Có nhiều cách khác nhau để tổng hợp acid hydroxamic từ ester nhưng hay dùng nhất với xúc tác KCN hoặc NaOH. Các phản ứng được tiến hành như sau [23,29]: KCN RCOOMe + NH2OH RCONHOH MeOH RCOOMe + NH2OH NaOH HoO/MeOH RCONHOH
Tùy trong từng trường hợp cụ thể, đối với các chất khác nhau điều kiện tiến hành phản ứng (dung môi, nhiệt độ, thời gian) cũng có sự thay đổi.
PHẦN 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG Vầ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 2.1.1. Hóa chất
Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm là loại dành cho tổng hợp được nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich. Bao gồm:
- Hydroxylamin hydroclorid - Acid monomethyl adipic - GDI
- Các 2-aminobenzothiazol gồm:
2-aminobenzothiazol 2-amino-6-ethoxybenzothiazol
2-amino-6-methylbenzothiazol 2-amino-6-methylsulfonylbenzothiazol
2-amino-6-nitrobenzothiazol 2-amino-6-methoxybenzothiazol
- Các hóa chât và dung môi khác cân cho tông hợp: NaOH, DCM, DMF, MeOH, HCl, Aceton
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- Bình cầu đáy tròn dung tắch 50 ml có nút mài, máy khuấy từ gia nhiệt, sinh hàn hồi lưu, máy cất quay chân không, tủ lạnh, tủ sấy, pipet, phễu thủy tinh, giấy lọc, cân phân tắch, cân kỹ thuật, bình chạy sắc ký lóp mỏng (SKLM), chị thị màu vạn năng.
- SKLM tiến hành trên bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh.
- Nhiệt độ nóng chảy (tổnc) được xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital).
- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin Elmer - USA tại bộ môn Hóa vật liệu - Khoa hóa - Trường đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội.
- Phổ khối lượng (MS) được ghi bằng máy khối phổ HP 5989B-MS của Viện hóa học Việt Nam và Khoa hóa - Trường đại học KHTNHN
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (’H - NMR) và carbon - NMR) được
ghi bằng máy Bmker AV-500 tại Trung tâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
2.2 . NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u
- Tổng hợp V-(benzo[J]thiazol-2-yl)-A/^-hydroxyadipamid và 5 dẫn chất.
- Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc của các chất tổng họp được.
- Thử tác dụng ức chế enzym HDAC và kháng tế bào ung thư ỉn vitro
của 6 chất tổng hợp được
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
- Tổng hợp V-(benzo[ắ/]thiazol-2-yl)-A^-hydroxyadipamid và 5 dẫn chất.
- Kiểm tra độ tinh khiết
- Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được.
- Thử tác dụng ức chế enzym HDAC và kháng ung thư in vitro của 6 chất tổng hơp được
2.3.1. Tổng hợp hóa học
- Dựa trên những nguyên tắc, phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp các dẫn chất thiết kế. Dùng phản ứng N - acyl hóa để tổng họrp, khảo sát điều kiện phản ứng để thu được hiệu suất tối ưu.
- Kiểm tra nhanh phản ứng bằng TLC
- Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và nhiệt độ nóng chảy
Các chất tổng hợp được được xác định cấu trúc bằng các phổ: Phổ hồng ngoại (IR), Phổ khối (MS), Phổ cộng hưởng từ proton ('H - NMR), phổ cộng hưỏng từ carbon (*^c - NMR).
* Phổ hồng ngoại (IR): Phổ hồng ngoại được ghi tại Khoa hóa, Trường đại học KHTN Hà Nội, trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-600cm‘*. Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1 : 2 0 0 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút
chân không để loại bỏ hơi ẩm [2,5].
* Phổ khối lượng (MS): Phổ khối lượng các chất được ghi tại Khoa hóa
Trường đại học KHTN Hà Nội với chế độ đo ESI (He 1-6 và H l), dung môi acetonitril và tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Trung tâm khoa học
công nghệ Việt Nam với chế độ đo EI (H2-6), dung môi acetonitril [1-3,5,6’.
