Tổng hợp n1 (benzodthiazol 2 yi) hydroxyadipamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deatylase

Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI • • • • HOÀNG VĂN HẢI TỔNG HỢP N‘-(BENZ0[D]THIAZ0L-2- y l )-n ‘‘-h y Ộr o x y a d ipam id v à Mộ t số DẪN CHẤT HƯỚNG ức CHẾ HISTON DEACETYLASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ • • • Ngưòi hướng dẫn: 1. PGS.TS. Nguyễn Hải Nam 2. DS. Tràn Văn Nam Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa dược TRUỒNCÍĐH DUỢC HẰ NỘ! T H U V 3Ệ i \ ‘Ì . 1 Wgày ,. j tháng ■■Ị^năm 2Q 1 , HÀ NỘI-2011 LỜI CẢM ƠN Trước hết với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất cho em xin bày tỏ lòng cám ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Hải Nam, Ths. Đào Thị Kim Oanh, DS. Trần Văn Nam - Bộ môn Hóa dược - Trưòng Đại học Dược Hà Nội. Những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Hóa dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - Đại học KHTN Hà Nội, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đại học quốc gia Chungbuk đă luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Cuối cùng em xin được gửi lời biết on sâu sắc đến bố mẹ, gia đình và bạn bè đã luôn luôn ở bên khích lệ, động viên, giúp đỡ em trong học tập cũng như trong cuộc sống. Hà Nội, ngày 05 tháng 05 năm 2011 Sinh viên Hoàng Văn Hải MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐÈ 1 PHÀN 1. TỎ N G Q U A N 3 1.1. HISTON DEACETYLASE 3 1.1.1. Phân loại 4 1.1.1.1. Các HDAC nhóm 1 5 1.1.1.2. Các HDAC nhóm II 5 1.1.1.3. H D A C ll 6 1.1.2. CấutạoHDAC 6 1.1.3. íiDAC và ung thư 8 1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 10 1.2.1. Phân loại các HDACi 10 1.2.2. Cơ chế tác dụng 13 1.2.3. Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng 15 1.3. PHẢN ỨNG ACETYL HÓA 17 1.3.1. Tác nhân acyl hóa là acid carboxylic 17 1.3.2. Tác nhân acyl hóa là ester 18 PHẦN 2. NGUYÊN LIỆU, THIÉT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ’ ^ 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 19 2.1.1. Hóa chất 19 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 19 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN c ử u 20 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 20 2.3.1. Tổnghợp hóahọc 20 2.3.2. Xác định cấu trúc 20 2.3.3. Thử tác dụng ức chế HD AC và tác dụng kháng ung thư của 6 chất tổng hợp được 2 1 2.3.4. Nhận xét mối liên quan giữa cấu trúc tác dụng và đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất tổng hợp được 23 PHẢN 3: THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ, BÀN LUẬN 25 3.1. HÓA HỌC 25 3.1.1. Tổng hợp hóa học 25 3.1.1.1. Tổng họp methyl 5-(benzo[¿/]thiazol-2-yl carbomoyl)pentanoat và dẫn chất 25 3.1.1.2. Tổng hợp A^^-(benzo[¿/]thiazol-2-yl)-A^-hydroxyadipamid và dẫn chất(H) 31 3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết 37 3.1.3. Xác định cấu trúc 38 3.1.3.1. Kết quả phân tích phổ dãy chất He 38 3.1.3.2. Kết quả phân tích phổ dãy chất H 40 3.2. THỬ TÁC DỤNG ứ c CHẾ ENZYM HISTON DEACETYLASE 45 3.3. BÀN LUẬN 46 3.3.1. Tổng hợp hóa học 46 3.3.2. Tác dụng ức enzym histon deacetylase và độc tính tế bào 46 4. KẾT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT 50 4.1. KẾT LUẬN 50 4.2. ĐỀ XUẤT 50 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIỂT TẤT ALL AML CDI CLL CTCL CTCT CTPT DCM DMF DMSO GADPH HDAC HDACi HSP90 KLPT MDS MEF2 