Trong quá trình chiết xuất, tỷ lệ dược liệu và dung môi có ảnh hưởng đến hiệu suất qui trình và thời gian cô cao. Nếu tỷ lệ này quá nhỏ, dung môi không đủ để rút hết hoạt chất. Nếu tỷ lệ này quá lớn gây mất thời gian để đun sôi và thời gian cô thành cao đặc. Do đó, cần lựa chọn tỷ lệ dược liệu và dung môi thích hợp.
Để tiến hành lựa chọn tỷ lệ dược liệu và dung môi thích hợp, chúng tôi tiến hành chiết theo phương pháp đã được mô tả ở phần a của mục 2.3.1.4. Các thí nghiệm được thực hiện trong cùng một điều kiện chiết như nhau (khối lượng dược
liệu 100g/mẻ, số lần chiết = 3lần/mẻ, thời gian chiết là 30 phút/lần, pp ngâm nóng, dung môi nước (100ºC)), chỉ khác nhau ở tỷ lệ dược liệu và dung môi. Chúng tôi chọn các tỷ lệ dược liệu và nước khác nhau để tiến hành thí nghiệm là: 1/7, 1/8, 1/9, 1/10. Dịch chiết thu được của mỗi thí nghiệm cho vào bình cất quay 2 lít, tiến hành cô dưới áp suất giảm đến cao lỏng 1:1 (1ml cao lỏng : 1g dược liệu), sau đó cao lỏng được cho ra bát sứ rộng vành, tiến hành cô cách thủy để thu được cao đặc.
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, sau khi tiến hành thí nghiệm, cân khối lượng cao đặc sẽ có bảng kết quả sau:
Bảng 3.2. Khối lượng cao đặc ứng với các tỷ lệ dược liệu và dung môi
STT mcao ứng với các tỷ lệ dược liệu và dung môi (g)
1/7 1/8 1/9 1/10
1 40,50 41,03 45,21 47,10
2 39,66 41,95 45,79 46,95
3 40,20 42,24 46,01 46,35
TB 40,12 41,74 45,67 46,80
Sau khi thu được cao đặc, xác định hàm ẩm theo phương pháp “mất khối lượng do làm khô” theo DĐVN IV. Kết quả được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.3. Hàm ẩm cao đặc ứng với các tỷ lệ dược liệu và dung môi
Tỷ lệ DL/DM 1/7 1/8 1/9 1/10
xcao (%) 16.50 17,00 18,00 17,50
Từ kết quả về khối lượng, hàm ẩm của cao đặc, và dựa vào công thức tính hiệu suất qui trình (trang18), ta thu được kết quả như sau:
Bảng 3.4. Hiệu suất qui trình ứng với các tỷ lệ dược liệu và dung môi
tỷ lệ DL/DM 1/7 1/8 1/9 1/10
(%) 36,61 37,86 40,93 42,20
Tiến hành định lượng cao đặc thu được theo mục 2.3.1.3 (trang 16). Kết quả được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.5. Hàm lượng gentiopicrin ứng với các tỷ lệ dược liệu và dung môi
STT
Ccao ứng với tỷ lệ dược liệu và dung môi khác nhau (%)
1/7 1/8 1/9 1/10
1 3,42 4,39 3,81 3,38
2 3,50 4,41 3,78 3,40
3 3,43 4,40 3,79 3,41
TB 3,45 4,40 3,79 3,40
Từ kết quả về hiệu suất qui trình và về hàm lượng gentiopicrin ta thu được bảng tổng hợp kết quả sau:
Bảng 3.6. Hiệu suất qui trình và hàm lượng hoạt chất ứng với các tỷ lệ DL/DM:
Thông số Tỷ lệ DL/DM (%) Ccao (%) 1/7 36,61 3,45 1/8 37,86 4,40 1/9 40,93 3,79 1/10 42,20 3,40
Hình 3.5. Đồ thị hiệu suất qui trình và hàm lượng gentiopicrin qua các tỷ lệ DL/DM
- Nhận xét:
- Ở tỷ lệ 1/7 tuy lượng dung môi sử dụng là tiết kiệm hơn cả nhưng hiệu suất qui trình và hàm lượng hoạt chất gentiopicrin thấp nhất nên chúng tôi không chọn.