* Phổ cộng hưởng từ proton ('H - NMR), phổ cộng hưởng từ carbon ('^C - NMR) được ghi trên máy Bruker AV-500 tại Trung tâm khoa học và công nghệ Việt Nam dùng DMSO làm dung môi, lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS).
2.3.3. Thử tác dụng ức chế HDAC và tác dụng kháng ung thư của 6 chất tổng hợp được
* Thử tác dụng ức chế enzym histon deacetylase
Tác dụng ức chế hoạt tắnh HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong rVSMCs. Phân tắch dựa trên Western blot có thể khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng. Chi tiết cách tiến hành được dựa trên phưong pháp đã được công bố trước đây [13, 25].
xế bào cơ trom động mạch chuột chủng Wistar-Kyoto (WKY) và tế bào động mạch người được nuôi cấy đến khoảng 70% bão hòa trong môi trường nuôi cấy DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) có bổ sung 2mM glutamine, 10% huyết thanh bào thai bò đã được bất hoạt bằng nhiệt (heatinactivated fetal calf serum (Gibco BRL)) cùng với 50U/ml penicillin và 50|j.g/ml streptomycin (được gọi là môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh (complete
medium (CM)). Tất cả tế bào được ủ ở 37ổc với 5% (w/v) CO2 và 95% (w/v)
không khắ. Trước khi sử dụng, các mẫu thử nghiệm dạng bột được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO) để tạo dung dịch gốc nồng độ 1 OmM. Các dung dịch gốc sau đó được pha loãng bằng môi trường DMEM không có huyết thanh để tạo các dung dịch làm việc ở nồng độ trong khoảng từ 0 , 1 đến lOOịiM. Nồng độ DMSO cuối cùng không vượt quá 0,1% và mẫu đối chứng DMSO được thêm vào một nhóm lỗ thử để có nồng độ DMSO đúng bằng nồng độ DMSO ở các lỗ có mẫu thử.
Phân lập histon và Western Blot:
Các histon được phân lập bằng phương pháp chiết acid, xế bào (khoảng 5 x 1 0 ^) trong mỗi lỗ của đĩa thử được thêm vào một thể tắch nhất định mẫu thử đã pha loãng từ dung dịch gốc bằng môi trường DMEM không có huyết thanh như chuẩn bị ở phần trên. Song song làm mẫu trắng (không có mẫu thử) và mẫu đối chiếu (chỉ có dung dịch chứa DMSO). Sau đó, các tế bào được xử lý và rửa bằng dung dịch nước muối sinh lý có đệm phosphate. rVSMCs được dung giải trong dung dịch dung giải đệm làm lạnh bằng nước đá [lOmM
HEPES (pH 7,9); l,5mM MgCl2, lOmM KCl, 0,5mM DTT và 1.5mM
phenylmethylsulfonylfluoride], sau đó 5M H2SO4 được thêm vào. Sau khi ủ trong đá 1 giờ, hỗn dịch được ly tâm và phần còn lại được thu hồi, trộn với aceton với tỷ lệ 9: 1 sau đó giữ ở -2 0 ổc qua đêm. Sau khi ly tâm tiếp, phần cặn rắn được rửa bằng ethanol 70% và làm khô. Phân đoạn histon tan trong
acid được hòa tan trong nước. Hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp BCA (Pierce), và histon được điện di qua gel SDS-PAGE 15% và chuyển vào lóp màng PVDF. Các màng được ủ cùng histon kháng acetyl hóa H3 (Upstate Biotechnology), tiếp theo là kháng thể liên hợp peroxidase của ngựa. Các dải có phản ứng dưong tắnh được phát hiện nhờ sự phát quang đã được tăng cưòng. Đối với MMP-2 Western blots, phân đoạn cytosolic của hVSMCs (5,0fig) được tách bằng SDSPAGE dưới điều kiện khử hóa sau đó chuyển sang màng nylon. Các màng này được lai hóa với kháng thể đơn dòng định hướng MMP-2 (Chemicon). Một kháng thể thứ cấp được liên hợp với peroxidase của ngựa và phức hợp miễn dịch được đánh giá bằng sự phát quang có kắch hoạt. Các thắ nghiệm được làm lặp lại ắt nhất 3 lần một cách độc lập.