NSCLC SAR TLC (Acute lymphoblastic leukemia) Bệnh tiền nguyên bạch cầu thể cấp (Acute myoloid leukemia) Leukima cấp thể tủy 1,1 -Carbonyldiimidazol (Chronic lymphocytic leukemia) Bệnh lympho mạn tính (Cutaneous T cell lymphoma) Te bào lympho T dưới da Công thức cấu tạo Công thức phân tử Dicloromethan N,N-dimethylformamid Dimethylsulfoxid Glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenase Histon deacetylase Histon deacetylase inhibitors (các chất ức chế HDAC) (Heat shock protein 90) Protein sốc nhiệt-90 Khối lượng phân tử (Myelodysplastic Syndromes) Hội chứng dị sinh tủy (Myocyte enhancer factor-2) Yếu tố dịch mã MEF-2 (Non-small lung cell) ưng thư phổi tế bào không nhỏ Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 : Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng Bảng 2 : Khả năng ức chế các loại HDAC của một số chất Bảng 3 : Hiệu suất và một số chỉ số hóa lý của methyl 5- (benzo[d]thiazol-2 -yl carbamoyl)pentanoat và dẫn chất Bảng 4 : Hiệu suất và một số chỉ số hóa lý của V-benzo[<i]thiazol-2- yl-A^-hydroxyadipamid và dẫn chất Bảng 5 Giá trị Rf và t°nc của các chất tổng hợp được Bảng 6 : Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của dãy chất He Bảng 7 Kết quả phân tích phổ khối lượng của dãy chất He Bảng 8 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của dãy chất H Bảng 9 : Kết quả phân tích phổ khối lượng của dãy chất H Bảng 10 : Kết quả phân tích phổ ’H-NMR của dãy chất H Bảng 11 : Kết quả phân tích phổ *^C-NMR của dãy chất H Bảng 12 : Độc tính trên tế bào ung thư đại tràng SW620 của dãy chất H Bảng 13 : Giá trị LogP, Kp ước tính của dãy chất H Bảng 14 : Đánh giá độ giống thuốc của dãy chất H DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 : Sơ đồ cấu tạo của nucleosome Hình 2 : Biểu đồ mô tả các loại HDAC Hình 3 : cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC Hình 4 : Vùng ion của HDAC8 Hình 5 : Chức năng của HDAC Hình 6 : Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào ung thư Hình 7 : Một số chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng Hình 8 : Cơ chế tác dụng trong tế bào của các chất ức chế HDAC Hình 9 : Cơ chế tác dụng giữa các tế bào của các chất ức chế HDAC Hình 10 : cấu trúc của SAHA và trung tâm hoạt động của HDAC Hình 11 : sAR của các chất ức chế HDAC dẫn chất acid hydroxamic Hình 12 : Một số carbodiimid hay dùng Hình 13 : Sơ đồ phân mảnh của chất He2 Hình 14 : Sơ đồ phân mảnh của chất H2 Hình 15 : Tác dụng ức chế HDAC của các chất H Hình 16 : cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC và TSA ĐẶT VẤN ĐÈ Trong những năm gần đây với sự tiến bộ của khoa học công nghệ, đặc biệt là công nghệ sinh học, việc nghiên cứu và phát triển thuốc mới đã có những thay đổi quan trọng. Nếu như trước đây việc nghiên cứu phát triển thuốc dựa trên sự sàng lọc ngẫu nhiên thì ngày nay nghiên cứu phát triển thuốc dựa trên các mục tiêu phân tử rõ ràng. Có thể kể đến các mục tiêu phân tử đang được quan tâm hiện nay như: aminoacyl t-ARN synthetase trong việc kháng thuốc của vi khuẩn, vanilloid receptor trong bệnh Alzheimer, proxisome proliferator- activated receptor (PPAR) trong bệnh tiểu đưòng và rối loạn lipid máu Đặc biệt bệnh ung thư và các mục tiêu phân tử của nó đang rất được quan tâm. Histon deacetylase, các protein kinase, phosphoinositide-3-kinase (PI3K), telomerase, các enzym điều hoà chu trình sống