Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase

Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase Tổng hợp n1 hydroxy n8 (5 phenyl 1,3,4 thiadiazol 2 YL) octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase

Trang 1

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ PHƯƠNG ĐÔNG

TÔNG HỢP

NÌ-HYDROXY-NỶ-(5-PHENYL-1,3,4- THIADIAZOL-2-YL)OCTANDIAMID

VA MOT SO DAN CHAT HUONG UC CHE HISTON DEACETYLASE

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Trang 2

VŨ PHƯƠNG ĐÔNG

TÔNG HỢP

N'-HYDROXY-NỶ-(5-PHENYL-1,3,4- THIADIAZOL-2-YL)OCTANDIAMID

VA MOT SO DAN CHAT HUONG

UC CHE HISTON DEACETYLASE

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC SỸ

Người hướng dẫn:

1 PGS.TS Nguyễn Hải Nam 2 DS Đỗ Thị Ánh Tuyết

Nơi thực hiện:

Bộ mơn Hóa Dược đại học Dược Hà Nội

Trang 3

Lời cảm ơn

Trước khi bắt đầu viết những phần chính trong khóa luận nảy tơi xin được gửi những lời cảm ơn chân thành nhất đến những người trong suốt gần một năm qua đã luôn ở bên cạnh giúp đỡ tơi hồn thành một cách tốt nhất khóa luận tốt nghiệp

Trước hết tôi xin được gửi sự chân thành của mình đến người thầy và

người cơ đáng kính của tơi, trưởng bộ mơn Hóa Dược trường đại học Dược Hà Nội PGS.T'S Nguyễn Hải Nam và Dược sỹ Đỗ Thị Ảnh Tuyết Thầy, cô

đã không chỉ tạo những điều kiện tốt nhất giúp tôi hồn thành khóa luận mà

đã ln có những hướng dẫn chính xác và kịp thời những lúc tơi gặp khó

khăn, luôn ở bên động viên tôi, cho tôi niềm động lực tinh thần, niềm tin lớn

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ

thuật viên của bộ mơn Hóa Dược trường đại học Dược Hà Nội trong suốt thời gian qua đã tạo điều kiện để tơi thực hiện khóa luận tại bộ môn, xin được gửi lời cảm ơn đến những cô chú anh chị cán bộ giúp đỡ tôi trong quá trình kiểm tra, đo đạc các loại phổ tại viện Hóa Học Việt Nam, viện Hóa Học các hợp chất tự nhiên và bộ mơn Hóa vật liệu trường Đại học Khoa học tự nhiên

Tôi cũng xin bày tỏ những tình cảm thân thương đến các anh chị, các bạn và các em trong nhóm thực nghiệm tại bộ mơn Hóa Dược, những người đã chia sẻ vui buồn, đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội ngày 16 tháng 5 năm 2012

Người việt

Trang 4

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VE DANH MỤC CÁC SƠ ĐÔ

CHƯƠNG 1 TÔNG QUAN - 5-55 secteskserrensaersserske 1

II No 7n 1 1.1.1 Định nghĩa histon deacetylase (HDAC) . SẶSSSSSSs sex 1

1.1.2 Phân loại HDAC - - - - E225 <2 SE Em xxx nh mm x cree 1 1.2 Chất ức chế histon đeacetylase trong điều trị ung thư 2

1.2.1 Histon deacetylase (HDAC) và ung thư . <5 SĂScSSsen+ereeke 2

1.2.2 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC -. 5scsrsrrreei 4 1.3 Các loại các chất ức chế HDACC -¿- c6 sSE‡E+E£E+E+sEEsEeEerreeeree 7

IESNV€.vaoicoc nh cố e 7

1.3.2 Các acid béo mạch ngắn 4k +z+s+x+EEEZEE+kEkEEEEExrkeEEEErrrees §

1.3.3 Các peptid VÒng - << sọ HH HH 9 1.3.4, Cac benzamid 10

1.4 Tác dụng chọn lọc của các chất ức chế HDAC -¿-:+scecscsse: 10

1.5 Liên quan cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế HDAC 12

Trang 5

2.1 NGUYEN LGU 14

2.1.1 Hoa chat J0 0881 - H 14

2.1.1 Dung môi và hóa chất khác . + «+ + x+E#EeExEE£keEererereeererrxrses 14 2.2 Thiết bị, đụng CỤ 5-55 S33 EESESEEEEEEEESEEEEEEEEEEEEExrkrkrkrrerereee 14

2.3 Nội dung nghiÊn CỨU .- ( S11 SH ng ng tr 15 2.4 Phương pháp nghiÊn CỨU - - - 5 (c1 E361 163 111189 1 1k ven rey 15

2.4.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết 52 5e: 15

2.4.2 Xác định cấu trÚC ¿- + c5 Sex eEEErkSErkrrkrkrkrrkrereererrrrrrree l6

“X6 WN nh ác cấu 8ì 16

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN 18

3.1 Tổng hợp hóa hỌC - + + SE EEEEEEEE+EEEEESEEEEEEEEEEEEEEEEsrkrkrerrererere 18

3.1.1 Tổng hợp ”NỶ-hydroxy-NŸ-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-

yl)octandiamid”” (Ša) -. - HS HS HH khe 18

3.1.2 Tổng hợp ”NỶ-hydroxy-NŸ-(5-(2clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2- y]l)octandiamid”” (S) - << <5 xnxx“ ng nh 23 3.1.3 Tổng hợp “NỶ-hydroxy-NŸ-(5-(3clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2- \4))U9rsi6L)i01e12 0 25 3.1.4 Téng hop “N'-hydroxy-N®-(5-(4clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2- y])octandiamid(Sd) Ặ.- - << S5 S91 HH HH nh 27

3.1.5 Kiểm tra độ tỉnh khiẾt . 5+ +Sx+zx+xeExvxerxvrerserxrrerxrrrrxrrrie 28 3.2 Xác định cấu trÚC +52 tt tr EvEEEExEkerkrkkrkerkrerrrrkrrerserrrrere 29

Trang 6

3.4 Bàn luận - cọ cọ ch mg 35 3.4.1 Hóa học Q0 nọ Họ gu uy gà 35

s00 36

KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, . 5-5 55s sSssssSsesssesesssseses 39

400 NT HHHẤẬÂ ÔỎ 39

6110 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Trang 7

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ALL AML APL CD DMF DMSO EtOH HAT HDAC HDACi ICs IR MeOH MS NMR SAHA TLC TSA

: Bệnh ung thư nguyên bào lympho cấp tính

: Bệnh ung thư bạch cầu dạng tủy cấp tính :_ Bệnh ung thư bạch cầu tủy bào cấp tính : Receptor gay chét ndi tai

: Dimethyl formamid : Dimethyl sulfoxid : Ethanol

: Histon acetyltranferase : Enzym histon deacetylase

Chat tre ché enzym histon deacetylase

: Nồng độ ức chế hoạt độ tế bào xuống một nửa

:_ Phương pháp phổ tử ngoại : Methanol

:_ Phổ khối lượng

:_ Phương pháp phố cộng hưởng từ hạt nhân

: Acid retonic

: Receptor cua acid retonic

: Acid suberoylanilid hydroxamic : Phuong phap sac ky lop mong

Trang 8

Stt Bang 1 Bang 2 Bang 3 Bang 4 Bang 5 Bang 6 Bang 7 Bang 8 Bang 9 Stt Hinh 1 Hinh 2 Tén bang Tác dụng ức chế chọn lọc của các chất HDACi Gia tri Rs va Tone Cla cac chat 5a-d