* Thử độc tắnh tế bào ỉn vitro:
Thử hoạt tắnh kháng tế bào ung thư (thử độc tắnh tế bào) in vitro được thực hiện tại Khoa Dược, Trường Đại học Chungbuk, Chonju, Hàn Quốc theo phương pháp SRB và giá trị IC50 được tắnh theo phương pháp Probit [27]. Dòng tế bào thử nghiệm là tế bào ung thư đại tràng SW620.
Dòng tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco modified Eagle) (hoặc RPMI) bổ sung: L-glutamin, penicillin/ streptomycin, amphotericin B, heparin, chất kắch thắch tăng trưởng tế bào và FBS (huyết thanh bào thai bò).
Độc tắnh tế bào của các chất được thử bằng phưong pháp SRB theo các bước sau;
Bước ỉ: Chuẩn bị
Các tế bào ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường DMEM hoặc RPMI được bổ sung 5% FBS và điều
chỉnh đến nồng độ 5.10'^ tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng ISOịxl. Các đĩa sau đó được ủ ở 37^c trong điều kiện 5% CO2. Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử được chuẩn bị trong 2 0ịil môi trường DMEM/RPMI bổ sung 5% FBS từ dung dịch gốc trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi được thêm vào các đĩa ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó được ủ thêm 48 giờ. Tất cả các mẫu được chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO là nhỏ hơn 0,1%.
Bước 2: Tiến hành thử
Các tế bào được cố định bằng những lớp mỏng 50|il dung dịch tricloroacetic 50% lạnh lên trên môi trường nuôi cấy trong mỗi đĩa và được ủ ở 4ổc trong Ih rồi sau đó rửa 5 lần với nước máy. Các đĩa được để khô trong không khắ và được nhuộm với sulforhodamin B 0,4% trong acid acetic 1% trong 30 phút rồi rửa bằng acid acetic 1% để loại thuốc nhuộm không kết dắnh. Tiếp theo, các đĩa này được để khô ở nhiệt độ phòng và phần thuốc nhuộm còn dắnh lại sẽ được hòa tan bởi 100 ml dung dịch chứa lOmM Tris- base không đệm (pH 10,5). Độ hấp thụ được đọc bằng thiết bị ELISA ở 540 nm. Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó, độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tắnh là giếng chỉ thêm dung môi pha chất thử). Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5%. Giá trị IC50 được tắnh dựa trên phần mềm Probits. Trong phương pháp thử này, IC50 < 2 0 ng/ml được coi là có hoạt tắnh.
2.3.4. Nhận xét mối liên quan cấu trúc tác dụng và đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất tổng hợp được:
- Tắnh giá trị logP của các dẫn chất tổng họp được bằng phần mềm
KowWin. Quy trình bao gồm vẽ cấu trúc 2D, tạo Smile notation bằng phần mềm ChemSketch 4.0 của ACD labs sau đó đưa Smile notation vào phần mềm KowWin để tắnh các giá trị logP.
- Nhận xét mối liên quan giữa hoạt tắnh và cấu trúc cùng giá trị logP của các dẫn chất.
- Đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất dựa trên quy tắc Lipinsky [12]:
+ Khối lượng phân tử của chất phải nhỏ hơn 500 g/mol. + Số trung tâm nhận liên kết hydro (N, O) phải nhỏ hơn 10 + Số trung tâm cho liên kết hydro (NH, OH) phải nhỏ hơn 5 + Cân bằng giữa tắnh thân nước/dầu: logP < 5.
