Tổng hợp n1 (2 (hydroxyamino) 2 oxoethyl) n5 phenylglutaramid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase

B ộ Y T É TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỀN THỊ NGÂN TỔNG HỢP iV^-(2-(HYDROXYAMINO)-2- 0X0ETHỲL)-7V^-PHENỴLGLUTARAMID VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT HƯỚNG ứ c CHẾ HISTON DEACETYLASE KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược sĩ Người hướng dẫn: 1. ThS. Đào Thị Kim Oanh 2. DS. Trần Thị Oanh Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa dược I TRƯỠNG ĐH ĐĨẸcĨ Ĩ Ĩ nọị HÀ NỘI - 2011 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Hải Nam, ThS. Đào Thị Kìm Oanh - Bộ môn Hỏa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, DS. Trần Thị Oanh - Trường Đại học Dược Hà Nộiy những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt và chỉ bảo cho tôi những ỷ kiến quỷ báu trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi xỉn chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thày cô, các cản bộ kỹ thuật viên Bộ môn Hóa Dược đã tạo điều kiện tổt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này. Trong quá trình thực hiện khóa luận tôi đã nhận được sự giúp đờ rất nhiệt tình của các cán bộ Phòng thí nghiệm trung tâm - Trường Đại học Dược Hà Nội; Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng toàn thể các thày cô giáo ừ-ong trường, các phòng, ban, thư viện. Tôi xin chân thành cảm ơn. Cuối cùng, tồi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bè bạn - những người luôn sát cảnh, động viên và khích lệ tôi trong cuộc sổng và học tập. Hà Nội, ngày 10 thảng 5 năm 2011 Sinh viên Nguyễn Thị Ngân MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 PHẦN I: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về ung ứiư 3 1.1.1. Bản chất ung thư 3 1.1.2. Nguyên nhân gây ung thư 3 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh của ung thư 4 1.1.4. Các thuốc dựa trên mục tiêu phân tử trong điều trị ung thư hiện nay. 5 1.2. Tổng quan về histon deacetylase 9 1.2.1. Định nghĩa 9 1.2.2. Phân loại 9 1.2.3. Sự phân bố của HDAC 10 1.2.4. Cơ chế hoạt động của HDAC 11 1.2.5. Các chất ức chế HDAC 13 1.3. Phản ứng N-acyl hóa 18 1.3.1. Khái niệm 18 1.3.2. Các tác nhân 18 1.3.3. Cơ chế phản ứng 19 PHẦN II: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯOnSG PHÁP NGHIÊN CỬU 21 2.1. Nguyên liệu 21 2.2. Thiết bị, dụng cụ 21 2.3. Nội dung nghiên cứu 22 2.4. Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1. Tổng hợp hóa học 22 Trang 2.4.2. Kiểm tra độ tinh khiết 23 2.4.3. Xác định cấu trúc 23 2.4.4. Thử hoạt tính sinh học 23 2.4.5. Tính logP, K p 23 PHẦN III: THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1. Hóa học 24 3.1.1. Tổng hợp các dẫn chất 24 3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất đã tổng hợp được 39 3.1.3. Xác định cấu trúc 40 3.2. Hoạt tính sinh học 47 3.2.1. Tác dụng ức chế enzym histon deacetylase 47 3.2.2. Độc tính tế bào in vitro 49 3.3. Bàn luận 49 3.3.1. Hóa học 50 