Trong phạm vi khóa luận này, chúng tôi sử dụng một số nguyên liệu chính được trình bày ở bảng sau:
Nhóm nguyên liêu
Nguyên liệu
Nguồn gốc STT Tên nguyên liệu
1 Anilin, 4-methoxyanilin, 4-
cloroanilin, 4-fluoroanilin Merck, Đức
2 Anhydrid glutamic Aldrich, Đức
3 Methyl glycin ester Aldrich, Đức
Ị Hóa chất 4 CDI Merck, Đức
5 N H2O H .H C I Merck, Đức
6 TEA Merck, Đức
7 HCL 5%,NaHC03 5%,
NaOH, Acid acetic đặc Trung Quốc
IỊ Dung môi
8 Dimethylformamid
( H C 0 N ( C H 3 )2 - D M F )
Merck, Đức
9 Methanol, DCM Aldrich, Đức
Bảng 2: Các nguyên liệu cần dùng trong phản ứng
2.2. THIÉT BỊ DỤNG cụ
- Bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, máy khuấy từ gia nhiệt, sinh hàn hồi lưu, máy cất quay chân không, tủ lạnh, tủ sấy, pipet, phễu thủy tinh, giấy lọc.
cân phân tích, cân kỹ thuật, bình chạy sắc ký lớp mỏng TLC, cân phân tích, chỉ thị màu vạn năng.
- Sắc ký lóp mỏng tiến hành trên bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh.
- Nhiệt độ nóng chảy ( t ° n c ) được xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital).
- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin Elmer - USA tại bộ môn Hóa vật liệu - Khoa Hóa - Trưòng đại học Khoa học tự nhiên Hà Nộị
- Phổ khối lưọng (MS) được ghi bằng mảy khối phổ LTQ Orbitrap của Khoa Hóa - Trường đại học KHTNHN và máy Agilent 6310 ion Trap của Viện hóa học Việt Nam.
- Phổ cộng hưỏfng từ hạt nhân (‘H - NMR) và carbon - NMR) được ghi bằng máy Bruker AV-500 tại Viện khoa học và công nghệ Việt Nam.
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u
- Tổng hợp Â^-(2-(hydroxyamino)-2-oxoethyl)-Â^-phenylglutaramid và 3 dẫn chất.
- Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc của các chất tổng họp được.
- Thử tác dụng ức chế enzym HD AC và kháng tế bào ung thư in vitro của 4 chất N 1, N2, N3, N4 tổng hợp được.
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
Dựa trên nguyên tắc, phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng họfp các chất N1,N2, N3,N4.
Chi tiết các phản ứng chúng tôi xin được trình bày ở phần saụ
2.4.2. Kiểm tra độ tinh khiết
- Chạy SKLM, soi kiểm tra dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm. - Đo nhiệt độ nóng chảy trên máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện.
2.4.3. Xác định cấu trúc
Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên kết quả phân tích phổ IR, MS, ‘H-NMR, ‘^C-NMR. Trong đó:
- Phổ hồng ngoại được ghi trên máy Perkin-Elmer, sử dụng kỹ thuật viên nén KBr, trong vùng 4000-500 em '.
- Phổ khối lưọng (MS) được ghi trên máy khối phổ LTQ Orbitrap theo phương pháp ESI-MS (Electrospray ionization).
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (‘H-NMR, ’^C-NMR) được ghi trên máy Bmker AV-500, dùng DMSO làm dung môi và tetramethylsilan làm chất chuẩn.
2.4.4. Thử hoạt tính sinh học:
❖ Thử tác dụng ức chế enzym histon deacetylase: dựa trên phương pháp
Western blot.
❖ Thử độc tính tế bào in viíro: được thực hiện tại Khoa Dược, Trưòng Đại học Chungbuk, Chonju, Hàn Quốc theo phương pháp SRB và giá trị IC50 được tính theo phương pháp Probit. Dòng tế bào thử nghiệm là tể bào ung thư đại tràng SW620.
2.4.5. Tính logP, Kp; Sử dụng phần mềm KowWin tính giá trị logP, phần mềm DermWin tính Kp cho tìmg chất để đánh giá khả năng thấm thuốc qua màng sinh DermWin tính Kp cho tìmg chất để đánh giá khả năng thấm thuốc qua màng sinh học, qua da của các chất tổng họp được.