- Ở tỷ lệ 1/9, 1/10 tuy hiệu suất qui trình cao nhưng hàm lượng hoạt chất lại thấp hơn và chi phí sử dụng dung môi lại tốn kém hơn so với tỷ lệ 1/8.
- Ở tỷ lệ 1/8 tuy hiệu suất qui trình thấp hơn so với tỷ lệ 1/9 và 1/10 nhưng hàm lượng hoạt chất gentiopicrin là cao nhất. Đồng thời ở tỷ lệ này thì tiết kiệm được dung môi, thời gian để đun sôi, thời gian cô so với tỷ lệ 1/9 và 1/10.
Từ những nhận xét trên chúng tôi đưa ra kết luận sau:
- Kết luận: Chọn tỷ lệ dược liệu và dung môi nước là 1/8. 3.2.1.2. Xác định thời gian chiết
Trong quá trình chiết xuất, thời gian chiết có ảnh hưởng đến hiệu suất chiết, nếu thời gian chiết ngắn quá thì không rút được hết hoạt chất, nếu thời gian chiết dài quá thì dịch chiết bị lẫn nhiều tạp và gây mất thời gian chiết. Do đó cần lựa chọn thời gian chiết thích hợp.
Để lựa chọn thời gian chiết thích hợp, chúng tôi tiến hành chiết theo phương pháp đã được mô tả ở phần b của mục 2.3.1.4. Các thí nghiệm được thực hiện trong cùng một điều kiện như nhau (khối lượng dược liệu là 100g/mẻ, số lần chiết =
3lần/mẻ, phương pháp ngâm nóng, dung môi nước (100ºC), tỷ lệ DL/DM là 1/8), chỉ khác nhau ở thời gian chiết cho mỗi lần chiết. Chúng tôi chọn các thời gian chiết cho mỗi lần chiết khác nhau là: = 30 phút, 45 phút, 60 phút, 75 phút và 90 phút.
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, sau tiến hành thí nghiệm, định lượng hàm lượng hoạt chất chính gentiopicrin có trong 1ml dịch chiết theo mục 2.3.1.3.(trang 16) ta sẽ có bảng kết quả sau:
Bảng 3.7. Kết quả định lượng hoạt chất gentiopicrin qua thời gian chiết
STT
Cd/c ứng với các thời gian chiết khác nhau (mg/ml)
30 phút 45 phút 60 phút 75 phút 90 phút 1 0,83 0,89 0,87 0,88 0,89 2 0,79 0,89 0,92 0,93 0,87 3 0,81 0,90 0,88 0,91 0,89 TB 0,81 0,89 0,89 0,91 0,88 - Nhận xét:
- Ở 30 phút tuy thời gian chiết có tiết kiệm hơn nhưng hàm lượng hoạt chất lại thấp nhất.
- Ở thời gian 90 phút tuy hàm lượng hoạt chất thấp hơn không đáng kể so với 45 phút nhưng thời gian chiết lại quá dài.
- Ở thời gian 60 phút và 45 phút hàm lượng hoạt chất là như nhau, nhưng thời gian chiết lại lớn hơn so với 45 phút.
- Còn ở 75 phút thì hàm lượng hoạt chất có cao hơn so với 45 phút nhưng không đáng kể. Tuy nhiên thời gian chiết lớn không những làm tăng độ tan của hoạt chất mà còn làm tăng độ tan của tạp chất, hoạt chất tiếp xúc nhiều với nhiệt có thể bị phân hủy đồng thời nhiệt lượng cung cấp cũng phải tốn kém hơn.
