3.2.1. Tác dụng ức chế enzym histon deacetylase ❖ Nguyên tắc
Tác dụng ức chế hoạt tính HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong rVSMCs. Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng. Chi tiết cách tiến hành được dựa trên phương pháp đã được công bố trước đây [18].
❖ Nguyên liệu và nuôi cấy tế bào:
Tế bào cơ trofn động mạch chuột chủng Wistar-Kyoto (WKY) và tế bào động mạch người được nuôi cấy đến khoảng 70% bão hòa trong môi trưòng nuôi cấy DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) có bổ sung 2mM glutamine, 10% huyết thanh bào thai bò đã được bất hoạt bằng nhiệt (heatinactivated fetal calf serum (Gibco BRL)) cùng với 50U/ml penicillin và 50)^g/ml sfreptomycin
(được gọi là môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh (complete medium (CM)). Tất cả tế bào được ủ ở 37°c với 5% (w/v) CO2 và 95% (w/v) không khí. Trước khi sử dụng, các mẫu thử nghiệm dạng bột được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO) để tạo dung dịch gốc nồng độ lOmM. Các dung dịch gốc sau đó được pha loãng bằng môi trưòng DMEM không có huyết thanh để tạo các dung dịch làm việc ở nồng độ trong khoảng từ 0,1 đến 100|0,M. Nồng độ DMSO cuối cùng không vưọft quá 0,1% và mẫu đối chứng DMSO được thêm vào một nhóm lỗ thử để có nồng độ DMSO đúng bàng nồng độ DMSO ở các lỗ có mẫu thử.
❖ Phân lập hỉston và Western Blot:
Các histon được phân lập bằng phưong pháp chiết acid. Tế bào (khoảng 5
X 10^) tì*ong mỗi lỗ của đĩa thử được thêm vào một thể tích nhất định mẫu thử đã pha loãng từ dung dịch gốc bằng môi trường DMEM không có huyết thanh như chuẩn bị ở phần trên. Song song làm mẫu trắng (không có mẫu thử) và mẫu đối chiếu (chỉ có dung dịch chứa DMSO). Sau đó, các tế bào được xử lý và rửa bằng dung dịch nước muối sinh lý có đệm phosphatẹ rVSMCs được dung giải trong dung dịch dung giải đệm làm lạnh bằng nước đá [lOmM HEPES (pH 7,9);
l,5mM MgCl2, lOmM KCl, 0,5mM DTT và 1.5mM
phenylmethylsulfonylfluoride], sau đó 5M H2SO4 được thêm vàọ Sau khi ủ trong đá 1 giờ, hỗn dịch được ly tâm và phần còn lại được thu hồi, ừộn với aceton với tỷ lệ 9: 1 sau đó giữ ở -2 0 °c qua đêm. Sau khi ly tâm tiếp, phần cặn rắn được rửa bằng ethanol 70% và làm khô. Phân đoạn histon tan trong acid được hòa tan trong nước. Hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp BCA (Pierce), và histon được điện di qua gel SDS-PAGE 15% và chuyển vào lớp màng PVDF. Các màng được ủ cùng histon kháng acetyl hóa H3 (Upstate Biotechnology), tiếp theo là kháng thể liên hợp peroxidase của ngựạ Các dải có
phản ứng dương tính được phát hiện nhờ sự phát quang đã được tăng cường. Đổi với MMP-2 Western blots, phân đoạn cytosolic của hVSMCs (5,0|j,g) được tách bằng SDSPAGE dưới điều kiện khử hóa sau đó chuyển sang màng nylon. Các màng này được lai hóa với kháng thể đơn dòng định hướng MMP-2 (Chemicon). Một kháng thể thứ cấp được liên hợp với peroxidase của ngựa và phức hợp miễn dịch được đánh giá bằng sự phát quang có kích hoạt. Các thí nghiệm được làm lặp lại ít nhất 3 lần một cách độc lập.
3.2.2. Độc tính tế bào ỉn vitro:
Thử nghiệm hoạt tính kháng các dòng té bào ung thư được tiến hành theo phương pháp SRB tại Khoa Dược, Đại học Choson, Kwangju, Hàn Quốc.
❖ Dòng tế bào thử nghiệm
Dòng tế bào ung thư được lấy từ ngân hàng tế bào ung thư người của Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) là tế bào ung thư đại tràng SW620.
