đặc long đởm
b Mô tả qui trình điều chế chung
Qui trình điều chế đi từ rễ long đởm đến cao đặc long đởm bao gồm 3 giai đoạn chính sau:
- Giai đoạn 1: Chuẩn bị nguyên liệu
Dược liệu thu mua của công ty TNHH Đông Dược Phúc Hưng được loại tạp, rửa sạch, để ráo nước Sấy dược liệu ở 60 – 70°C cho khô, cắt dược liệu thành từng đoạn nhỏ có kích thươc từ 1 – 2 cm
- Giai đoạn 2: Chiết xuất
Nguyên tắc chiết: bằng phương pháp ngâm nóng ở nhiệt độ sôi (100°C) Tiến hành chiết: cho dược liệu vào bình cầu thủy tinh loại 2 lít Khối
lượng dược liệu là 100g/mẻ Số lần chiết là 3 lần/mẻ Dung môi chiết là nước (Tùy theo thí nghiệm sẽ thay đổi tỷ lệ dược liệu và dung môi, thời gian chiết) Chiết dược liệu trong nồi ôm có bảo ôn nhiệt Sau khi chiết xong, rút dịch chiết
ra, lắp lưới và lót bông vào bình chiết, tiến hành lọc dịch chiết
- Giai đoạn 3: Cô cao
Dịch chiết sau khi lọc loại bỏ một số tạp chất được đem đi cô (tùy theo thí nghiệm sẽ thay đổi phương pháp cô) để thu được cao lỏng 1:1, sau đó cao
Trang 25lỏng 1:1 được cho ra bát sứ rộng vành, tiến hành cô cách thủy trên nồi cách thủy để thu được cao đặc long đởm
2.3.1.2 Định tính bằng phương pháp SKLM [5]
Cách tiến hành như sau:
- Hoạt hóa bản mỏng Silicagel GF254 ở 110ºC trong 1 giờ
- Hệ dung môi khai triển: Ethylacetat – Methanol – Nước (10 : 2 :1)
- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: lấy 0,5g bột long đởm thử (đối với dược liệu) hoặc 0,2g cao đặc, thêm 10ml Methanol (TT), đun trên cách thủy trong khoảng 15 phút, lọc, cô dịch lọc trên cách thủy đến còn khoảng 2ml thu được dung dịch thử Tiến hành song song với 0,5g long đởm chuẩn để có được dung dịch chuẩn
- Triển khai sắc ký: chấm 2 vết dịch chiết long đởm chuẩn và thử trên cùng 1 bản
mỏng, triển khai sắc ký đến vạch giới hạn dung môi (cách mép trên 0,5cm), lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng Soi bản mỏng dưới đèn tử ngoại với bước sóng 254nm Tính giá trị Rf
2.3.1.3 Phương pháp định lượng [22],[23]
Gentiopicrin được định lượng bằng phương pháp HPLC
a Lựa chọn điều kiện sắc ký:
- Với dược liệu: cân chính xác 0,5g dược liệu cho vào bình nón khô Bổ sung chính
xác 25,0ml methanol vào bình nón trên, cân khối lượng bình Sau đó chiết hồi lưu cách thủy trong vòng 30 phút (kể từ khi dịch sôi), để nguội ở nhiệt độ phòng Cân lại khối lượng bình, bổ sung thêm methanol để có khối lượng ban đầu, lắc trộn đều, lọc Hút chính xác 5,0ml dịch chiết trên cho vào bình định mức 25,0ml đã có sẵn 5,0ml dung dịch acid photphoric 0,4%, lắc kĩ, bổ sung methanol vừa đủ 25,0ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm, đem đi chạy HPLC
- Với cao đặc Dựa trên cách pha mẫu đối với dược liệu, dung dịch thử được pha
như sau: cân khoảng 0,2g cao đặc long đởm điều chế được cho vào bình định mức 25,0ml Bổ sung methanol vừa đủ 25,0ml vào, đem đi siêu âm trong 30 phút cho tan