3.3.2. Hoạt tính sinh học 51 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 54 4.1. Kết luận 54 4.2. Đe xuất 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Bảng 1 : Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng 14 Bảng 2 : Các nguyên liệu cần dùng trong phản ứng 21 Bảng 3 : Tóm tắt kết quả phản ứng 1 28 Bảng 4 : Tóm tắt kết quả phản ứng 2 33 Bảng 5 : Tóm tắt kết quả phản ứng 3 39 Bảng 6 : Nhiệt độ nóng chảy của các chất N 1, N2, N3, N4 40 Bảng 7 : Kết quả phân tích phổ hồng ngoại 42 Bảng 8 : Kết quả phân tích phổ khối lượng 43 Bảng 9 : Kết quả phân tích phổ ’H-NMR của các chất Nl, N2, 45 N3, N4 Bảng 10: Kết quả phân tích phổ ’^C-NMR của các chất N l, N2, 46 N3,N4 Bảng 11: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư đại tràng 52 SW620 Bảng 12: Giá trị LogP, Kp ước tính của dãy chất N và SAHA 53 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Hình 1 : Sự phân bố của HD AC trong tế bào 10 Hình 2: cấu trúc 3D của một HD AC 12 Hình 3 : Công thức hóa học của một số chất ức chế HD AC 15 Hình 4: Cơ chế tác dụng trong tế bào của các chất ức chế HD AC 16 Hình 5: Quá trình acetyl hóa và deacetyl hóa ở lysin 17 Hình 6: Mối liên quan giữa cấu trúc-tác dụng của các chất ức chế 18 HDAC Hình 7: Kết quả thử hoạt tính ức chế HD AC của N I, N2, N3, N4 52 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẮT ALL AML APL CDI CLL CTCL CTCT CTPT DCM DMF DMSO GADPH HSP90 MDS TEA HDAC TLC (Acute lymphoblastic leukemia) Bệnh bạch cầu nguyên bào cấp tính (Acute myoloid leukemia) bệnh bạch cầu tủy bào cấp tính Bệnh ung thư tiền tủy bào cấp tính 1,1 -Carbonyldiimidazol (Chronic lymphocytic leukemia) Bệnh lympho mãn tính (Cutaneous T cell lymphoma) xế bào lympho T dưới da Công thức cấu tạo Công thức phân tử Dicloromethan N,N-dimethylformamid Dimethylsulfoxid Glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenase (Heat shock protein 90) Protein sốc nhiệt-90 (Myelodysplastic Syndromes) Hội chứng dị sinh tủy Triethanolamin Enzym histon deacetylase Sắc ký lớp mỏng ĐẶT VẤN ĐÈ Sức khỏe là vốn quý nhất của mỗi người nói riêng và của toàn xã hội nói chung. Khi có sức khỏe tốt con người mới có khả năng cống hiến hết năng lực, ttí tuệ của mình cho xã hội. Chính vì vậy đầu tư cho vấn đề y tế là đầu tư cho sự phát ừiển và là một trong những ưu tiên hàng đầu của các quốc gia. Trên hành trình chăm sóc, nâng cao sức khỏe cho nhân dân, chúng ta không thể không kể đến sự đóng góp lón lao của các nhà bào chế, hoá dược, dược lâm sàng Với những thành công trong nghiên cửu tìm ra thuốc mới và đưa vào ứng dụng trong lâm sàng, nhiều bệnh đã được phát hiện và điều trị hiệu quả trong đó điển hình là các bệnh ung thư. Hiện nay tỷ lệ mắc ung thư trên thế giới gia tăng rất nhanh do môi trường ô nhiễm, thực phẩm nhiều hóa chất, sử dụng thuốc lá. Các thuốc điều trị ung thư có tác dụng ngăn cản sự phát triển của tế bào song các thuốc cổ điển có độc tính cao do tác dụng không chọn lọc trên tế bào ung thư và dễ gây kháng thuốc. Vì