Các tế bào này được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco modified Eagle) bổ sung L-glutamin (0,2 mM/ml), penicillin/ sữeptomycin (50 Ul/ml), amphotericin (5 Ul/ml), heparin (5 Ul/ml), 200 |ig/ml chất kích thích tăng tnrỏng tế bào (EGCS, Bedford, Mỹ), 10% huyết thanh bào thai bò (FBS) và được bảo quản ừong điều kiện tiêu chuẩn.
❖ Tiến hành
Độc tính tế bào của các chất được thử bằng phưcmg pháp SRB theo các bước sau:
Bước 1 (chuẩn bị): Các tế bào thử nghiệm đã trypsin hóa ở pha logarit được phân tán thành một hỗn dịch đơn bào trong môi tniòrng DMEM được bổ sung 5% FBS và được điều chỉnh đến nồng độ 5.ló* tế bào/ml. Lấy 180 |xl hỗn
dịch này phân vào các giếng của phiến vi lượng 96 giếng. Các phiến vi lượng này được ủ ở 37®C/5% CO2 trong không khí để tế bào phát triển. Sau 24 giờ, lấy 20 ịú hỗn dịch DMEM có bổ sung 5% FBS từ các phiến vi lượng đã được ủ, hòa tan trong DMSO tới các nồng độ khác nhau và tiếp tục ủ thêm 48 giờ. Tất cả các mẫu đều được chuẩn bị cho tới nồng độ cuối cùng trong DMSO không quá 0,1%.
Bước 2 (tiến hành thử): Các tế bào được cố định thành một lớp mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy ở từng giếng bằng 50 |J,1 acid ừicloroacetic lạnh, và được ủ ở 4”c trong 1 giờ. Sau đó, tiến hành rửa 5 lần bằng nước máy, để khô ở nhiệt độ không khí rồi nhuộm màu bằng sulforhodamin B 0,4% (kl/tt) trong acid acetic 1% trong khoảng 30 phút. Rửa 4 lần bằng acid acetic 1% để loại bỏ thuốc nhuộm không kết dính. Các phiến vi lượng này được để khô ở nhiệt độ phòng và phần thuốc nhuộm còn dính lại sẽ được hòa tan bởi 100 |il dung dịch Tris-base
10 mM không đệm (pH 10,5).
❖ Đọc kết quả
Độ hấp thụ được đọc trên máy Elisa ở 540 nm. Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (ừắng âm tính) và giá ừị này được tính dựa trên phần mềm Probits. Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 3 phép đo độc lập với các giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5% và IC50< 20 |Ảg/ml được coi là có hoạt tính.
Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư đại tràng SW620 của 4 chất N l, N2, N3, N4 trình bày ở bảng 11 phần bàn luận.
3.3. BÀN LUẬN 3.3.1. Hóa học
- ở phản ứng trên tác nhân anhydrid glutaramic là tác nhân acyl hóa mạnh nên phản ứng xảy ra dễ dàng, hiệu xuất cao (>70%).
- Điều kiện phản ứng là hóa chất, dung môi, dụng cụ phản ứng phải khan nước tránh sự thủy phân của anhydrid glutaric sẽ làm mất khả năng acyl hóa cùa nó. - Trong quá trình phản ứng phải gia nhiệt để phản ứng xảy ra nhanh và hoàn toàn.
*x* Phản ứng tổng hợp methyl 2-(5-oxo-5-(phenylamino)pentanamiílo)acetat
và các dẫn chất
- Do acid hữu cơ là tác nhân acyl hóa yếu nên trong phản ứng trên ta dùng CDI là chất xúc tác hoạt hóa nhóm carboxyl. Do đó dụng cụ, dung môi hóa chất phải khan nước tránh phân hủy CDỊ
- Cô dịch sau phản ứng bằng hút chân không (50°c, 20 phút) để loại bớt dung môi DMF.
❖ Tổng hợp N^-(2-(hydroxyamino)-2-oxoethyl)- -phenylglutaramíd
- Dùng hỗn hợp dung môi phản ứng là MeOH và DCM. - Nhiệt độ phản úng thấp (<-5°C) tránh phân hủy chức ester.
- Thời gian phản ứng ngắn tránh phân hủy nhóm amid trong môi trường kiềm. - Dung dịch NaOH phải đổ từ từ vào bình cầu tránh quá nhiệt.