cũng như sự chết của tế bào, Ras và protein famesyl transferase là những đích phân tử đang được hướng tới trong việc tìm ra thuốc trị ung thư. Histon deacetylase (HDAC) là nhóm enzym xúc tác quá trình deacetyl hoá nhóm s - N acetyl lysine amino acid ở phần đuôi của histon. Trong tế bào ung thư do hoạt động quá mức của HDAC nên làm giảm sự acetyl hóa của histon, ức chế quá trình phiên mã thông qua việc đóng xoắn của nhiễm sắc thể. Các chất ức chế HDAC giúp cho việc gắn nhóm acetyl vào lysin của phần đuôi histon, tạo điều kiện cho quá trình phiên mã. Các sai lệch trong quá trình phiên mã là một trong những nguyên nhân dẫn đến hình thành khối u. Do đó HDAC là một trong những mục tiêu phân tử của các thuốc kháng ung thư. Trong những năm gần đây, các chất ức chế HDAC đang được nghiên cứu rất nhiều trên thế giới và trở thành các chất triển vọng trong điều trị ung thư. Acid suberoylanilid hydroxamic (Vorinostat, Zolinza®) là chất ức chế enzym HDAC đầu tiên đã được FDA cấp phép trong điều trị u lympho tế bào T dưới da. Ngoài ra còn khoảng trên 15 chất ức chế HDAC khác đang được nghiên cứu và đưa vào thử nghiệm lâm sàng. Như vậy nghiên cứu các chất ức chế HDAC là rất khả quan. Tuy nhiên ở Việt Nam việc thiết kế nghiên cứu các chất ức chế HDAC vẫn chưa được quan tâm. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “ Tổng hợp N^-(benzo[d]thiazol-2-yl)-]S^-hydroxyadipamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase’^ với 2 mục tiêu chính: - Tổng hợp V-(benzo[í/]thiazol-2-yl)-A^-hydroxyadipamid và 5 dẫn chất. - Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào in viừ-0 của các chất tổng hợp được. PHẦN 1. TỎNG QUAN 1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC) Nucleosome là đơn vị cơ bản cấu tạo nên nhiễm sắc thể. Một nucleosome điển hình bao gồm 1 octomer hình đĩa của 4 cặp histon (2 cặp của H2Avới H2B và 2 cặp của H3 với H4) được quấn quanh bởi 146 cặp nucleotid (hình 1). Đầu amin của histon mang nhiều điện tích dương nên tương tác mạnh với phần phosphat mang điện âm trên phân tử ADN tạo nên cấu trúc nucleosome và các cấu trúc bậc cao hơn của nhiễm sắc thể, quy định quá trình biểu thị gen. Khi histon tích điện dưong lớn, tương tác này mạnh làm đóng xoắn nhiễm sắc thể gây ức chế quá trình dịch mã và tổng hợp protein, làm ức chế sự biểu thị của gen. Ngược lại khi tương tác điện tích này yếu nhiễm sắc thể tháo xoắn, quá trình tổng hợp protein diễn ra, đặc tính của gen được biểu hiện thông qua các tính trạng. Quá trình này diễn ra đặc biệt mạnh ở H3 và H4. Việc tích điện dương của histon mạnh hay yếu thông qua quá trình acetyl hóa đầu amin ở phần đuôi của histon. Acetyl hóa trung hòa điện tích dương của histon làm nới lỏng tương tác của nó với ADN trong khi đó deacetyl hóa có tác dụng ngược lại. Trong tế bào, enzym histon acetyltranferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) là 2 enzym điều hòa quá trình acetyl hóa này từ đó quyết định sự biểu hiện của gen. [19,27,30'. H2A Niỉcleosocne (8 hìstone moíecute« 146 nucleờtẵcle pairs of DMA) ____ \ r Hình 1; Sơ đô câu tạo của nucleosome [...]... r IIA nhóm IIB Hợp chât Acid carboxylic (acid valproic) > SAHA 0 01 LBH-589 I 9- o* PXD-101 NVP-LAQ- 824 CRA- 024 781 0 MS -27 5 p> o g" ầ MGCD-0103 3 Peptid vòng (FK 228 ) hông ức chế ức chê mạnh ức chế yếu nd: không có dữ liệu 1 .2. 