vậy trong những năm gần đây các nhà khoa học đă nghiên cứu tổng hợp thuốc ung thư theo hướng đích tác dụng của thuốc là các enzyme liên quan đến quá trình tăng sinh của các tế bào, do đó đã hạn chế được tác dụng phụ cho bệnh nhân trong điều trị. Một trong những enzym được nghiên cứu nhiều hiện nay là histon deacetylase (HDAC). Năm 2006, Vorinostat (axit hydroxamic suberoylanilide) dẫn chất đầu tiên của acid hydroxamic có tác dụng ức chế HDAC được FDA cấp giấy phép sử dụng trong điều trị u lympho tế bào T dưới da đã mở ra một hướng mới trong việc tổng hợp các chất ức chế HD AC [14]. Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu của TS. Nguyễn Hải Nam và ThS Đào Thị Kim Oanh tại Bộ môn Hóa dược, Đại học Dược Hà Nội đã và đang tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của các dẫn chất acid hydroxamic mới. Tiếp tục hướng nghiên cứu này, chúng tôi quyết định tiến hành đề tài "Tổng hợp (hydroxyamino)-2-oxoethyl)-A^-phenylglutaramid và 1 số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase” với 2 mục tiêu sau: 1. Tổng hợp V-(2-(hydroxyamino)-2-oxoethyl)-AA^-phenylglutaramid và các dẫn chất. 2. Thử tác dụng ức chế enzym HDAC và độc tính tế bào in vitro của các chất tổng hợp được. PHẦN I. TỎNG QUAN 1.1. TỎNG QUAN VỀ UNG THƯ 1.1.1. Bản chất ung thư Ung thư là bệnh lý ác tính của tế bào. Khi bị kích thích bởi các tác nhân gây ung thư, tế bào tăng sinh một cách vô tổ chức, không tuân theo các cơ chế kiếm soát về phát triển của cơ thể. Đa số người bị ung thư hình thành các khối u. Khác với các khối u lành tính (chỉ phát triển tại chỗ thường rất chậm, có vỏ bọc xung quanh), các khối u ác tính (ung thư) xâm lấn vào các tổ chức lành xung quanh. Các tế bào của các khối u ác tính có khả năng di căn tới các hạch bạch huyết hoặc các tạng ở xa hình thành các khối u mới và cuối cùng dẫn tới tử vong. Đa số ung thư có quá trình phát sinh và phát triển lâu dài qua nhiều giai đoạn. Giai đoạn tiềm tàng thường kéo dài nhiều năm. Khi khối u phát triển nhanh mới có các triệu chứng ung thư. Triệu chứng đau thưòng xuất hiện ở giai đoạn cuối [8]. 1.1.2. Nguyên nhân gây ung thư Hiện nay, người ta đã biết đến hơn 200 loại ung thư khác nhau trên cơ thể người do nhiều nguyên nhân gây ra. Theo nghiên cứu dịch tễ học của R.Doll và Peừo trên 80% tác nhân gây ung thư bắt nguồn từ môi trường sống, trong đó có 2 tác nhân lớn: 35% do chế độ ăn uống gây nhiều loại ung thư đưcmg tiêu hóa và khoảng 30% ung thư do thuốc lá (gây ung thư phổi) [8]. Ngoài ra còn có; - Tia phóng xạ gây ung thư máu - Tia bức xạ tử ngoại gây ung thư da - Virus viêm gan B (HBV), viêm gan c (HCV) dẫn đến ung thư gan, virus HPV gây ung thư cổ tử cung [...]... v cụng ngh Vit Nam 2. 3 NI DUNG NGHIấN c u - Tng hp A^^ - (2- (hydroxyamino)- 2- oxoethyl)- A^^ -phenylglutaramid v 3 dn cht - Kim tra tinh khit v xỏc nh cu trỳc ca cỏc cht tng hp c - Th tỏc dng c ch enzym HDAC v khỏng t bo ung th in vitro ca 4 cht N 1, N2, N3, N4 tng hp c 2. 4 PHNG PHP NGHIấN cu 2. 