Số liệu phân tích phố IR của các chất 3a-d Số liệu phân tích phố IR của các chất 4a-d

Số liệu phân tích phố IR của các chất 5a-d Số liệu phân tích phố khối lượng của các chất

Số liệu phân tích phố 'H-NMR của các chất 5a-d

Kết quả thử hoạt tính của chất 5a và SAHA

Tương đồng cấu tạo của các chất đích và SAHA

DANH MỤC CÁC HINH VE

Tên hình

Tác động của các HDAC với tế bào ung thư Cấu trúc cơ bản của các chất ức chế HDAC

Trang 9

DANH MỤC CÁC SƠ ĐÒ

Stt Tên sơ đồ Trang

Trang 10

tháng 2 năm 2011, ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới Tỉ lệ tử vong do ung thư năm 2008 chiếm 13% trong số 57 triệu ca tử

vong do bệnh tật toàn cầu với số lượng lên tới 7,6 triệu người Những con số

này phần nảo cho thấy mỗi nguy hại vô cùng lớn mà ung thư mang lại cho sức khỏe con người cũng như những thách thức đối với ngành chăm sóc sức khỏe

trong việc chống lại căn bệnh nan y này, mang lại sự sống cho người bệnh Y học thế giới những thập niên gần đây tập trung nhiều cho lĩnh vực

điều trị ung thư trong đó ngành dược học đã có nhiều cơng trình nghiên cứu tìm ra các loại thuốc mới Trong đó acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA)

là một ví dụ điển hình Với tên thương mại là Vorinostat (Zolinza®) loại thuốc này đã được Cục quản lý dược phẩm và thực phẩm Hoa Ky (FDA) cấp phép

trong điều trị u lympho tế bào T dưới da Đây là một trong số các thuốc được nghiên cứu với nhóm chức acid hydroxamnc trong phân tử

Sự ra đời của Vorinostat đã thực sự mở ra một hướng nghiên cứu mới, nghiên cứu các chất ức chế HDAC mang nhóm chức acid hydroxamic để điều trị ung thư Do đó, chúng tơi đã thực hiện đẻ tài: “ Tống hợp NỈ-hydroxy-NŸ- (5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-y])octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế hỉston deacetylase” với 2 mục đích chính:

1 Tổng hợp NỈ-hydroxy-NŸ-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid và 3 dẫn chất

2 Bước đầu thử độc tính trên tế bào ung thư của N’-hydroxy-N*-(5-

Trang 11

CHUONG 1 TONG QUAN

1.1 Histon deacetylase

1.1.1 Dinh nghia histon deacetylase (HDAC)

Histon deacetylase (HDAC) là một nhóm các enzym xúc tác q trình loại bỏ nhóm acetyl từ e-N acetyl lysine amino acid của histon Nó có tác dụng đối lập với histon acetyltransferase (HAT) [34]

Histons HATs Acetyl-histons

ngưng tụ các nhiễm sắc thể HDACs kéo giãn các nhiễm sắc thể ngăn cản phiên mã kích thích phiên mã

1.1.2 Phân loại HDAC

Có 18 HDAC ở người được chia thành 4 nhóm dựa trên sự tương đồng

cầu trúc của chúng lần lượt với Rpd3, Hdal và Sir2 trong nắm men [11,25]

Nhom I : HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8

Nhom IT: HDAC4, HDACS, HDAC6, HDAC7, HDAC9, HDAC10

Nhóm III: các protein điều hịa chuỗi thơng tin 2

* Chat déng dang cua sir2 trong men Saccharomyces cerevisiae * Sirtuin trong động vật có vú (SIRTI1, SIRT2, SIRT3, SIRT4,

SIRTS, SIRT6, SIRT7) Nhom IV: HDACI11

Nhóm I, II va IV duge coi nhu nhitng HDAC “cé điển” và gồm 11

thành viên, trong khi các thành viên nhóm III được gọi là những sirtum [1 l]

Các HDAC “cỗ điển” và sirtuin có cơ chế xúc tác khác nhau Các HDAC “cổ

H A xX ~ A + vw ry x ˆ Lư vw 7 yt A

Trang 12

khơng có tác dụng chống lại sirtuin vì những enzym nhóm III này có cơ chế

hoạt động khác, đó là phụ thuộc vào NAD” như một cofactor thiết yếu [25]

Thuật ngữ “các chất ức chế HDAC” thường được sử dụng cho những hợp

chất nhằm mục tiêu vào những HDAC “cô điển” thuộc nhóm I, I va IV va

những hợp chất này hiện nay đang được đánh giá dựa trên các thử nghiệm lâm sàng

1.2 Chất ức chế HDAC trong điều trị ung thư

1.2.1 Histon deacetylase (HDAQ) và ung thư

Mặc dù đã có sự ứng dụng rộng rãi các chất ức chế HDAC trong nuôi cấy tế bảo, các mơ hình động vật, hay các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn đầu, tuy nhiên chúng ta vẫn còn biết một cách mơ hồ về các mục tiêu của chúng trong các mô ung thư Điều này là do hiểu biết của chúng ta về các chức năng của các HDAC trong một mơ hình khối u nhất định còn chưa được đầy đủ

HDAC có thể liên quan tới việc trung gian điều hòa chức năng của các

sản phẩm hoán vi gay ung thư trong một số loại bệnh bạch cầu và u lympho nhất định [26] Mối liên quan giữa hoạt động của HDAC và sự hình thành khối u được thê hiện rõ nhất trong bệnh ung thư bạch cầu tiền tủy bào cấp tính (APL) RARơ, receptor của acid retonic (RA), là một chất điều hòa phiên mã quan trọng trong sự biệt hóa của tế bào tủy RARœ và RXR (chất đồng trùng

hợp ngoại lai của RARo) liên kết với các yếu tố đáp ứng RA (RAREs) và

trong điều kiện vắng mặt yếu tố dạng lưới, có thể ức chế sự phiên mã bằng

Trang 13

(ALL) Cac protein nay cé thé lam cho yếu tố phiên mã AMLI, từ chỗ là một

chất hoạt hóa trở thành một chất ức chế, bằng cách thu nạp HDAC thông qua

ETO va TEL [31]

Tuy nhiên, những thay đổi trong biểu hiện gen được mô tả ở trên không

cho thấy một cách rõ ràng sự thay đổi các loại HDAC cụ thể Do đó chưa thể có đữ liệu kết luận chung của sự thay đôi các HDAC biểu hiện trong các loại ung thư ở người Gần đây một số nghiên cứu về sự thay đổi của một số loại HDAC trong các mơ hình khối u đã được cơng bố Ví dụ, có một sự gia tang của HDACI biểu hiện trong bệnh ung thư đạ dày [6], ung thư tuyến tiền liệt [13], ung thư đại tràng [32], ung thư vú [36] hay ung thư da Một ví dụ khác, sự gia tăng quá mức của HDAC2 được tìm thấy trong ung thư cổ tử cung [15] và ung thư đạ dày [27] Một số nghiên cứu khác cũng đã có báo cáo về sự gia

tăng khơng kiểm sốt của HDAC3 và HDAC6 trong các mẫu xét nghiệm ở

ung thư đại tràng và ung thư vú [32,37]

- = § SƯ, Di căn sa €: as ể 1 = — oo -_" “= vt Se 4 | e) }- - Ái E xẻ ie C 6 iD —- Hinh thánh mạch u0äC É ` 2 Mea ré "náo ng re Ngăn can các #OAC |