3.3.2. Tác dụng ức chế enzym hỉstone deacetylase và độc tính tế bào
Sau khi tổng hợp và khẳng định chính xác cẩu trúc của 4 chất đã tổng hợp, chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng ức chế enzym histone deacetylase và độc tính tế bào ung thư trực tràng SW620. Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC ở nồng độ 10[.ig/ml trong 24h được trình bày ở hình 7.
Con N I N2 N3 N4
H 3
H 4
G A P D H
Hình 7; Kết quả thử hoạt tính ức chế HDAC của N l, N2, N3, N4
Dựa vào hình trên ta nhận thấy dải protein ứng với acetyl-histone-H3 và acetyl-histone-H4 rất mờ. Điều này chứng tỏ hoạt tính của HDAC đã không bị khóa bởi các chất N I, N2, N3, N4.
Chúng tôi cũng đã tiến hành thử độc tính tế bào của các chất đã tổng hợp. Kết quả như sau:
Bảng 11: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư đại tràng SW620
Chất R IC5o(fxg/ml)
NI r=.4_OCH3 > 30
N2 R=3-C1 >30
N3 R=4-C1 > 30
N4 R=4-F >30
Ghi chú: IC so : nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư thử nghiệm
Từ kết quả thử độc tính tế bào ung thư đại tràng SW620 chúng tôi đưa ra nhận xét: 4 chất chúng tôi đã tổng họp được N l, N2, N3, N4 không gây độc với tế bào ung thư đại tràng SW620 (IC50 > 30|ag/ml).
Bảng 12: Giá tĩỊ LogP, Kp ước tính của dãy chất N và SAHA Chât NI N2 N3 N4 SAHA LogP -0,87 -0,78 -0,22 -0,67 1,44 Kp (10'^cm/h) 1,13x10'^ 8,66x10'^ 1,94x10'^ 1,22x10’^ 4,64x10’^ SAH A NHOH N
Dựa vào công thức cấu tạo của SAHA và hợp chất tổng hợp được ta nhận thấy 4 chất N l, N2, N3, N4 đều có cầu nối 6 nguyên tử tưong tự SAHA, tuy nhiên do có nhiều liên kết amid nên các hợp chất này phân cực hon nên khả năng thấm thuốc qua màng sinh học kém. Chính vì vậy thuốc không có hoạt tính ức chế HDAC.
Do liên kết N-C làm ngắn cầu nối (d c-c =1,54 A°, d N-C= 1,32 A®), nên nhóm hydroxamic không tiến vào trung tâm hoạt động của HDAC liên kết với
nên không có tác dung ức chế HDAC.
Do cản trở không gian của nhóm c= 0 làm cho nhóm hydroxamic không vào được trung tâm hoạt đông của HDAC.
PHẦN IV. KỂT LUẬN VÀ ĐẺ XUẤT 4.1. KẾT LUẬN
❖ Kết luân 1:
Tổng hợp được dẫn chất N ‘-(2-(hydroxyamino)-2-oxoethyl)-Â^- phenylglutaramid như dự kiến bao gồm:
- V-(2-(hydroxyamino)-2-oxoethyl)-Â^-(4-methoxyphenyl)glutaramid (Nl). - Â^-(3-clorophenyl)- iV^-(2-(hydroxyamino)-2-oxoethyl)glutaramid (N2).
- Â^-(4-clorophenyl)- iV^-(2-(hydroxyamino)-2-oxoethyl)glutaramid (N3). - V-(4-Florophenyl)- 7V^-(2-(hydroxyamino)-2-oxoethyl)glutaramid (N4).
❖ Kết luận 2 .
Thử hoạt tính tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của 4 chất tổng họp N l, N2, N3, N4. Kết quả cho thấy 4 chất tổng hợp được không có tác dụng ức chế HDAC và không gây độc cho tế bàọ
4.2. ĐỀ XUẤT
Với két quả tìiử tác dụng sinh học của các chất tổng họp N l, N2, N3, N4 chúng tôi đưa ra 2 đề xuất sau:
- Nghiên cứu tổng hợp các dãy chất có cầu nối 5, 6 carbon thay thế vòng benzen bằng các vòng thom khác.