PHẦN III: THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. HÓA HỌC
Trong phạm vi khóa luận này, chúng tôi tiến hành tổng hợp
(hydroxyamino)-2-oxoethyl)-Ấ^-phenylglutaramid và 3 dẫn chất của nó. Sau đây chúng tôi xin trình bày cụ thể quy trình tổng hợp:
3.1.1. Tổng hợp các dẫn chất
Quy trình tổng hợp được tiến hành qua 3 giai đoạn:
'NH2 ((CH2)3C0)20 70°c D M F OCH, NH2OH.HCI NHOH-*--- R*- NaOH MeOH -5°c H o H OCH, 0 o Nc 3.1.1.1. Tổng hợp acid 5-oxo-5-(phenyIamino)pentanoic v à dẫn chất <♦ Sơ đồ phản ứng: 7 0 " c DlvIF R=H ; N la R=4-C1 : N3a R=0CH3 : N2a R=4-F : N4a *> Tiến hành phản ứng:
- Cho tiếp 2ml DMF vào bình cầu, lắc đều 1 phút. - Cho 6mmol anhydrid glutaric vào bình càụ
- Tiến hành phản ứng ở 70°c kết hợp khuấy từ 200 vòng /phút trong 24h.
- Trong quá trình làm phản ứng phải luôn theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động DMC:MeOH=20:1, pha tĩnh là silicagenG (chấm 2 vết: 1 vết của dẫn chất phenyl amin và 1 vết của dịch phản ứng đã pha loãng bằng DCM), chạy sắc ký và nhận biết bằng đèn tử ngoạị
<♦ X ử lý phản ứng:
- Cho vào hỗn họp phản ứng 40-50ml HCl 5% lạnh. Sản phẩm không tan trong HCl sẽ tạo tủạ
- Để yên 2h cho tủa hết.
- Lọc và rửa tủa bằng nước cất (3 lần, mỗi lần 30ml).
- Sấy sản phẩm đến Idiối lượng không đổi nhiệt độ 60°c.
- Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC (hòa tan sản phẩm đã sấy khô bằng dung môi DCM).
Sau đây là chi tiết các phản ứng tổng họp Nla, N2a, N3a, N4ạ ạ Tổng họp acid 5-oxo-5-(phenyIaniino)pentanoic
- Sơ đồ phản ứng:
^NIl2 70^^c
D M F
Tiến hành:
- Cho 5mmol anilin và 6mmol anhydrid glutaric vào bình cầu - Quy trình tiến hành giống như quy trình chung của dãy chất Na - Nhiệt độ phản ứng 70°c, thời gian phản ứng là 24h
- Cảm quan về sản phẩm: Thể rẳn, màu trắng
- Lượng sản phẩm: m^0,8460g
- Hiệu suất phản ứng: H=74,6%
- Kiểm ừ a sắc ký lớp mỏng với pha động là DCM: MeOH - 20:1 và soi
dưới đèn tử ngoại ta thu được một vểt rõ với Rf = 0,46.
b. Tổng họp acid 5-(4-methoxyphenylamino)-5-oxopentanoic - Sơ đồ phản ứng: NH2 70^C D M F H3C. o OH - Tiến hành:
- Cho 5mmol 4-methoxyanilin và ổmmol anhydrid gluataric vào bình cầu - Quy trình tiến hành giống như quy trình chung của dãy chất Na
- Nhiệt độ phản ứng 70°c, thời gian phản ứng là 24h - Kết quả;
- Cảm quan về sản phẩm: Thể rắn, màu tỉm đậm
- Lượng sản phẩm: m=l,03OOg
- Hiệu suất phản úng: H=82,7%
- Kiểm ừ"a sắc kỷ lớp mỏng với pha động là DCM: MeOH = 20:1 và soi
dưới đèn tử ngoại ta thu được một vết rô với Rf = 0,42.