Kid aie An fide phap fda hoc

“Eh _

x te 2 Be nace MA I

ony Ti te = ; = \

he te x HSAEC ¥ if Hof 1

A _ rire S ’ lực ac XÃ" J#bAc $

š Ế =, Fees JP Bae 2 ‘yy Boe +

Trang 14

giai đoạn khởi phát và tiến triển Trong các ví dụ này, sự ức chế phiên mã

dường như được điều hòa bởi sự thu nạp HDAC và cung cấp một cơ sở hợp lý

cho phương pháp điều trị bệnh bạch cầu với các chất ức chế HDAC Sự mất

cân bằng trong quá trình acetyl hóa histone có thể dẫn tới những thay đổi

trong cấu trúc của NST và sự rối loạn điều hòa phiên mã các gen tham gia vào điều khiến chu trình tế bào, phân hóa và/hoặc gây chết tế bảo

1.2.2 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

Kha nang chống ung thư của các chat te ché HDAC (HDACi) bat nguồn từ khả năng tác động lên nhiều giai đoạn chu trình tế bào đã bị biến đổi

ở các tế bào ung thư Trong hầu hết các trường hợp, sự hoạt hóa các chương

trình biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và thúc đây sự chết tế bào theo chương trình là chìa khóa cho tác dụng chống ung thư của HDAC¡ Thêm vào đó, sự

hoạt hóa của chuỗi phản ứng miễn địch và sự ức chế tạo mạch cũng đóng vai

trị quan trọng trong tác dụng ức chế khối u in vivo cba HDACi Cac HDACi tac dong tdi tế bào ung thư theo ba cơ chế chủ yếu:

> HDACi¡ tác động lên tế bào ung thư, gây ra sự nghỉ ở pha G1 của chu

trình tế bào, từ đó dẫn tới sự biệt hóa tế bào ung thư

> HDAC¡ tác động lên cả tế bào ung thư và tế bảo thường, gây ra G2 checkpoint (vi tri ma tai do chu trinh tế bào tạm thời bị dừng lại, chờ đến khi

các điều kiện trở nên phù hợp thì chu trình lại tiếp tục) Các tế bào thường sẽ

trải qua G2 checkpoint này rồi tiếp tục phát triển bình thường Trong khi đó, các tế bào ung thư biến đổi ADN thành 4nADN Sự biến đổi này sẽ khiến cho các tế bào ung thư phải trải qua sự chết tế bào theo chu trình

Trang 15

1.2.2.1 Các chất HDAC¡ gây ra sự biệt hóa

Khi là I tác nhân riêng lẻ, các HDAC¡ có thể khiến cho nhiều loại tế

bào ung thư bạch cầu và u rắn khác nhau phái thể hiện đặc tính biệt hóa và

ngừng tăng sinh Sự ức chế chu trình tế bào là cần thiết cho sự biệt hóa của tế bào, và tác dụng kìm tế bào của HDAC¡ là rất quan trọng cho hoạt động chống ung thư của chúng Phân tích các số liệu về chu trình tế bào của các tế bào ung thư đã được điều trị với HDAC¡ cho thấy các tế bào thường dừng ở pha G1, nhưng đôi khi tích tụ đến pha G2 của chu trình

Sự biệt hóa của tế bào tủy phụ thuộc vào sự hoạt hóa phiên mã của

RARœ và protein gây ung thư PLZF-RARơ làm ngắt quãng chương trình biệt

hóa bình thường HDAC] có thể kết hợp với RA để tạo ra sự biệt hóa tế bào APL khang hoa tri ligu PLZF-RARa ca in vivo va in viro [18] Trường hợp tương tự cũng có thể xảy ra ở AML, trong đó chức năng ức chế của các protein AMLI-ETO và TEL-AMLI bị kìm hãm bởi các HDACI, và sự nhạy

cảm của tế bào ác tính với RA vẫn được bảo toàn Trong hai trường hợp này,

mục tiêu phân tử của HDACi đã được xác định rõ, và chu trình dẫn đến sự biệt hoá cũng đã được nghiên cứu tỉ mỉ Tuy nhiên HDAC¡ có thể gây ra sự biệt hóa ở rất nhiều loại tế bảo khác, và các hiện tượng phân tử có liên quan tới sự biệt hóa của các loại tế bào khác đó vẫn chưa được sáng tỏ [5]

1.2.2.2 Các chất HDAC¡ điều hòa sự gây chết tế bào theo chương trình Quá trình điều trị các tế bào ung thư với HDAC¡ có thể dẫn đến sự gây

chết tế bào theo chương trình Sự gây chết tế bào theo chương trình là một

chương trình gây chết tế bào sinh lý với mục đích là kiểm sốt số lượng tế bảo bình thường trong quá trình phát triển hoặc trong các loại bệnh Người ta đã xác định hai con đường chết nội bảo với chức năng riêng biệt nhưng có mối

Trang 16

như caspase-8 và -10 Các caspase này sau đó sẽ tiếp tục hoạt hóa các capases

kích thích như caspase-3 và -7 Con đường thứ hai lại cần thiết phải có sự

rách màng ty thể nhằm điều hòa sự giải phóng của cyfochrome c và các

protein hỗ trợ sự chết tế bào theo chu trình (như SMAC, AIF) và sự hoạt hóa của capaes-9 thơng qua yếu tố APAF1 Sự toàn vẹn của màng tế bào ty thể được quyết định bởi các protein trong họ protein BCL2 (bao gồm các protein

pro-apoptic (BAX, BAK) va cac protein anti-apoptic (BCL2, BCL-Xz) HDACi da duoc ghi nhan là hoạt hóa cả chu trình gây chết receptor và chết tế

bào nội sinh [22] Ví dụ apicidin và CBHA có thể kích thích sự biểu hiện của

CD95 và phối tử CD95 (CD95L), và sự ức chế sự phát tín hiệu của CD95 sẽ

kháng lại sự gây chết tế bào đo apidicin gây ra Tuy nhiên, việc điều trị với butyrat sẽ làm cho các tế bào nhạy cảm với sự gây chết tế bào được điều hòa

bởi CD95 mà không cần sự mã hóa của phối tử hay receptor Sự biểu hiện quá

mức của BCL2 có thể ngăn chặn chu trình chết tế bào nội sinh nhưng không ảnh hưởng tới con đường gây chết receptor, ức chế gây chết tế bào theo chu trình do HDACi, chi ra tam quan trọng của chu trình nội sinh đối với chức năng của các HDAC¡ Các dữ liệu này được củng cố bởi các phát hiện rang su

gây chết tế bào theo chu trình đo HDACi¡ trùng hợp với sự tăng cường điều chỉnh các protein BCL2 pro-apoptic và sự giảm điều chỉnh các BCL2 anti-

apoptic [22]

1.2.2.3 Các tác dụng khác lên ung thư của các chất HDAC¡

Ngoài việc trực tiếp tác động lên sự tồn tại và phát triển của khối u, HDACi cịn có thể có các hoạt động khác gián tiếp ảnh hưởng lên sự phát

Trang 17

CD80, va CD&ó, phân tử kết đính gian bào ICAMI và interferon loại I và II, nhằm làm tăng mạnh sự nhận biết và hoạt hóa các tế bào miễn dịch Thêm vào đó, sự tồn tại và phát triển của các khối u rắn phát triển rộng và nhanh cần cung cấp oxy va chất dinh dưỡng một cách liên tục để duy trì hệ mạch của

khối u TSA có thể ức chế sự gây giảm oxy huyết của yếu tố gây phát triển mang trong mao mạch (VEGF) và triệt tiêu sự hinh thanh mach ca in vivo va

in viro Do đó, sự kích thích đáp ứng miễn dịch chính và sự ức chế hình

thành mạch khối u có thể ngăn chặn sự phát triển của các khối u lớn và ngăn can su di can [7]