PHẦN 3. THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ Vầ BầN LUẬN
3.1. HốA HỌC
3.1.1. Tổng hợp hóa học
Quy trình tổng hợp được tiến hành qua 2 giai đoạn
3.1.1.1. Tổng hợp methyl 5-(benzo[ế/Ịthiazol-2-yl carbomoyl)pentanoat và dẫn chất
Quy trình tổng hợp methyl 5-(benzo[<Ị]thiazol-2-yl
carbomoyl)pentanoat (He) và dẫn chất được tiến hành tương tự theo Victor Andrianov và cộng sự [8] He He4. R = C2H50- H e5.R=CH 3S02- He6. R - NO2- Trong đó: H e l.R = H- He2.R = CH3- HeS.R^CHsO- Tiển hành chung Ễ Thực hiện phản ứng'.
+ Cho 0,96g (ómmol) CDI; 2mml DCM; 0,85ml (ómmol) acid monomethyl
adipic cho vào bình cầu 50ml. Hoạt hóa trong 10 phút.
+ Thêm 3mmol dẫn chất benzothiazol; 2ml DMF vào bình cầu trên.
+ Gia nhiệt phản ứng (t = 40-5O^C) kết họp khuấy từ 300 vòng/phút trong khoảng 24h
+ Sau khoảng 24h kiểm tra phản ứng bằng TLC với pha động là DCM: M eOH= 18:1
Ễ Tỉnh chế:
+ Cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ 40ổc trong
vòng 10 phút đến khi hết DCM.
+ Đổ toàn bộ hỗn hợp phản ứng vào khoảng 50ml nước lạnh, thu được tủa, để lắng trong vài phút.
+ Lọc tủa, rửa sạch bằng nước cất
+ Sấy khô tủa ở 60'^c, thu được sản phẩm.
Dưới đây là phản ứng tổng hợp các chất từ H el đến He6
a. Tằng hợp methyl 5-(benzo[d]thiazol-2-yl carbomoyl)pentanoat (Hel)
- Sơ đồ phản ứng;
- Tiến hành: Như quy trình tổng hợp chung của các chất He với chất ban đầu là 2-aminobenzothiazol (0,45g; 3mmol).
- Kết quả: Chất rắn màu trắng ■ Hiệu suất: 80% (0,70g)
■ Khả năng hòa tan: Dễ tan trong DMF, DCM. ắt tan trong MeOH. Không tan trong nước nóng và lạnh.
b. Tổng hợp methyl 5-(6-methylbenzo[d]thiazol-2-yl carbomoyl)pentanoat (He2)
- Tiến hành: Như quy trình tổng họp chung của các chất He với chất ban đầu là 2-amino-6-methylbenzothiazol (0,49g; 3mmol).
- Kết quả: Chất rắn màu trắng ■ Hiệu suất: 84% (0,7 Ig)
■ Khả năng hòa tan: Dễ tan trong DMF, DCM. ắt tan trong MeOH. Không tan trong nước nóng và lạnh.
c. Tổng hợp methyl 5-(6-meắhoxybenzo[d]thiazol-2-yl carbomoyl)pentanoat (He3) - Sơ đồ phản ứng: H3C0 --- NH2 + HO" H3CO ^OCHs D M F
- Tiến hành; Như quy trình tổng hợp chung của các chất He với chất ban đầu là 2-amino-6-methoxybenzothiazol (0,54g; 3mmol).
- Kết quả: Chất rắn màu trắng ■ Hiệu suất: 71% (0,86g)
■ Khả năng hòa tan: Dễ tan trong DMF, DCM. ắt tan trong MeOH.