- Nghiên cứu tổng hợp các dãy chất tương tự như khóa luận nhưng kéo dài cầu nối carbon để giảm tính phân cực của chúng.
học, trang
2. Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2006), Hóa phân tích, tập 2, nxb Y học
3. Bùi Thu Quyên (2009), Các mục tiêu phân tử hiện nay trong nghiên cứu
phát triển thuốc ung thư, Đại học Dược Hà Nộị
4. Phan Nữ Nguyệt Thịnh (2010), Tổng hợp N'-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N^-
hydroxysuccinamid và các dẫn chất hướng ức chế enzym histon
deacetylase, Đại học Dược Hà Nộị
5. Nguyễn Đình Triệu (2001), Các phương pháp phân tích vật lỷ và hóa lý,
NXB Khoa học kỹ thuật, Tập 1, ừ. 29-110, 290-361.
6. Nguyễn Đình Triệu (2005), Phương pháp phổ khối lượng, Nxb Khoa học kỹ thuật.
7. Trưòng đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Công nghiệp Dược (2006), Kỹ thuật
sản xuất dược phẩm, NXB Y học, Tập 1, tr. 46-52, 84-100.
8. Trường đại học Y Hà Nội (1999), bài giảng ung thư học, nxb Y học, trang
9-38.
9. http://www.khoahoc.com.vn/doisong/yhoc/suc-khoe/1585 l_Lan-song- thuoc-dieu-tri-ung-thu-the-he-moịaspx
Phần 1: TIẾNG VIỆT
10.Achaiya MR, Spaireboom A, Venitz J, Figg WD (2008), "Rational development of histone deacetylase inhibitors as anticancer agents: a review", Mol Pharmacol68 (4), pp: 917-32.
gemtuzumab ozogamicin in relapsed acute myeloid leukemia. C a n c e r
Res, 1 (6), pp: 1490-6.
12.de Ruijter AJ, van Gennip AH, Caron HN, Kemp S, van Kuilenburg AB (March 2003), "Histone deacetylases (HDACs): characterization of the classical HDAC family", Biochem. J. 370 (Pt 3), pp: 737-^9.
13.Deininger MW, Druker BJ (September 2003), "Specific targeted therapy of chronic myelogenous leukemia with imatinib", Pharmacol, Rev. 55 (3), pp: 401-23.
14.Dokmanovic M, Clarke C, Marks PA (2007), "Histone deacetylase inhibitors: overview and perspectives". Mol. Cancer Res, 5 (10), pp: 981- 999.
15.Ellis L, Pili R, “Histone Deacetylase Inhibitors: Advancing Therapeutic Strategies in Hematological and Solid Malignancies” , Pharmaceuticals
(Basel) (2010), 3(8), pp: 2411-2469.
16.Kim HJ, Bae SC, “Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs” . Am J Transl Res (2011 Feb), 3(2), pp: 166-179.
17.Marks P, Rifkind RA, Richon VM, Breslow R, Miller T, Kelly WK, “Histone deacetylases and cancer: causes and therapies”, Nat Rev Cancer (2001 Dec), 1(3), pp: 194-202. Review.
18.Qiu L, Burgess A, Fairlie DP, Leonard H, Parsons PG, Gabrielli BG, “Histone deacetylase inhibitors trigger a G2 checkpoint in normal cells that
expression is increased in the prefrontal cortex of schizophrenia subjects: Analysis of the National Brain Databank microarray collection",
Schizophrenia Research, 98 (1-3), pp: 111.
20.Takimoto CH, Calvo E, "Principles of Oncologic Pharmacotherapy" in Pazdur R, Wagman LD, Camphausen KA, Hoskins WJ (Eds) Cancer Management: A Multidisciplinary Approach. 11 ed. 2008.
21.Vinh A, Gaspari TA, Liu HB, Dousha LF, Wiđop RE, Dear AE, “A novel histone deacetylase inhibitor reduces abdominal aortic aneurysm formation in angiotensin Il-infused apolipoprotein E-deficient mice”, J Vase Res (2008), 45(2), pp: 143-152.
22.Wahhab Ạ et al (2009), “Sulfamides as novel histone deacetylase inhibitors”, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, xxx, xxx-xxx. 23.Warrener R, Beamish H, Burgess A, Waterhouse NJ, Giles N, Fairlie D, and
Gabrielli B (2003) Tumor cell-selective cytotoxicity by targeting cell cycle checkpoints. FASEB J 17, pp: 1550-1552.