1.3 Các loại chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC đang được thử nghiệm lâm sàng để sử dụng

trong điều trị ung thư có thể được chia làm 4 nhóm dựa trên cấu trúc [9]: - Các hydroxamat: TSA, SAHA, CBHA

- Cac peptid vong: depsipeptid, CHAPs

Cac acid béo mach ngan: butyrat, phenylbutyrat, valproic acid Cac benzamid: N-acetyldinalin, MS-275

1.3.1, Cac hydroxamat

Trichostatin A (TSA) 1a dan chat hydroxamat tự nhiên đầu tiên được phát hiện có tác dụng ức chế HDAC TSA là một sản phẩm lên men của Streptomyces Ban dau, TSA dugc str dung lam chất chống nắm, nhưng sau đó người ta đã phát hiện ra khả năng ức chế mạnh sự tăng sinh các tế bào ung

thư của nó TSA cé tac dung in vitro ngay 6 mức nồng độ nanomol Do việc sản xuất TSA rất tốn kém và hiệu suất thấp (20 giai đoạn, với hiệu suất chỉ là

2%) nên việc tìm kiếm một HDAC¡ thay thế nó đang được tiến hành và rất quan trọng Ngày nay, TSA được dùng chủ yếu làm chất đối chiếu trong việc

Trang 18

Acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) cé cau tric tuong tu TSA va

là chất ức chế HDAC nhóm I và II ở nồng độ nanomol Ca SAHA va TSA

đều không ức chế HDAC nhóm III M-carboxycinnamic acid bishydroxamid

(CBHA) là một chất ức chế HDAC mạnh khác, nó là cơ sở cấu trúc của nhiều

dẫn chất khác bao gồm LAQ824 và 1 dẫn chất sulfonamid PXD-101, cả hai

chất này đều ức chế HDAC nhóm I và II ở nồng độ nanomol

Các HDACI1 có chứa nhóm hydroxamat đã được xác nhận là chúng tương tác với vị trí xúc tác của HDAC, đo đó chúng ngăn không cho cơ chất tiếp xúc với ion Zn”” tại vị trí của nó Nhược điểm của các hydroxamat là bị

chuyên hóa nhanh, ức chế không chọn lọc trên các HDAC [30]

1.3.2 Các acid béo mạch ngắn

Nhóm các acid béo mạch ngắn như phenylbutyrat và các dẫn chất và

acid valproic có tác dụng ức chế HDAC tương đối yếu, có tác dụng ở khoảng

nồng độ micromol và ảnh hưởng đến sự biểu hiện của nhiều gen với các chức

năng tế bào khác nhau Những tác nhân này đã được đánh giá trong lâm sảng,

nhưng có chu kỳ bán hủy ngắn trong huyết tương và cần phải có nồng độ tương đối cao (cỡ milimol) cho các hoạt động của chúng Gần đây, một hợp chất có cấu trúc ghép giữa phenyl butyrat và TSA (BL1521) đã được ghi nhận là có tác dụng ức chế ở nồng độ micromol thấp Cả valproic acid và phenylbutyrat đều đã được sử dụng làm thuốc trên thị trường từ lâu, không phải với tác dụng chống ung thư Cho đến gần đây chúng mới được phát hiện

là có khả năng ức chế HDAC [32]

1.3.3 Các pepfid vịng

Trang 19

10

thuộc nhóm các CHAP (các dẫn xuất của acid tetrapeptid hydroxamic vòng)

Trong khi hầu hết các hợp chất này là sản phẩm của vi khuẩn hoặc nắm, thi apicidin và depsipeptide là sản phẩm kết hợp giữa acid hydroxamic và peptid

vòng Tất cả các chất này đều có tác dụng ức chế HDAC mạnh ở mức nồng

độ nanomol [23]

Apicidin là chất được chiết xuất từ các thử nghiệm với ký sinh trùng,

chất này gây ra sự acetyl hóa quá mức histon trong ký sinh trùng sốt rết Plasmodium falciparum và ức chế histon deacetylase của nhiều loại ký sinh

trùng như Eimeria tenelia (ICso = 0,7 nM) đồng thời cũng có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của các tế bào ung thư bạch cầu Trong khi đó, các chất dẫn xuất như 9-hydroxy- hoặc 9-acyloxyapicidin đã được cấp bằng sáng chế nhưng chưa có báo cáo về hoạt tính sinh học nảo

Depsipeptid là một tiền chất của 1 tác nhân hoạt động: red FK Depsipeptid (FR901228) có hoạt tính chống ung thư có hiệu quả với các loại

ung thư phối và ung thư tuyến vú, những kiểu ghép dị chủng u melanin, ngồi

ra có tác dụng với ung thư bạch cầu cùng loại ở chuột và u melanin Depsipeptide được đưa vào các thử nghiệm lâm sàng vì hoạt tính chống ung thư của nó có khởi đầu ấn tượng khi nó được phát hiện là một tác nhân ức chế HDAC ở mức nMol Kết quả đầu tiên cho thấy tác dụng điều trị trong bệnh

giảm tiểu cầu đột ngột có hồi phục như một tác dụng phụ ở mức liều tới hạn

Các tetrapeptid vịng có chứa các nhóm chức năng trifluoroethyl và pentafluoroethyl ceton, liên kết với kẽm đã được tổng hợp và là những chất

ức chế HDAC mạnh [8]

1.3.4 Các benzamid

Trang 20

nhóm này gồm: MS-275 (có khả năng ức chế HDAC ở mức nồng độ

micromol) và CI-994 (N-acetyldinalin) có tác dụng ức chế HDAC theo cơ chế chưa được xác định

Một nhóm các benzamid được phát hiện có hoạt tính ức chế HDAC ở mức micromol thấp Một chức 2'- hydroxy hoặc amino được chỉ ra là cần thiết cho hoạt tính của chúng và giá tr ICso của những chất này là từ 2 đến 10 uM Hop chất 2°-amino MS-275 (thường được gọi là MS-27-275 trong những báo cáo đầu tiên) là tác nhân ức chế HDAC đầu tiên được chứng minh có hoạt

tính chống ung thư ở miệng trong các loại động vật Thêm vào đó, người ta

chưa nhận thấy tác dung bat lợi nào của chất này [20]

1.4 Tác dụng chọn lọc của các chất ức chế HDAC

Người ta đã đưa ra các bằng chứng rằng một chất ức chế HDAC nhất định có thể có tác dụng ức chế chọn lọc trên các HDAC khác nhau Một số ví du, TSA là tác nhân ức chế mạnh HDACI, 3 và 8, trong khi đó MS-275 ức chế chọn lọc hơn trên HDACI với IC50 là 0,3 uM so voi HDAC3 1a 8 uM và

khơng có tác dụng ức chế với HDAC8 Hai hợp chất mới được tổng hợp và đã

được xác định là HDAC! là: SK 7041 và SK 7046 có tác dụng chọn lọc hơn

trên HDAC|I và 2 [33]

Nghiên cứu về tính chọn lọc của các chất ức chế enzym histon

deacetylase (HDACi) déi với từng loại HDAC là bước rất quan trọng giúp lựa chọn chính xác các phác đồ điều trị bằng liệu pháp dùng HDACi¡ (cả đơn trị

liệu và kết hợp) trong mỗi loại bệnh cụ thể có liên quan đến HDAC Vì vậy đi

đơi với các cơng trình nghiên cứu ra thuốc mới, thì việc nghiên cứu về đích tác dụng của thuốc trong mỗi loại ung thư cụ thể cũng rất được chú trọng Ở đây chúng tôi tổng kết một số nghiên cứu về một số loại thuốc ức chế HDAC