4.1 Tng hp húa hc 23 Da trờn nguyờn tc, phng phỏp c bn ca húa hc hu c tng hfp cỏc cht N1, N2, N3,N4 Chi tit cỏc... t bo ca cỏc cht c ch HDAC * C ch tỏc dng gia cỏc t bo ca cỏc cht c ch HDAC Cỏc cht c ch HDAC ngn cn cỏc uụi histon cú nhúm acetyl tin n v trớ xỳc tỏc 17 CH3 Lysin CO NHt NH CH2 CH2 CH2 | h2 CH2 CH2 acetyl húa CH2 deacetyl húa CH2 CH CH N H Hỡnh 5: Quỏ trỡnh acetyl húa v deacetyl húa ly sin 1 .2. 5.3 Liờn quan gia cu trỳc v tỏc dng ca cỏc cht c ch HDAC (HDACi) Núi chung hiu qu tỏc dng ca cỏc cht c ch... dng trong iu tr ung th I .2. 5.I Phõn loi cỏc cht c ch HDAC Hin nay, cỏc cht c ch HDAC c chia lm 4 nhúm chớnh da theo cu trỳc tỏc dng [ 12, 14, 16 ,20 ]; - Cỏc hydroxamat nh (2 )-N-hydroxy-3-(3- ( (2- (2- methyl-lH-indol-3yl)ethylamino)methyl)phenyl)acrylamide (Ill-panobinostat (LBH589)); N- hydroxy-3-(3-(N-phenulsulfamoyl)phenyl)acrylamid (rv-belinostat (PXD101)) - Cỏc benzamid nh V-MS275, VI-MGCD103 - Cỏc acid... mt s cht c ch Cỏc kt qu ny c s dng ong thit k cu trỳc ca nhiu dóy dn cht c ch HDAC mi [19], tOO2 02- '2i2 kMp 31-36 } loop 20 6 -27 9 / " \ ^ - H O L P :T S A loop3 32 - Cho 5mmol dn cht anilin vo bỡnh cu 50ml khụ, sch 25 - Cho tip 2ml DMF vo bỡnh cu, lc u 1 phỳt - Cho 6 mmol anhydrid glutaric vo bỡnh cu - Tin hnh phn ng 70c kt hp khuy t 20 0 vũng /phỳt trong 24 h - Trong quỏ trỡnh lm phn ng phi luụn theo dừi phn ng bng TLC vi pha ng DMC:MeOH =20 :1, pha tnh l silicagenG (chm 2 vt: 1 vt ca dn cht... nm 20 11, FDA cp phộp cho mesilate imatinib iu tr mi loi ung th khỏc nhau Hin nay, tỏc dng ca thuc ny vn ang c cỏc nh khoa hc tip tc nghiờn cu 1.1.4.5 Cỏc cht c ch histon deacetylase v proteosome Hin tng bin i sau sao chộp ca protein histon qua phn ng acetyl húa xỳc tỏc bi enzym histone acetyltransferase tham gia vo quỏ trỡnh sa i cht nhim sc v hin tng im lng th phỏt ca quỏ trỡnh sao chộp Enzym histone... theo c ch th ỏi nhõn lng phõn t (Sn^) qua cỏc bc sau: trc ht, nhúm NH2 amin s gn vo nguyờn t c ca nhúm 20 carbonyl, sau ú, c tỏch ra v cui cựng l X' tỏch ra to thnh sn phm 9 _ ĩ R C X _ H2N R' + 9 I H2 R N - R đ X - 0) ằ I/ H R ầ N R' X _ -X o II H R C N R' 21 PHN II NGUYấN LIU, THIT B, NI DUNG V PHNG PHP NGHIấN c u 2. 1 NGUYấN LIU: Trong phm vi khúa lun ny, chỳng tụi s dng mt s nguyờn . (hydroxyamino)-2-oxoethyl)-A^-phenylglutaramid và 1 số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase với 2 mục tiêu sau: 1. Tổng hợp V-(2-(hydroxyamino)-2-oxoethyl)-AA^-phenylglutaramid và các dẫn chất. 2. Thử tác dụng ức chế enzym HDAC và. thư. Một chất ức chế tự nhiên là trichostatin A (TSA) (I) và một số chất ức chế tổng hợp là các acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) (II) đã được nghiên cứu và báo cáo cho thấy chúng ức chế. NỘI NGUYỀN THỊ NGÂN TỔNG HỢP iV^-(2-(HYDROXYAMINO)-2- 0X0ETHỲL)-7V^-PHENỴLGLUTARAMID VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT HƯỚNG ứ c CHẾ HISTON DEACETYLASE KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược sĩ Người hướng dẫn: 1. ThS. Đào