c. Tổng họp acid 5-(4-clorophenylamino)-5-oxopentanoỉc - Sơ đồ phản ứng:
NII2
- Tiến hành;
- Quy trình tiến hành giống như quy trình chung của dãy chất Na - Nhiệt độ phản ứng 70°c, thời gian phản ứng là 24h
- Kết quả:
- Cảm quan về sản phẩm: Thể rắn, màu trắng
- Lượng sản phẩm: m=0,9783g
- Hiệu suẩt phản ứng: H - 85,38%
- Kiểm tra sắc kỷ lóp mỏng với pha động là DCM: MeOH = 20:1 và soi dưới đèn tử ngoại ta thu được một vết rô với R f - 0,37
d. Tổng họp acid 5-(4-fluorophenyIamino)-5-oxopentanoic - Sơ đồ phản ứng: NHo 70°c D M F OH - Tiến hành:
- Cho 5mmol 4-anilin vàfluoroanilin và ổmmol anhydrid glutaric vào bình cầu
- Quy trình tiến hành giống như quy trình chung của dãy chất Na - Nhiệt độ phản ứng 70*^c, thời gian phản ứng là 24h
- Kết quả:
- Cảm quan về sản phẩm: Thể rắn, màu nâu nhạt
- Lượng sản phẩm: m=0,8509g
- Hiệu suất phản úng: H= 71,65%
- Kiểm tra sắc kỷ lớp mỏng với pha động là DCM: MeOH - 20:1 và soi dưới đèn tử ngoại ta thu được một vết rô với Rf = 0,45
Bảng 3: Tóm tắt kết quả phản ứng 1
IW
Chât R m(g) H (%) Cảm quan vê sản phâm Rf
N la 4-H 0,8460 74,6% Thê răn, màu trăng 0,46
N2a 4-
0 CH3
l,0300g 82,7% Thê răn, màu tím đậm 0,42
N3a 4-Cl 0,9783 85,38% Thê răn, màu trăng 0,37
N4a 4-F 0,8509g 71,65% Thê răn, màu nâu nhạt 0,45
3.1.1.2. Tổng họp methyl 2-(5-oxo-5-(phenylamino)pentanamido)acetat và dẫn chất <* Sơ đồ phản ứng chung: NH. ^ ^ OH ____ D M F R-íí 0 C H 3 o (Ne) T E A , GDI 0 C H 3 R=H : N le R=4-C1 : N3e R=0 CH3 : N2e R=4-F : N4e ❖ Tiến hành phản ứng:
- Cho 3mmol dẫn chất acid 5-oxo-5-(phenylamino)pentanoic vào bình cầu 50ml khô, sạch.
- Cho tiếp 3ml DMF vào bình cầu, lắc đều 1 phút.
- Cho tiếp 4,5 mmol CDI vào bình cầu, hoạt hóa trong 20 phút. - Cho 4,5 mmol methyl glycin ester vàọ
- Cho tiếp 0,5 ml TEA vàọ
- Tiến hành phản ứng ở 60*^0 kết hợp khuấy từ 200 vòng/phút trong 24h.
- Trong quá trình làm phản ứng phải luôn theo dõi phản ÚTig bằng TLC với pha động DMC:MeOH=30:l, pha tĩnh là silicagenG (chấm 2 vết: 1 vết của sản phẩm phản ứng đầu và 1 vết của dịch phản ứng đã pha loãng bằng DCM), chạy sắc ký và nhận biết bằng đèn tử ngoạị
<♦ X ử lý phản ứng:
- Cô dịch phản ứng (hút chân không trong 20 phút nhiệt độ 50°c - 60*^C). - Cho vào hỗn họp phản ứng 40-50ml NaHCOs 5% lạnh (pH==8-9). Sản phẩm không tan trong NaHCOs sẽ tạo tủạ
- Đe yên 2h cho tủa hết.
- Lọc và rửa tủa bằng nước cất (3 lần, mỗi lần 30ml). - Sấy tủa ở 60°c đến khối lượng không đổị
- Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC (hòa tan sản phẩm đã sấy khô bằng dung môi DCM).
Sau đây là chi tiết các phản ứng tổng hợp Nle, N2e, N3e, N4ẹ ạ Tổng ho’p methyl 2-(5-oxo-5-(phenyIamino)pentanamido)acetat - Sơ đồ phản ứng:
.OH ,0CH3 H2N" DM F T E A , GDI OCH3 0 0 - Tiến hành:
- Cho 3mmol acid 5-oxo-5-(phenylamino)pentanoic vào bình cầu - Hoạt hóa bằng 4,5 mmol CDỊ
- Cho tiếp 4,5 mmol methyl glycin ester, 5ml TEA vào bình cầu - Tiến hành phản ứng như quy trình chung của dãy chất Nẹ - Thời gian phản ứng 24h, nhiệt độ 60°c.