2 Cơ chế tác dụng • Cơ chế tác dụng trong tế bào của các chẩt ức chế HDAC: Các chất ức chế HD AC tác động trên một số gen bằng cách [15 ,23 ,25 ] (hình 8 ): - ứ c chế chu trình tế... NMR) và carbon - NMR) được ghi bằng máy Bmker AV-500 tại Trung tâm khoa học và công nghệ Việt Nam NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u 2 2 - Tổng hợp V-(benzo[J]thiazol -2- yl)-A/^ -hydroxyadipamid và 5 dẫn chất - Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc của các chất tổng họp được - Thử tác dụng ức chế enzym HDAC và kháng tế bào ung thư ỉn vitro của 6 chất tổng hợp được 2. 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u - Tổng hợp V-(benzo[í/]thiazol -2- yl)-A^ -hydroxyadipamid. .. Tổng hợp V-(benzo[í/]thiazol -2- yl)-A^ -hydroxyadipamid và 5 dẫn chất - Kiểm tra độ tinh khiết - Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được - Thử tác dụng ức chế enzym HDAC và kháng ung thư in vitro của 6 chất tổng hơp được 2. 3.1 Tổng hợp hóa học - Dựa trên những nguyên tắc, phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp các dẫn chất thiết kế Dùng phản ứng N - acyl hóa để tổng họrp, khảo sát điều kiện... Một số chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng Tuy nhiên các nhóm khác nhau có tác dụng ức chế các loại HDAC khác nhau Các acid hydroxamic ức chế mạnh HDAC nhóm I và nhóm II Các acid carboxylic ức chế mạnh HDAC nhóm I Các peptid vòng ức chế mạnh ỈĨDAC nhóm I Đối với HDACl 1 vẫn chưa có dữ liệu về các chất ức chế nhóm này 30] Kết quả cụ thể về sự ức chế các loại HDAC được trình bày ở bảng 2  12. .. AV-500 tại Trung tâm khoa học và công nghệ Việt Nam dùng DMSO làm dung môi, lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS) 2. 3.3 Thử tác dụng ức chế HDAC và tác dụng kháng ung thư của 6 chất tổng hợp được * Thử tác dụng ức chế enzym histon deacetylase Tác dụng ức chế hoạt tính HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong rVSMCs... c chế sự tạo mạch - Thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình 14 ce II cV,Ie arfe«it/ C ỉ j f I i ??I A lit i ■ Hinh 8 : Cơ chế tác dụng trong tế bào của các chất ức chế HDAC • Cơ chế tác dụng giữa các tế bào của các chất ức chế HDAC: Các chất ức chế HDAC ngăn cản các đuôi histon có nhóm acetyl tiến đến vị trí xúc tác (hình 9) Hình 9: Cơ chế tác dụng giữa các tế bào của các chất ức chế HDAC 15 1 .2. 3... + Số trung tâm cho liên kết hydro (NH, OH) phải nhỏ hơn 5 + Cân bằng giữa tính thân nước/dầu: logP < 5 + Số liên kết linh động phải nhỏ hơn 15 26 PHẦN 3 THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 HÓA HỌC 3.1.1 Tổng hợp hóa học Quy trình tổng hợp được tiến hành qua 2 giai đoạn 3.1.1.1 Tổng hợp methyl 5-(benzo[ế/Ịthiazol -2- yl carbomoyl)pentanoat và dẫn chất Quy trình tổng hợp methyl 5-(benzo[ . PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 20 2. 3.1. Tổnghợp hóahọc 20 2. 3 .2. Xác định cấu trúc 20 2. 3.3. Thử tác dụng ức chế HD AC và tác dụng kháng ung thư của 6 chất tổng hợp được 2 1 2. 3.4. Nhận xét mối liên. (FK 228 ) ức chê mạnh Ị ức chế yếu HD AC nhóm IIA HDAC nhóm IIB hông ức chế nd: không có dữ liệu 1 .2. 2. Cơ chế tác dụng • Cơ chế tác dụng trong tế bào của các chẩt ức chế HDAC: Các chất ức chế. ức chế HDAC vẫn chưa được quan tâm. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “ Tổng hợp N^-(benzo[d]thiazol -2- yl)-]S^ -hydroxyadipamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase’^ với 2 mục