Từ những nhận xét trên chúng tôi đưa ra kết luận sau:
3.2.2. Giai đoạn cô dịch chiết thành cao đặc
Trong quá trình cô dịch chiết thành cao, thời gian cô, nhiệt độ cô có thể ảnh hưởng đến hoạt chất trong cao cũng như chất lượng của cao. Nếu nhiệt độ quá cao, có thể gây phân hủy hoạt chất, hoặc làm cho thể chất cao bị biến dạng, do đó cần phải lựa chọn phương pháp cô thích hợp.
Để lựa chọn được phương pháp cô thích hợp, chúng tôi tiến hành theo 2 phương pháp như đã mô tả ở mục 2.3.1.5. Các thí nghiệm được thực hiện trong cùng một điều kiện như nhau, chỉ khác nhau về phương pháp cô ở giai đoạn đầu. Chúng tôi tiến hành với 2 thí nghiệm, trong cùng một điều kiện chiết (khối lượng dược liệu là 100g/mẻ, số lần chiết = 3lần/mẻ, pp chiết nóng, dung môi nước (100ºC), tỷ lệ DL/DM là 1/8, thời gian chiết là 45 phút/lần). Sau khi chiết xuất, gộp tất cả dịch chiết của 2 thí nghiệm lại, đong thể tích dịch chiết thu được. Chia lượng dịch chiết thành 2 phần có thể tích bằng nhau, tiến hành cô dịch chiết theo 2 pp khác nhau:
3.2.2.1. PP cô chân không. Gồm 2 bước:
+ Bước 1: Dịch chiết phần 1 được cho vào bình cô cất quay Büchi dung tích 2 lít, tiến hành cô ở áp suất giảm, điều chỉnh sao cho nhiệt độ cô từ 600C – 650C, cô đến cao lỏng 1:1. Ghi lại thời gian cô, kí hiệu 1 (tính từ khi dịch sôi).
+ Bước 2: Cho cao lỏng 1:1 vào bát sứ rộng vành, tiến hành cô cách thủy, vừa cô vừa khuấy đến khi thành cao đặc. Ghi lại thời gian cô, kí hiệu 2.
3.2.2.2. PP cô thường. Gồm 2 bước:
+ Bước 1: Dịch chiết phần 2 được cho vào nồi nhôm, có đường kính tương
đương với đường kính mặt thoáng của bình cất quay Büchi, tiến hành cô trực tiếp trên bếp điện đến cao lỏng 1:1. Ghi lại thời gian cô, kí hiệu là 1 (tính từ khi dịch sôi).
+ Bước 2: Cho cao lỏng 1:1 vào bát sứ rộng vành, có đường kính, độ dày
tương tự dùng trong pp cô chân không, tiến hành cô cách thủy, vừa cô vừa khuấy đến khi thành cao đặc. Ghi lại thời gian cô, kí hiệu là 2.
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, sau khi tiến hành thí nghiệm, ghi lại thời gian của mỗi bước ta có các bảng kết quả sau:
Bảng 3.8. Thời gian cô ứng với 2 phương pháp
STT
Thời gian cô ứng với 2 pp
PP cô chân không PP cô trực tiếp
1 2 1 + 2 1 2 1 + 2
1 2h20ph 2h00ph 4h20ph 3h10ph 1h50ph 5h00ph
2 2h50ph 1h40ph 4h30ph 3h20ph 2h00ph 5h20ph
3 2h30ph 2h10ph 4h40ph 3h00ph 2h10ph 5h10ph
TB 4h30ph 5h10ph
Sau thí nghiệm, cân khối lượng cao đặc ta có bảng kết quả sau:
Bảng 3.9. Khối lượng cao đặc ứng với 2 phương pháp
STT mcao ứng với 2 phương pháp (g)
PP cô chân không PP cô thường
1 45,01 42,85
2 44,95 42,70
3 44,80 42,70
TB 44,92 42,75
Sau khi thu được cao đặc, xác định hàm ẩm của cao theo phương pháp “mất khối lượng do làm khô” theo DĐVN IV. Kết quả được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.10. Hàm ẩm của cao đặc ứng với 2 phương pháp