Trang 21

Bảng 1: Tác dụng ức chế chọn lọc của các chất ức chế HDAC Nhóm Ir IT Iv HDAC- 1 2 3 8 4 5 6 7 9 I0 11 m ,,,,,.,.-‹, x Xx [22] aa 1 } } J [21,30] Hăasaa - ae J [24] eee me bdo) oo tit LL bx ds * [12,29]

—— (benamde) Ì WO) Wes We) WE ESI es [20,35]

es ll [16] i x x Xx [17] 1.).).) | TAN Ne We A [8] ee OO OOo Lo Pee AI EẽIäaăar ra [23] Chú thích: |: ức chế, x: khơng có tác dụng

1.5 Liên quan cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế

HDAC

N6i chung hiéu qua tac dung cua cdc chit tc ché HDAC (HDACi) dua

trên sự có mặt của 3 yếu tố chính [20]:

Trang 22

- Câu nối (hydrophobic linker): thường là các hydrocarbon than dau, nằm trong lòng mạch enzym

- Nhóm khóa hoạt động (capping group): thường là vòng thơm hoặc

peptid vòng và thường nằm trên bề mặt enzym

Dựa vào việc phân tích cẫu trúc bằng tia X của một chất tương đương

HDAC ở vi khuẩn có protein giống histon đeacetylase (HDLP) liên kết với

SAHA hoặc TSA và HDAC8 ở người đã khẳng định rằng ZBG liên kết với

Zn” tại vị trí hoạt động có cấu trúc dạng kênh Cầu nối ky nước đưa ZBG tới vị trí hoạt động bằng cách “lắp đầy” vào kênh này Trong khi đó, nhóm khóa hoạt động ở phía bên kia của cầu nối liên kết với phần đuôi acid amin nằm ở

bờ của kênh đó [26]

Cấu trúc phổ biến của ZBG của các chất ức chế HDAC là nửa

hydroxamat Sự biến đổi cấu trúc của ZBG hydroxamat đã đạt được một số thành công, tạo ra một số chất dang vi nhu benzamid, a-ketoester,

electrophilic keton, mercaptoamid va phosphonat

Trong một chất ức ché HDAC nguyên mẫu, nhóm khóa hoạt động có

thê liên kết với cầu nối thông qua hoặc là các nhóm cho hoặc là các nhóm

nhận liên kết hydro như amid, keto Sự thiếu hụt nhóm cho hoặc nhận liên kết hydro trong nửa liên kết tạo ra cơ hội liên kết chặt chẽ hơn với các nhóm

khác dễ tơng hợp và thỏa mãn hơn về dược động học Điều này giúp đơn giản

hóa việc thiết kế cấu trúc và tổng hợp các chất ức chế HDAC mới

Trong khi cả TSA và SAHA có cầu nối chứa các nhóm carbonyl (tương

ứng với keto và amid), các nghiên cứu đã cho thấy các chất ức chế HDAC tiềm năng có thể có đơn vị cầu nối là sulfoxid hoặc đơn thuần là một nhóm thioete loại 1 Các hợp chất có chứa các nhóm này thể hiện tác dụng ức chế

trung bình trong các thử nghiệm với enzym Từ đó ta có thê thấy rằng nguyên

Trang 23

14

tạo ra nhiều chất ức chế HDAC tiềm năng hơn so với các dẫn xuất thioete [20]

Các chất ức chế HDAC dựa trên cấu trúc amid-alkyl-hydroxamic acid

đã được biết đến nhiều, ví dụ như SAHA Cấu trúc của chúng bao giờ cũng bao gồm 3 phần chính (hình 2): Phần nhóm nhận diện bề mặt liên quan đến

hiệu lực và tính đặc hiệu (thường là aryl), phần cầu nối (như amid/alkyl) và

nhóm gắn kết với ion Zn” (acid hydroxamic) [23]

Cho đến nay phần lớn các nghiên cứu liên quan cấu trúc — tác dụng đều tập trung tìm hiểu vai trị của nhóm gắn với ion Zn””, cố gắng nghiên cứu thay

thế acid hydroxamic và một vài cầu nối cầu nỏi

X ¬ < ——T }—— « " Lư

Trang 24

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

Các hóa chất, dung môi sử đụng trong quá trình thực nghiệm là loại

dành cho tổng hợp được nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich và được

sử đụng trực tiếp không có tinh chế gì thêm

2.1.1 Hóa chất chính

v⁄ Thiosemicarbazid * Các benzaldehyd:

Y FeCl;.12H,O eBenzaldehyd

¥ Acid monomethy] suberic e2-Cloro-benzaldehyd Y Carbonyl diimidazol e3-Cloro-benzaldehyd

Vv Hydroxylamin e4-Cloro-benzaldehyd 2.1.2 Dung mơi và các hóa chất khác

DME Aceton MeOH Acid acetic băng n-Hexan HCI EtOH NaOH Dicloromethan Nước cất 2.2 Thiết bị, dụng cụ

- Bình cầu đáy trịn dung tích 50 ml có nút mài, máy khuấy từ gia nhiệt,

sinh hàn hồi lưu, máy cất quay chân không, tủ lạnh, tủ sấy, máy siêu âm, pipet, bình chiết, phễu thủy tỉnh, giấy lọc, cân phân tích, cân kỹ thuật, bình

chay sac ky lép mong (TLC)

- TLC tiến hành trên bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh

- Nhiệt độ nóng chảy (T°,.) duge xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng

Trang 25

16

- Phố hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin Elmer, sử dụng kỹ thuật viên nén KBr, ghi ở vùng 4000-600 cm” tại phịng thí nghiệm bộ mơn

hóa vật liệu Đại học Khoa học tự nhên

- Phố khối lượng (MS) được ghi bằng máy khối phổ Agilent 6310 Ion

Trap MS của viện Hóa học các hợp chất tự nhiên Việt Nam

- Phố cộng hưởng từ hạt nhân proton 'H-NMR được ghi bằng máy Bruker AV-500, ding DMSO lam dung môi Độ chuyến dịch hóa hoc (8)

được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per million - ppm), lay méc là pic

của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS)

2.3 Nội dung nghiên cứu

Tổng hợp 4 chất:

N'-hydroxy-N°-(5-phenyl-1, 3, 4-thiadiazol-2-yl)octandiamid

N'-hydroxy-N*-[5-(2-clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid N'-hydroxy-N*-[5-(3-clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid

N'-hydroxy-N*-[5-(4-clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid

Bước dau thir déc tinh trén té bao ung thu cia N’-hydroxy-N’-(5-phenyl-

1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid va dinh hudng tiép tuc thir nghiém véi

3 dan chat con lai

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tỉnh khiết

Nghiên cứu tông hợp 4 chất trong mục tiêu bằng phương pháp hóa học

# Dùng TLC để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bang TLC va do nhiệt độ nóng chảy

2.4.2 Xác định cấu trúc

Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên kết quả phân

Trang 26

2.4.3 Thứ tác dụng sinh học

2.4.3.1 Nguyên tắc thử

Thử hoạt tính kháng tế bảo ung thư (thử độc tính tế bào) iw vio được thực hiện tại Khoa Dược, Trường Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp MTT và giá trị ICso được tính trên phan mềm GraphPad Prism [20]