-Kết quả:
- Cảm quan về sản phẩm: Thể rắn, màu trắng
- Lượng sản phẩm: m=0,457g
- Hiệu suất phản ứng: H=57,65%
- Kiểm ừ-a sắc hỷ lớp mỏng với pha động là DCM: MeOH =30:1 và soi
dưới đèn từ ngoại ta thu được một vết rô với Rf = 0,49.
b. Tổng họp methyl 2-(5-(4-methoxyphenylamino)-5-oxopentanamido)acetat - Sơ đồ phản ứng: .OH PCH3 H3C, DMF TEA , CDI 0CH3 - Tiến hành:
- Cho 3mmol acid 5-(4-methoxyphenylamino)-5-oxopentanoic vào bình
càu .
- Hoạt hóa bằng 4,5 mmol GDỊ
- Cho tiếp 4,5 mmol methyl glycin ester, 5ml TEA vào bình cầu - Tiến hành phản ứng như quy trình chung của dãy chất Nẹ - Thời gian phản ứng 24h, nhiệt độ 60°c
-Kết quả:
- Cảm quan về sản phẩm: Thể rắn, màn tím đậm
- Lượng sản phẩm: 171=0,59 Ig
- Hiệu suất phản ứng: H=63,68%
- Kiếm tra sắc ký lớp mỏng vói pha động là DCM: MeOH = 30:1 và soi
dưới đèn tử ngoại ta thu được một vết rõ với Rf = 0,54.
c. Tổng họp methyl 2-(5-(4-cIorophenylamino)-5-oxopentanamido)acetat - Sơ đồ phản ứng: OH 0 C H 3 H,N T E A T E A , C D ! 0 C H 3 - Tiến hành:
- Cho 3mmol acid 5-(4-clorophenylamino)-5-oxopentanoic vào bình cầụ - Hoạt hóa bằng 4,5 mmol CDL
- Cho tiếp 4,5 mmol methyl glycin ester, 5ml TEA vào bình cầu - Tiến hành phản ứng như quy trình chung của dãy chất Nẹ
- Thời gian phản ứng 24h, nhiệt độ 60°c
- Kết quả:
- Cảm quan về sản phẩm: Thể rắn, màu trắng ngà
- Lượng sản phẩm: m=0,5420g
- Hiệu suất phản ứng: H=55%
- Kiểm tra sắc kỷ lớp mỏng với pha động là DCM: MeOH = 30:1 v à s o i
dưới đèn tử ngoại ta thu được một vết rõ với Rf = 0,47.
d. Tổng họp methyl 2-(5-(4-fluorophenylainino)-5-oxopentanamido)acetat - Sơ đồ phản ứng: ,OH H2N OCHr, Ố ỏ T E A C D l 'OCH^ - Tiến hành:
- Cho 3mmol acid 5-(4-Fluorophenylamino)-5-oxopentanoic vòa bình cầu - Hoạt hóa bằng 4,5 mmol GDỊ
- Cho tiếp 4,5 mmol methyl glycin ester, 5ml TEA vào bình cầu - Tiến hành phản ứng như quy trình chung của dãy chất Nẹ - Thời gian phản ứng 24h, nhiệt độ 60°c
- Kết quả;
- Cảm quan về sản phẩm: Thể rắn, màu nâu nhạt
- Lượng sản phẩm: m=0,4076g
- Kiểm ừ'a sắc kỷ lớp mỏng vón pha động là DCM: MeOH -30:1 và soi dưới đèn tử ngoại ta thu được một vết rõ với Rf = 0,56.