Trang 26hết, bổ sung methanol (nếu thiếu) Tiến hành lọc dịch chiết, bỏ đi 10,0ml dịch lọc đầu Hút chính xác 5,0ml dịch lọc cho vào bình định mức 25,0ml đã có sẵn 5,0ml dung dịch acid photphoric 0,4%, lắc kĩ, bổ sung methanol vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm, đem đi chạy HPLC
- Với dịch chiết Dựa trên thể tích dịch chiết thu được, dung dịch thử được pha như
sau: hút 1,0ml dịch chiết cho vào bình định mức 10,0ml đã có sẵn 1,0ml dung dịch acid photphoric 0,4%, lắc kĩ, bổ sung methanol vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm., đem đi chạy HPLC
c Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
Cân chính xác 0,02g cho vào bình định mức 10,0ml, bổ sung methanol vừa
đủ, lắc, hòa tan hoàn toàn Hút chính xác 1,0ml dung dịch trên cho vào bình định mức 10,0ml đã có sẵn 1,0ml dung dịch acid photphoric 0,4%, lắc kĩ, bổ sung methanol vừa đủ, lắc đều, dùng làm dung dịch chuẩn Lọc dịch đã pha loãng qua
ch
ch cao cao
x m
S
m S C
- Với dược liệu:
25,1
ch
ch DL DL
x m
S
m S C
ch ch c d
S
C S C
Trong đó :
Scao: diện tích peak của cao đặc
SDL:diện tích peak của dược liệu
Sd/c: diện tích peak của dịch chiết
Sch: diện tích peak của chất chuẩn
mcao : khối lượng cân cao đặc (mg)
mDL: khối lượng cân dược liệu (mg)
mch: khối lượng cân chất chuẩn (mg)
xcao, xDL: hàm ẩm của cao, dược liệu
Ccao: hàm lượng gentiopicrin trong cao (%)
CDL: hàm lượng gentiopicrin trong dược liệu (%)
Cch: nồng độ của chất chuẩn (mg/ml)
Cd/c: nồng độ của dịch chiết (mg/ml) 1,25: hệ số pha loãng
Trang 272.3.1.4 Phương pháp chiết xuất
Ở giai đoạn chiết chúng tôi tiến hành lựa chọn 2 thông số thích hợp: tỷ lệ DL/DM và thời gian chiết
a Lựa chọn tỷ lệ dược liệu và dung môi nước
Chúng tôi tiến hành các thí nghiệm theo cùng một qui trình như ở mục 2.3.1.1 trong các điều kiện giống nhau (khối lượng dược liệu/mẻ, số lần chiết/mẻ, thời gian chiết, phương pháp ngâm nóng, dung môi nước, cô bằng pp cô chân không), chỉ khác nhau ở tỷ lệ dược liệu và dung môi Chúng tôi chọn ra 4 tỷ lệ dược liệu và nước khác nhau, cụ thể là: 1/7, 1/8, 1/9 và 1/10
Để lựa chọn tỷ lệ dược liệu và dung môi nước thích hợp chúng tôi dựa vào hàm lượng hoạt chất chính gentiopicrin và hiệu suất qui trình (tính theo cao khô tuyệt đối)
Công thức tính hiệu suất qui trình:
cao cao
x m
x m
Trong đó: : hiệu suất qui trình (%)
mcao: khối lượng cao đặc (g)
mDL: khối lượng dược liệu (g)
xcao, xDL: hàm ẩm của cao đặc, dược liệu
b Lựa chọn thời gian chiết
Chúng tôi tiến hành các thí nghiệm theo cùng một qui trình như ở mục 2.3.1.1 trong cùng một điều kiện giống nhau (khối lượng dược liệu/mẻ, số lần chiết/mẻ, phương pháp ngâm nóng, dung môi nước, tỷ lệ DL/DM sẽ được chọn ở phần a của mục 2.3.1.4.), chỉ khác nhau ở thời gian chiết Chúng tôi chọn các khoảng thời gian chiết khác nhau là: (phút/lần) = 30, 45, 60, 75, 90