24.Wu L, Smythe AM, Stinson SF, Mullendore LA, Monks A, Scudiero DA, Pauli KD, Koutsoukos AD, Rubinstein LV, Boyd MR, et al., “Multidrug- resistant phenotype of disease-oriented panels of human tumor cell lines used for anticancer drug screening”. Cancer Res. (1992 Jun 1), 52(11), pp: 3029-3034.
PHỤ LỤC 1 : Phổ hồng ngoại chất Nal PHỤ LỤC 2: Phổ hồng ngoại chất N2a PHỤ LỤC 3 : Phổ hồng ngoại chất N3a PHỤ LỤC 4: Phổ hồng ngoại chất N4a PHỤ LỤC 5 ; Phổ hồng ngoại chất N 1 PHỤ LỤC 6: Phổ hồng ngoại chất N2 PHỤ LỤC 7: Phổ hồng ngoại chất N3 PHỤ LỤC 8 : Phổ hồng ngoại chất N3 PHỤ LỤC 9: Phổ ESI-MS của chất Nel PHỤ LỤC 10: Phổ ESI-MS của chất N2e PHỤ LỤC 11 : Phổ ESI-MS của chất Ne3 PHỤ LỤC 12: Phổ ESI-MS của chất Ne4 PHỤ LỤC 13: Phổ ESI-MS của chất NI PHỤ LỤC 14: Phổ ESI-MS của chất N2 PHỤ LỤC 15: Phổ ESI-MS của chất N3 PHỤ LỤC 16: Phổ ESI-MS của chất N4 PHỤ LỤC 17: Phổ 'H-NMR của chất NI PHỤ LỤC 18: Phổ ‘H-NMR của chất N2 PHỰ LỤC 19: Phổ ‘H-NMR của chất N3 PHỤ LỤC 20: Phổ 'H-NMR của chất N4 PHỤ LỤC 21 : Phổ ’^C-NMR của chất NI PHỤ LỤC 22; Phổ ‘^C-NMR của chất N2 PHỤ LỤC 23: Phổ *^C-NMR của chất N3 PHỤ LỤC 24: Phổ *^C-NMR của chất N4
Resolution: 4cm -1 Date: 3/7/2011
Mail: m aiplm @ yahoọcom ten mau: TaNH2 / • i )
cm-1
Resolution; 4cm-1 Date: 11/15/2010
Mail: sonhuco@ yahoọcom
T E N M A U : N I A
Resolution: 4cm -1 Date: 11/12/2010
Mail: sonhuco@yahoọcom TEN MAU: N3a
Resolution: 4cm -1 Date: 11/15/2010
Mail: sonhuco@ yahoọcom
Date: 5/9/2011 Tenm au:SP4 MAƯ20A
c m -l
Resolution; 4cm -1 Date; 11/15/2010
M ail; sonhuco@ yahoọcom
Resolution: 4cm -1 Date: 11/12/2010
Mail: sonhuco@yahoọcom
TENMAU: N31 'i r ‘
Resolution: 4cm -1 Date: 11/12/2010
Mail: sonhuco@yahoọcom TEN MAU: N4
Method: DO MS.m
Sample Name: TeNH2
Operator: Phong PTHC, Vien Hoa HCTN Acq. Date: 2/22/2011 11:16:02 AM
MSD Trap Report v 4 (A4-Opt2) Page 1 of 1
PHU LUC 9: Pho ESI-MS cua chat N le
6 2 .2 0 O a n h _ N 1 e _ 1 0 1 0 2 5 0 8 5 7 0 5 # 1 0 8 2 RT: 2 .3 3 AV: 1 N L: 2 .8 4 E 5 T: ITM S + c E S I Full m s [5 5 .0 0 -5 0 0 .0 0 ] 100 95^ 9 0 8 5 - 8 0 75^ 70£ 6 5 ^ 6 0 I I 50f I 4 0 3 5 - 3 0 2 5 - 2 0 £ 1 5 ^ 1 0 ^ 5 0 3 3 1 .1 6 \v dm r " o 6 O C H a 3 0 9 .2 3 I 3 3 5 .1 5
PHU LUC 10: Ph6 ESI-MS cua ch it N2e
LTQOrbitrapXL'"
Thermo S C IEN TIFIC compan
Resolution: >60 0 0 0 Dt Sensitivity: 10 ‘'‘ Tandem: n >= 15