Dong té bao thir nghiém:

e SW620: tế bào ung thư đại tràng

e MCF-7: tế bào ung thư vú e AsPC-1: té bao ung thu tụy

e PC-3: tế bào ung thư tiền liệt tuyến

e NCI-H460: tế bào ung thư phối

Các dòng tế bào ung thư được lẫy từ Ngân hàng tế bào ung thư của

Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco°s modified Eagle medium) (với

dòng tế bào MCFE-7) hoặc RPMI (với đòng 4 tế bảo còn lại) bố sung 10% FBS

(huyết thanh bảo thai bò) Độc tính tế bào của các chất được thử bằng phương pháp MTTT theo các bước sau:

Chuẩn bị: Các tế bào ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán vào

hỗn dịch đơn tế bảo trong môi trường DMEM hoặc RPMI bố sung 10% FBS

và điều chỉnh đến nồng độ khoảng 1,5.10 đến 3,5.10! tế bào, sau đó chia đều

vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 200 ul Các đĩa sau đó được ủ ở

37°C trong diéu kién 5% CO» Sau 24 gid U, cdc mau thir dugc chun bi trong

20 uL môi trường DMEM/RPMI bổ sung 10% FBS từ dung dịch gốc 10

mg/mL trong dimethyl sulfoxid (DMSO) réi thém 2 uL mẫu thử vào các

Trang 27

18

cả các mẫu được chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO không quá 0,1%

Tiến hành thử: Sau khi ủ 48 giờ, thêm vào mỗi giếng 20 pl thudc nhuộm MTT (nồng độ MTT 5 mg/mL trong muối đệm phosphat - PBS) Các

đĩa được ủ thêm 3 giờ ở 37C trong điều kiện 5% CO; Tiếp theo, mỗi giếng

duge cho 100 pl dung dich DMSO, dé 5 phút cho MTT formazan duge hoa tan Độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 510 nm

2.4.3.2 Tính kết quả

Giá trị ICzo là nồng độ của mẫu thử mà ở đó, độ hấp thụ giảm đi 50% so

với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy): kết

Trang 28

CHUONG 3 THUC NGHIEM, KET QUA VA BAN LUAN

3.1 Tổng hợp hóa học

Quá trình tổng hợp 4 chất trong khóa luận này được tiến hành theo sơ

đồ hình 3.1:

H

ll lÍ = HH

| te, a [ea ; ( NGỘ „ a | sư | Oe

—¬—Z ¬zZ ee Lad zl Jn i ' Kì ‘i l / J 1G 1 Ì ˆ yO Hea a = L 3 ` \ te a “ou i 4 cr ~~ E Il Ừ = Ễ Sài `“ ú ba Ean

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung

Túc nhân và điều kiện: ¡) thiosemicarbazid, ethanol, acid acetic băng, 100C, 4h;

ii) FeCl;.12H,O, ethanol, 11 0C, 1⁄4h; iii) acid monomethyl suberic, carbonyl diimidazol, DMF 60°C, 24h; iv) hydroxylamin, NaOH, methanol, O°C, 1-2h

3.1.1 Tổng hợp »N' -hydroxy-N'-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-

yloctandiamid” (Sa)

Để tông hợp chất 5a chúng tôi tiễn hành quy trình phản ứng gồm 4 giai đoạn tương tự trong sơ đồ phương pháp chung Quy trình tổng hợp được trình

Trang 29

20 II " | —NIL es _Ä [ho = % HƯỚNG, “., kg „+ SG - 5 T i 5 1 T ` | ee ` ` š _ Ĩ — ul a " sy 7 x a i > ee HT cer f S— AL ““NIEI

pg gel -“ xe ~~ OP — & ¬.Z jg „2 tg? g °” =

—ÝỶ dị TH ¬!t

Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất 5a

Túc nhân và điều kiện: ¡) thiosemicarbazid, ethanol, acid acetic băng, 100C, 4h; ii) FeCl;.12H2O, ethanol, 110°C, 1/4h; iii) acid monomethyl suberic, carbonyl

diimidazol, DMF, 60°C, 24h; iv) hydroxylamin, NaOH, methanol, 0C, 1-2h

a Tổng hợp chất 2a

Dau tin để tổng hợp chất 5a cần tổng hợp 2- phenylidenhydrazincarbothioamid (2a) Tổng hợp chất 2a từ benzaldehyd

(1a) được chúng tôi thực hiện bằng phản ứng ngưng tụ với xúc tác là acid hữu cơ, tiến hành phản ứng như sau:

v Tiến hành phản ứng:

Cho (0,2 ml; 2mmol) benzaldehyd (1a) va (0,218g; 2,4mmol)

thiosemicarbazid vào bình cầu 50ml Thêm 20ml dung méi EtOH tuyét déi va 2 giọt acid acetic băng làm xúc tác Gia nhiệt lên 100°C, khuấy 300 vòng/phút

và hồi lưu trong 4h v Thụ sản phẩm:

Cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ 40°C trong 2 phút

sau đó thêm 15ml nước cất để tủa sản phẩm Lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15ml nước cất Sây khô tủa ở 60°C (trong khoảng 48h)

Trang 30

e_ Cảm quan: Bội tinh thể màu trắng có ánh vàng

e Hiệu suất: 91,2% (0,33g)

e TỔ„: 164-165C

e Kiém tra bang TLC véi pha déng DCM : MeOH (9:1) cho Re =0,54

Toàn bộ san phẩm 2a của phản ứng được chúng tôi dành để thực hiện

các bước tiếp theo của quá trình tổng hợp chất 5a

b Tổng hợp chất 3a

Chúng tôi thực hiện việc tổng hợp chất 5-phenyi-1,3,4-thiadiazol-2-

amin (3a) từ 2a bằng phản ứng đóng vịng nội phân tử Quá trình tổng hợp được thực hiện như sau:

Cân hỗn hợp các chất phản ứng bao gồm: (0,178g; 1mmol) chất 2a và (0,81g; 3mmol) muối sắt FeCl;.12H;O Hịa tan hồn tồn lượng muối sắt

bằng 3ml dung mơi EtOH trong bình cầu 50ml, gia nhiệt lên 100°C Đồng

thời hịa tan hồn toàn lượng chất 2a bằng 20 ml dung môi EtOH tuyệt đối trong cốc có mỏ, đun nóng lên 100C

Đồ dung địch chất 2a từ cốc có mỏ vào bình phản ứng, giữ nhiệt độ

100°C và khuấy 300 vòng/phút Kết thúc phản ứng sau 30 phút

v Thụ sản phẩm:

Cất thu hồi bớt dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ khoảng 40°C trong 2 phút sau đó pha loãng hỗn hợp phản ứng bằng nước cất Kiềm hóa

hỗn hợp bằng khoang 10 ml dung dich NaOH 30% (kiểm tra bằng giấy quỳ

vạn năng)

Chiết thu sản phẩm 3 lần bằng chloroform (mỗi lần 5-10 ml), thu lớp

dưới Gộp địch chiết của 3 lần Cất thu hồi dung môi của địch chiết bằng máy

Trang 31

22

v Kết quả:

e Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng nhạt

e Hiệu suất: 72,5% (0,128g)

e Kiém tra bang TLC véi pha dong DCM : MeOH (9:1) cho Re= 0,66

c Tổng hợp chất 4a

Chat methyl 8-oxo-8-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-ylamino)octanoat (4a) được tông hợp từ chất 3a bằng phản ứng acyl hóa của chất 3a với acid monomethyl suberic Quy trình tổng hợp được thực hiện như sau:

Cho (0,162g, 1mmol) 1,1°-carbonyl dimidazol (CDI) và hút (1ml, Immol) acid monomethyl suberic vào bình cầu 50ml Thêm 3ml dung môi

DME Để hoạt hóa trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

Sau khi hỗn hợp trong bình phản ứng đã hoạt hóa đủ thời gian, cho

(0,177g, 1mmol) chất 3a vào bình phản ứng, gia nhiệt lên 60°C, khuấy 300

vòng/phút và tiến hành đun hồi lưu trong vòng 24h v Thụ sản phẩm:

Làm lạnh bình phản ứng bằng nước đá Đồ từ từ 15 ml dung dịch HCI

loãng, lạnh vào bình phản ứng, vừa đồ vừa lắc Để yên 15 phút

Lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15 ml dung dich acid HCI loãng, lạnh Sấy

tủa ở 60°C trong 24h

v Kết quả:

e Cảm quan: Bột kết tỉnh màu trắng hơi hồng

e Hiệu suất: 58,5% (0,203g)

Trang 32

Chất đích thứ nhất MỈ-hydroxy-NÌ-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-

y]octandiamid (5a) được tông hợp bằng phản ứng tạo dẫn xuất của acid hydroxamic giữa chất 4a với hydroxylamin hydroclorid Tổng hợp chất 5a được thực hiện như sau:

Cho (0,173g; 0,5 mmol) chat 4a va (0,33g; 5 mmol) hydroxylamin

hydroclorid vào bình cầu 50ml, thêm 20 ml dung môi MeOH, dùng siêu âm để tạo hỗn dịch đồng nhất Đặt bình phản ứng trong hỗn hợp nước đá và muối

ăn, duy trì nhiệt độ đưới 0°C, khuấy 300 vòng/phút

Hòa tan (0,4g; 10mmol) NaOH trong 5 ml nước cất trong ống nghiệm và làm lạnh xuống dưới 0C trong hỗn hợp nước đá muốiăn Dé dung dịch NaOH vào bình phản ứng, giữ nhiệt độ dưới 0C, phản ứng kết thúc sau 1h

30phút Chúng tôi theo dõi tiến trình phản ứng và xác định thời điểm kết thúc bang cach dung dung dich FeCl; va TLC, cụ thé làm như sau:

- _ Acid hóa khoảng 0,1 ml hỗn hop phản ứng bằng 1 giot dung dich HCl loãng trên khay sứ, sau đó nhỏ 1 giọt dung dịch FeC]; 5%, xuất hiện màu đỏ

vang chúng tỏ đã có acid hydroxamic được tạo ra

- Acid hóa khoảng 0,1 ml hỗn hợp phản ứng trong vial, kiểm tra TUC với pha động DCM : MeOH (9:1) Kết thúc phản ứng khi kết quả cho thấy đã phản ứng hết ester ban đầu

v Xử lý phản ứng:

Acid hóa hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch 20 ml dung dịch HCI loãng, lạnh điều chỉnh pH về khoảng 4-5 (kiểm tra bằng giấy quỳ vạn năng) Đề yên 15 phút sau đó lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15ml dung dịch HCI loãng

Sấy tủa ở 60°C trong 24h

v Kết quả:

Trang 33

24

e_ Hiệu suất: 52,0% (0,087g)

e Kiểm tra bằng TLC và xác định cấu trúc: (kết quả cụ thể được trình bày

trong phan 3.1.5 và phần 3.2)

3.1.2 Tong hợp N'-hydroxy-N’-[5-(2-clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-

ylloctandiamid (5b)

Để tổng hợp chất 5b chúng tôi tiến hành theo quy trình phản ứng được

trình bày trong sơ đồ hình 3.3

Tác nhân và điều kiện: ¡) thiosemicarbazid, ethanol, acid acetic băng, 100C, 4h;

ii) FeCl;.12H,O, ethanol, 11 0C, 1/4h; iii) acid monomethyl suberic, carbonyl diimidazol, DMF, 60°C, 24h; iv) hydroxylamin, NaOH, methanol, 0°C, 1-2h

a Tong hop chat 2b

Đầu tiên để tổng hợp chất 5b chúng tôi cần tổng hợp chất 2-(2- clorobenzylidin)hydrazincarbothioamid (2b) Quá trình tổng hợp chất 2b từ

(0,282g; 2mmol) chat 2-clorobenzaldehyd (1b) được thực hiện tương tự như tổng hợp chất 2a Kết quả như sau:

Trang 34

e Hiệu suất: 87,3% (0,37g)

e Kiémtra bang TLC véi pha dong DCM : MeOH (9:1) cho Re= 0,66

b Tổng hợp chất 3b

Tổng hợp chất 5-(2-clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (3b) từ

(0,212g; 1mmol) chất 2b được tiến hành tương tự như tổng hợp chất 3a Kết quả như sau:

e_ Cảm quan: Bột kết tỉnh màu vàng nhạt

e_ Hiệu suất: 72,5% (0,154g)

e Kiém tra bang TLC véi pha dong DCM : MeOH (9:1) cho Rr= 0,46

c Tổng hợp chất 4b

Tổng hop chat methyl 8-oxo-8-(5-(2-clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-

ylamino)octanoat (4b) tit (0,212g; 1mmol) chat 3b duoc tién hanh tuong tu

như tông hợp chất 4a Kết quả của quá trình như sau: e_ Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng hơi hồng

e Hiệu suất: 58,5% (0,220)

e Kiém tra bang TLC véi pha dong DCM : MeOH (9:1) cho R= 0,83

d Tổng hợp chất 5b

Tổng hợp chat dich thir hai N’-hydroxy-N*-[5-(2-clorophenyl)-1,3,4-

thiadiazol-2-yl]octanediamid (5b) tir (0,191g; 0,5mmol) chat 4b dugc tién

hành tương tự như tổng hợp chất 5a Kết quả như sau:

e Cam quan: Bột kết tỉnh màu trắng

e _ Hiệu suất phản ứng: 62,1% (0,119g)

Trang 35

26

e Kiém tra bằng TLC và xác định cấu trúc: (kết quả cụ thê được trình bày

trong phần 3.1.5 và 3.2)

3.1.3 Tổng hợp chất N'-hydroxy-N* -[5-(3-clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2- yljoctandiamid (5c)

Để tổng hợp chất 5c chúng tôi tiến hành theo quy trình phản ứng được

trình bảy trong sơ đồ hình 3.4

(] Ta CYR) cl Ss, wn uel oa dl | lk i -

| a | ‘ T II li

i ——_

_ a ˆ ae Z `

Wt x

HN I eet I be aie ee NÌ HN I Sh —RÏ i f J é NERF

c1 = A a 7 Ie, ({XTk { le ts „4 i » ì \ Fd MIR 1|

—z oF

So dé 3.4 Quy trinh tong hop chat Sc

Ec

Tác nhân và điều kién: i) thiosemicarbazid, ethanol, acid acetic bang, 1 00°C, 4h; ii) FeCl;.12H,O, ethanol, 11 0C, 1/4h; iii) acid monomethyl suberic, carbonyl diimidazol, DMF, 60°C, 24h; iv) hydroxylamin, NaOH, methanol, O°C, 1-2h

a Tổng hợp chất 2c

Đầu tiên để tổng hợp chất 5e chúng tôi cần tổng hợp chat 2-(3-

clorobenzylidin)hydrazincarbothioamid (2e) Quá trình tổng hợp chất 2c từ (0,282g; 2mmol) chất 3-clorobenzaldehyd (1c) được thực hiện tương tự như

tổng hợp chất 2a Kết quả như sau:

e_ Cảm quan: Sản phẩm thu được là bột kết tinh mau trang

e_ Hiệu suất: 89,7% (0,38g)