Dựa vào hàm lượng hoạt chất chính gentiopicrin có trong 1ml dịch chiết, và phân tích những chi phí về mặt thời gian, tốn kém nhiệt lượng và ảnh hưởng của nhiệt đến hoạt chất từ đó sẽ lựa chọn được thời gian chiết thích hợp
Trang 282.3.1.5 Phương pháp cô dịch chiết
Chúng tôi tiến hành các thí nghiệm theo cùng một qui trình như ở mục 2.3.1.1 trong cùng một điều kiện giống nhau (khối lượng dược liệu/mẻ, số lần chiết/mẻ, phương pháp ngâm nóng, dung môi nước, tỷ lệ DL/DM sẽ được chọn ở phần a của mục 2.3.1.4., thời gian chiết sẽ được chọn ở phần b của mục 2.3.1.4.), chỉ khác nhau ở phương pháp cô Chúng tôi chọn 2 pp cô khác nhau là: cô chân không và cô thường
a Phương pháp cô chân không Gồm 2 bước:
- Bước 1: Cô bằng pp cô chân không dịch chiết trong bình cất quay Büchi,
nhiệt độ cô từ 60 – 65°C, cô đến cao lỏng 1:1 (1ml cao : 1g dược liệu)
- Bước 2: tiến hành cô cao lỏng thành cao đặc bằng pp cô cách thủy
b Phương pháp cô thường Gồm 2 bước:
- Bước 1: Cô dịch chiết bằng pp cô trực tiếp trên bếp điện để điều chế thành
cao lỏng 1:1 (1ml cao : 1g dược liệu)
- Bước 2: tiến hành cô cao lỏng thành cao đặc bằng pp cô cách thủy
Dựa vào tổng thời gian cô, hiệu suất qui trình và hàm lượng hoạt chất chính gentiopicrin có trong cao để từ đó lựa chọn được phương pháp cô thích hợp
2.3.2 Phương pháp xây dựng một số tiêu chuẩn của cao
Cao đặc thu được sau khi điều chế theo qui trình điều chế cao đặc long đởm với các thông số đã chọn, chúng tôi tiến hành xây dựng một số tiêu chuẩn cho cao bao gồm 2 tiêu chuẩn chính:
2.3.2.1 Tiêu chuẩn vật lý Bao gồm các tiêu chuẩn sau:
- Xác định thể chất, màu, mùi, vị: pp cảm quan
- Xác định độ ẩm cao đặc: pp mất khối lượng do làm khô [5]
- Xác định pH của dung dịch cao 1% (kl/tt): bằng máy đo pH [5]
- Xác định độ tan của cao trong dung môi nước: pp hòa tan đơn giản
2.3.2.2 Tiêu chuẩn hóa học Bao gồm các tiêu chuẩn sau:
- Định tính cao đặc: bằng SKLM [5]
- Định lượng hoạt chất chính trong cao đặc: bằng pp HPLC [22]
Trang 292.3.3 Phương pháp đánh giá độ ổn định của cao đặc long đởm
Cao đặc long đởm sau khi điều chế theo quy trình điều chế cao đặc long đởm với các thông số đã chọn, được tiến hành thử độ ổn định theo phương pháp như sau:
a Điều kiện bảo quản:
Điều kiện thường (nhiệt độ: 30 ± 2ºC và độ ẩm: 75 ± 5%)
b Cách lấy mẫu:
Tiến hành lấy mẫu 3 lần, mỗi lần cách nhau 3 tháng vào các mốc thời gian khác nhau như sau:
- 0 tháng: thời điểm điều chế ra cao đặc
- 3 tháng: tính từ thời điểm điều chế ra cao
- 6 tháng: tính từ thời điểm điều chế ra cao
c Các chỉ tiêu cần đánh giá:
Là các chỉ tiêu đã được xây dựng ở mục 2.3.2 bao gồm: tính chất cảm quan, hàm ẩm cao, pH dung dịch 1% (kl/tt), độ tan, định tính, định lượng