Phương pháp Cô chân không Cô thường
xcao (%) 18,00 16,50
Từ khối lượng cao đặc, hàm ẩm của cao và dựa vào công thức tính hiệu suất qui trình (trang 18) ta có bảng kết quả sau:
Bảng 3.11. Hiệu suất qui trình ứng với 2 phương pháp
Phương pháp Cô chân không Cô thường
(%) 40,26 39,01
Tiến hành định lượng cao đặc theo mục 2.3.1.3 (trang 16). Kết quả được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.12. Hàm lượng gentiopicrin ứng với 2 phương pháp
STT Ccao ứng với 2 phương pháp cô (%)
PP cô chân không PP cô trực tiếp
1 5,03 4,89
2 5,18 4,84
3 5,09 4,90
TB 5,10 4,88
Từ kết quả về hiệu suất qui trình, về hàm lượng hoạt chất và thời gian cô cao ta có bảng tổng hợp sau:
Bảng 3.13. Hiệu suất qui trình, hàm lượng hoạt chất và thời gian cô của 2 pp
Thông số
PP (%) Ccao(%) 1 + 2
Cô chân không 40,35 5,10 4h30ph
Cô thường 39,01 4,88 5h10ph
- Nhận xét: dựa vào kết quả trên ta thấy pp cô chân không so với pp cô thường có
nhiều ưu điểm hơn như sau:
- Hiệu suất qui trình điều chế cao đặc cao hơn.
- Hàm lượng hoạt chất gentiopicrin trong cao đặc cũng cao hơn.
- Thời gian cô dịch chiết ngắn hơn đồng thời nhiệt độ cô lại thấp hơn, do đó hoạt chất ít bị ảnh hưởng bởi nhiệt.
3.3. Xây dựng một số tiêu chuẩn cho cao đặc long đởm
Cao thuốc có thể là dạng bào chế hoàn chỉnh, được sử dụng trực tiếp (thuốc sắc, thuốc hãm, cao lỏng) nhưng thông thường, đó là những sản phẩm trung gian dùng bào chế các dạng thuốc khác (ví dụ siro, viên tròn, viên nén, viên nang) [6]. Để bảo đảm chất lượng nguyên liệu đầu vào, việc xây dựng tiêu chuẩn cho cao là cần thiết, góp phần nâng cao chất lượng thuốc được bào chế ra. Do đó, chúng tôi tiến hành xây dựng một số tiêu chuẩn cơ sở cho cao đặc long đởm nhằm chuẩn hóa nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.1. Tiêu chuẩn vật lý
3.3.1.1. Tính chất cảm quan
- Thể chất: Cho 1 lượng nhỏ cao lên phiến kính, dùng lam kính ép, miết thành 1 lớp
mỏng, quan sát bằng mắt thường để kiểm tra độ đồng nhất và lấy 1 ít cao vê trên tay để kiểm tra.
- Màu sắc: Phết 1 ít cao lên tờ giấy trắng, quan sát màu sắc cao bằng mắt thường. - Mùi: Ngửi trực tiếp.
- Vị: Lấy 1 ít cao vào đầu đũa thủy tinh và nếm trực tiếp để xác định vị.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên 3 mẻ khác nhau, kết quả được ghi ở bảng sau:
Bảng 3.14. Kết quả thử tính chất cảm quan
Tiêu chuẩn Yêu cầu Kết quả
Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3
Thể chất Mềm dẻo, đồng nhất + + +
Màu sắc Nâu đen + + +
Mùi, vị Thơm, rất đắng + + +
Chú thích: + đạt yêu cầu.
- Nhận xét: Tính chất cảm quan của cả 3 mẻ giống nhau và đều đạt yêu cầu.
- Kết luận: Cao đặc long đởm phải có thể chất mềm dẻo, đồng nhất, màu nâu đen,
3.3.1.2. Hàm ẩm của cao
Xác định hàm ẩm cao bằng pp “mất khối lượng do làm khô” theo DĐVN IV.