Trang 36

Tổng hợp chất 5-(3-clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (3c) từ (0,212g; 1mmol) chất 2c được tiễn hành tương tự như tổng hợp chất 3a Kết quả như sau:

e_ Hiệu suất: 76,5% (0,163g)

e Kiém tra bang TLC véi pha dong DCM : MeOH (9:1) cho Rr= 0,44 c Tổng hợp chất ác

ylamino)octanoat (4c) từ (0,212g; 1mmol) chất 3e được tiến hành tương tự như tông hợp chất 4a Kết quả của quá trình như sau:

e_ Cảm quan: Bột kết tỉnh màu trắng hơi hồng

e Hiệu suất: 62,5% (0,240g)

e Kiém tra bang TLC véi pha dong DCM : MeOH (9:1) cho Re= 0,80

d Tổng hợp chất 5c

Tổng hợp chất đích thứ ba N’-hydroxy-N’-[5-(3-clorophenyl)-1,3,4-

thiadiazol-2-yl]octandiamid (5c) từ (0,190g: 0,5mmol) chất 4c được tiến

hành tương tự như tổng hợp chất 5a Kết quả của quá trình như sau:

e Cam quan: Bot két tinh mau trang

e Hiéu suat phan tng: 55,2% (0,105g)

e TỶ; 183-184

e Kiém tra bang TLC và xác định công thức: (kết quả cụ thể được trình

Trang 37

28

3.1.4 Tổng hợp chat N'-hydroxy-N’-[5-(4-clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-

ylJoctandiamid (5đ)

Để tổng hợp chất 5d chúng tôi tiến hành theo quy trình phản ứng được trình bày trong sơ đồ hình 3.5

l§ ot ALTE) - tt SN MIT " oon I N7 Xí đ ủy” ^G " | 2 | - iH ( r a Cl z ( oe ld 2d hl A - ve | My = Ay 4 HO ae BE Pe ye =4 Ð O7 SG HẦU ik - 2 2 cr al Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp chất 5d

Tác nhân và điều kiện: ¡) thiosemicarbazid, ethanol, acid acetic băng, 100°C, 4h;

ii) FeCl;.12H,O, ethanol, 1 10°C, 1/4h; iii) acid monomethyl suberic, carbonyl diimidazol, DMF 60°C, 24h; iv) hydroxylamin, NaOH, methanol, 0°C, 1-2h

a Tong hop chat 2d

Đầu tiên để tổng hợp chất 5d chúng tôi cần tông hợp chất 2-(4-

clorobenzylidin)hydrazincarbothioamid (2d) Quá trình tổng hợp chất 2d từ (0,282g; 2mmo]) chất 4-clorobenzaldehyd (1d) được thực hiện tương tự như

tổng hợp chất 2a Kết quả như sau:

e_ Cảm quan: Bột kết tỉnh màu trắng hơi vàng

e TÍ„:200-202°C

Trang 38

Tổng hợp chất 5-(4-clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (3d) từ

(0,219g: 1mmol) chất 2d được tiến hành tương tự như tổng hợp chất 3a Kết quả như sau:

e_ Hiệu suất: 79,7% (0,170g)

e Kiém tra bang TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho R;= 0,45

c Tổng hợp chất 4d

yiamino)octanoa (4d) từ (0,381g:; 1mmol) chất 3d được tiến hành tương tự

như tông hợp chất 4a Kết quả như sau: e_ Cảm quan: Bột màu trắng hơi hồng

e Hiệu suất: 56,8% (0,216g)

e TẾ, 195-196

e Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho R¿= 0,81

d Tổng hợp chất 5d

Tổng hop chat dich thir tu N’-hydroxy-N*-[5-(4-clorophenyl)-1,3,4-

thiadiazol-2-yl]octandiamid (5d) tt (0,191g; 0,5mmol) chat 4d được tiến

hành tương tự như tổng hợp chất 5a Kết quả như sau:

e_ Cảm quan: Bột kết tỉnh màu trắng

e _ Hiệu suất phán ứng: 58,4% (0,131g)

e Kiém tra bang TLC va xác định công thức: (kết quả cụ thể được trình bay trong phan 3.1.5 va phan 3.2)

3.1.5 Kiém tra độ tỉnh khiết

Chúng tôi đã kiểm tra độ tinh khiết các chất 5a-d bằng TLC và đo nhiệt

Trang 39

30

e TLC được tiến hành trên bản nhôm trang san silicagel Merck 70-230

mesh, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm Hịa tan trong dung mơi DMF và sau đó khảo sát với các hệ dung môi triển khai Kết quả thu được trên các sắc ký đồ đều thấy một vết rõ, gọn khi soi dưới ánh sáng đèn tử

ngoai

e _ Đo nhiệt độ nóng chảy: 4 chất sau khi được tinh chế bằng cách kết tỉnh

lại đều có dang tinh thể rắn được đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ

nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital)

Nhiệt độ nóng chảy và giá trị R; của các chất với 3 hệ dung môi triển khai được tóm tắt trong bảng 2

Bảng 2: Giá trị R¿ và TỶ„„ của các chất 5a-d

H + \ - Ae sre, Pe ~METI Pg a i 1 Ik Ry T° STT Chất R 0¢) Hé Hé (C) DCM:MeOH DCM: MeOH (9:1) (90:1) 1 Sa H- 189-191 0,62 0,72 2 | 5b | 2-cloro- | 163,5-165 0,52 (0,66 3 | 5e | 3-cloro- | 183-184 0,51 _ 067 4 5đ | 4-cloro- | 231,5-233 0,53 0,68 3.2 Xác định cấu trúc

Đề khẳng định cấu trúc hóa học của các chất tổng hợp được, chúng tôi

căn cứ vào việc phân tích dữ liệu phố hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS)

Trang 40

3.2.1 Phố hồng ngoại (IR)

Tại phịng thí nghiệm khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên, các chất đã được ghi phố hồng ngoại (IR) trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật làm

viên nén KBr ghi trong vùng 4000-600 cm" Các phổ đồ có ở phụ lục 12-23

Nhận xét: Chúng tôi nhận thấy số liệu phân tích phổ IR hoàn toàn phủ

hợp với các tài liệu tham khảo cũng như cấu trúc dự kiến của các chất 3a-d, 4a-d, 5a-d cụ thể như sau:

a Khẳng định cấu trúc của các chất trung gian

Các chất trung gian là amin 3a-d và ester 4a-d đều có dải hấp thụ phân

tử nằm trong vùng đặc trưng cho sự xuất hiện của vòng thơm bao gồm có: ving 1613-1441 cm” đặc trưng cho đao động giãn C=C của vịng thơm

(thường có pic kép) Ngoài ra các đữ liệu khẳng định nhóm chức trên phân tử

các chất trung gian bao gồm: dải hấp thụ trong vùng 3303-3268 cm’ đặc

trưng cho nhóm chức amin bậc 1 của các chất 3a-d và đải hấp thụ từ 2868-

2853 cm” đặc trưng cho nhóm chức ester của các chất 4a-d Kết quả phân tích dữ liệu được trình bày trong bảng 3 và bảng 4

Bảng 3: Số liệu phân tích phé IR của 3a-d (cm) Ì_ —xI

c

STT | Chat R SỐ sóng ứng với dao động hóa trị(cm'”)

Định dạng
Số trang	86
Dung lượng	12,98 MB