Không tan trong nước nóng và lạnh.
d. Tổng họp methyl 5-(6-ethoxybenzo[d]thỉazol-2-yl carbomoyl) heptanoat(He4)
- Sơ đô phản ứng:
C2H5O"
NH2 + Hơ
C2H5O
- Tiến hành; Như quy trình tổng họp chung của các chất He với chất ban đầu là 2-amino-6-ethoxybenzothiazol (0,58g; 3mmol)
- Kết quả: Chất rắn màu trắng ■ Hiệu suất: 76% (0,77g)
■ Khả năng hòa tan: Dễ tan trong DMF, DCM. ắt tan trong MeOH. Không tan trong nước nóng và lạnh.
e. Tổng hợp methyl 5-(6-methylsuắfonylbenzo[d]thiazoắ-2-yl carbomoyl)pentanoat (He5)
Sơ đồ phản ứng:
H3CO2S
H3CO2S
Tiến hành: Như quy trình tổng hợp chung của các chất He với chất ban
đầu là 2-amino-6-methylsulfonylbenzothiazol (0,68g; 3mmol).
Kết quả: Chất rắn màu trắng ■ Hiệu suất: 61% (0,67g)
■ Khả năng hòa tan: Dễ tan trong DMF, DCM. ắt tan trong MeOH. Không tan trong nước nóng và lạnh.
f. Tổng hợp methyl 5-(6-niắrobenzo[d]thiazol-2yl carbomoyl)pentanoat (He6)
- Sơ đồ phản ứng:
0,N
NH2 + HO'
- Tiến hành: Như quy trình tổng hợp chung của các chất He với chất ban đầu là 2-amino-6-nitrobenzothiazol (0,59g; 3mmol). Chất rắn sau khi xử lý theo quy trình chung được phân tán trong 50ml MeOH nóng, lọc tủa, rửa tủa 2 lần, mỗi lần 5ml MeOH. sấy khô tủa ở 60*^c.
- Kết quả: Chất rắn màu vàng ■ Hiệu suất: 59% (0,59g)
■ Khả năng hòa tan: Dễ tan trong DMF, DCM. ắt tan trong MeOH. Không tan trong nước nóng và lạnh.
Như vậy chúng tôi đã tổng họp được 6 chất. Kết quả hiệu suất phản ứng và một sổ chỉ số hóa lý của 6 chất được trình bày ở bảng 3.
Các chất được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng và nhiệt độ nóng chảy, kết quả cụ thể được trình bày ở mục 3.1.2
Để khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp được chúng tôi tiến hành ghi phổ hồng ngoại (IR) và phổ khối (MS) của 6 chất tổng hợp được, kết quả được trình bày ở mục 3.1.3.1 và phụ lục 1-12.
Bảng 3; Hiệu suất và các chỉ số hóa lý của methyl 5-(benzo[ứT|thiazol-2-yl carbomoyl)pentanoat và dẫn chất
Chất CTCT CTPT KLPT Màu Dung môi
kết tinh lại Hiệu suất (%) H el 'N tì o X H 3 C14H16N2 0 3S 292 Trắng Nước 80 He2 'N Ịi H3C' ồ .CH3 C.sH.gNsOaS 306 Trắng Nước 84 He3 HaCO^ 'N y - N .Ịj "S o o .CH3 C,5H,8N204S 322 Trắng Nước 71 He4 C2H5O" ó o XH3 C16H20N2O4S 336 Trắng Nước 76 He5 'N ti H3C0 2S'' Ồ o -CH3 C,5H,8N205S2 370 Trắng Nước 61 He6 'N Ịj O2N' .CH3 C,4H,5N305S2 337 Vàng Nước/MeOH 59
3.1.1.2. Tổng hợp iV^-(benzo[ắ/]thiazol-2-yl)-A^-hydroxyadipamid và dẫn chất (H)
Sau khi tham khảo các tài liệu và dựa vào điều kiện thắ nghiệm và các hóa chất cho phép chúng tôi tiến hành tổng hợp V -(benzo[ự/]thiazol-2-yl)-A^-
hydroxyadipamid và dẫn chất tương tự như Hanessian s. và cộng sự [17]
NaOH H H 4 .R = C2H5 0- H5. R = CH3SO2-