Tiến hành: Dùng đĩa petri đã được rửa sạch, sấy khô đến khối lượng không
đổi ở nhiệt độ 105ºC, cân để xác định khối lượng bì. Cân chính xác 1,0g cao vào đĩa petri trên, dàn mỏng cao thành lớp mỏng có độ dày không quá 5mm. Cho đĩa petri trên vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 105ºC, trong 5h. Để nguội trong bình hút ẩm có Silicagen rồi cân ngay. Tiến hành sấy lại trong 1h nữa, kết quả đạt khi chênh lệch khối lượng cân giữa 2 lần gần nhau nhất không đổi.
Công thức tính hàm ẩm: 100 % truoc sau truoc cao m m m x
Trong đó: mtruoc: khối lượng cao trước khi sấy (g). msau: khối lượng cao sau khi sấy (g).
xcao: độ ẩm của cao (%).
Tiến hành với 6 mẻ cao, kết quả được ghi ở bảng sau:
Bảng 3.15. Kết quả hàm ẩm cao đặc long đởm
Mẻ mtruoc (g) msau (g) x (%) 1 1,0540 0,8748 17,00 2 1,0200 0,8405 17,60 3 1,0050 0,8392 16,50 4 1,0030 0,8225 18,00 5 1,0210 0,8474 17,00 6 1,0150 0,8374 17,50 Trung bình 17,27
- Nhận xét: Hàm ẩm trung bình của cao là 17,27%, đạt tiêu chuẩn của DĐVN IV. - Kết luận: Hàm ẩm của cao đặc long đởm phải đạt yêu cầu không quá 20%.
3.3.1.3. Xác định pH của dung dịch cao 1% (kl/tt)
Tiến hành: Lấy 0,5g cao, thêm nước cất vừa đủ 50ml, khuấy kỹ cho tan hết,
đo bằng máy đo pH. Chuẩn máy đo pH bằng dung dịch pH chuẩn: pH =4 và pH =7. Nhúng điện cực vào dung dịch cao đặc trên để đo. Đo 3 lần, kết quả như sau:
Bảng 3.16. Kết quả đo pH của dung dịch cao đặc long đởm 1% (kl/tt)
Lần đo pH của dd 1%
1 5,08
2 5,06
3 5,06
Trung Bình 5,07
- Nhận xét: pH trung bình là 5,07, do đó dung dịch cao long đởm 1% (kl/tt) mang bản chất acid.
- Kết luận: Dung dịch cao đặc 1% (kl/tt) trong nước phải có pH 5 - 6.
3.3.3.4. Độ hòa tan
Tiến hành: Cân 0,5g cao cho vào cốc có mỏ đã được rửa sạch và làm khô.
Sau đó thêm 25ml, 50ml và 100ml nước cất vào, khuấy cho tan hết. Để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, quan sát sự đồng nhất của dung dịch, lọc qua giấy lọc. Cao được coi là tan hết nếu không còn cắn ở đáy cốc và giấy lọc. Kết quả như sau:
Bảng 3.17. Kết quả thử độ tan của cao trong nước
STT Thể tích nước (ml)
25 50 100
1 - - +
2 - - +
3 - - +
Chú thích: - Còn cắn không tan. + Tan hoàn toàn.
- Nhận xét: Dựa vào bảng thử độ hòa tan trên, ta thấy cao đặc long đởm tan hoàn
toàn trong nước ở 0,5g/100ml.
3.3.2. Tiêu chuẩn hóa học
3.3.2.1. Định tính bằng pp SKLM
Tiến hành định tính theo phương pháp đã ghi ở mục 2.3.1.2. kết quả được thể hiện ở hình 3.6 và bảng 3.17.
- Nhận xét: Vết thử có giá trị Rf và màu sắc tương đương với vết chuẩn. - Kết luận: Cao đặc long đởm phải chứa gentiopicrin.
3.3.2.2. Định lượng bằng pp HPLC
Tiến hành định lượng theo phương pháp đã ghi ở mục 2.3.1.3. với 6 mẻ cao khác nhau, kết quả được thể hiện ở hình 3.7 và bảng 3.13.