Bảng 4: Tóm tắt kết quả phản ứng 2 o
R(-
H
0CH 3
Chât R m (g) H (%) Cảm quan vê sản phâm Rf
N le 4-H 0,457g 57,65 Thê răn, màu trăng 0,49
N2e 4-OCH3 0.591g 63,68 Thê răn, màu tím đậm 0,54
N3e 4-Cl 0,542g 55 Thê răn, màu trăng ngà 0,47
N4e 4-F 0,4076 45 Thê răn, màu nâu nhạt 0,56
3.1.1.3. Tổng họp Â^-(2-(hydroxyamino)-2-oxoethyI)-Â^-phenyIglutaramid và dẫn chất <♦ So’ đỗ phản ứng: + N H 2O H .H C 1 N aO H McOH - 5 ° c NHOH N <♦ Tiến hành phản ứng: R=H : NI R=4-C1 : N3 R=0CH3 : N2 R=4-F : N4
- Cho vào bình cầu tròn khô, sạch Immol dẫn chất methyl 2-(5-oxo-5- (phenylamino)pentanamido)acetat, lOmmol NH2OH.HCI, 3ml MeOH, Iml DCM.
- Dùng siêu âm hòa tan hỗn hợp phản ứng, làm lạnh dung dịch phản ứng bằng hỗn hợp nước đá-muối ăn.
- Hòa tan NaOH vào Iml nước cất, làm lạnh dung dịch phản ứng bằng hỗn hợp nước đá-muối ăn.
- Đổ từ từ dung dịch 20mmol NaOH vào bình cầu phản ứng, kết hợp khuấy từ 200vòng/phút.
- Thực hiện phản ứng ở trong bình muối đá nhiệt độ -5°c trong 15 phút.
- Trong quá trình làm phản ứng phải luôn theo dõi mức độ phản ứng bằng TLC với pha động DMC;MeOH:AcOH đặc=90:8:l, pha tĩnh là silicagenG (chấm 2 vết: 1 vết của sản phẩm phản ứng 2 và 1 vết của dịch phản ứng đã pha loãng bằng DCM), chạy sắc ký và nhận biết bằng đèn tử ngoại, hiện màu bằng dung dịch FeCls (màu đỏ nâu).
<♦ X ử lý phản ứng
- Cô dịch phản ứng (hút chân không trong 20 phút nhiệt độ 50°c - ÓÔ^C.
- Cho vào hỗn hợp phản ứng 40-50ml HCL 5% lạnh (pH=l-2). Sản phẩm không tan trong HCL sẽ tạo tủạ
- Để yên 2h cho tủa hết.
- Lọc và rửa tủa bằng nước cất (3 lần, mỗi lần 30ml). - Sấy tủa ở 60°c đến khối lượng không đổị
- Kiểm tra độ tinh Idiiết của sản phẩm bằng TLC (hòa tan sản phẩm đã sấy Ichô bằng dung môi DMF).
ạ Tổng họp Â^-(2-(hydroxyamino)-2-oxoethyl)-Â^-phenylglutaramid - Sơ đồ phản ứng: N H 2O H .H C 1 o NaOH -5°c M eOH NHOH - Tiến hành:
- Chất tham gia phản ứng là methyl 2-(5-0X0-5- (phenylamino)pentanamido)acetate
- Số mol các chất tham gia phản ứng như quy trình chung của dãy chất N - Tiến hành phản ứng như quy trình chung của dãy chất N.
- Tiến hành phản ứng ở nhiệt độ -5^c, thời gian 15 phút - Kết quả:
- Cảm quan về sản phẩm: Thể rắn, màu trắng
- Lượng sản phẩm: m=0,1580g
- Hiệu suất phản ứng: H=50,48%
- Kiểm ừ-a sắc kỷ lớp mòng với pha động ỉà DMC:MeOH:AcOH đặc^90:8: Ivà soi dưới đèn tử ngoại ta thu được một vết rõ với Rf =0,37.
b. Tổng hợp Â^-(2-(hydroxyamino)-2-oxoethyl)-Â^-(4- methoxyphenyl)glutaramid
HsC N H 2O H .H C I O N a O H - 5 ° c MeOH NHOH - Tiến hành:
- Chất tham gia phản ứng là methyl 2-(5-(4-methoxyphenylamino)-5- oxopentanamido)acetat
- Số mol các chất tham gia phản ứng như quy trình chung của dãy chất N - Tiến hành phản ứng như quy trình chung của dãy chất N.
- Tiến hành phản ứng ở nhiệt độ -5°c, thời gian 15 phút