ĐẶT VẤN ĐỀ Nền kinh tế thế giới đang có những bước phát triển đáng kể, đi cùng với nó là sự tiến bộ vượt bậc của khoa học kỹ thuật và trong đó phải kể đến sự phát triển của công nghệ sản xuất kháng sinh. Nhiều chất kháng sinh được tạo thành bằng con đường tổng họp hoặc bán tổng hợp nhưng việc tìm ra các chất kháng sinh mới có nguồn gốc vi sinh vật vẫn luôn được thế giới quan tâm. Trong số các kháng sinh mà con người đã phát hiện và công bố thì có tới 60% là do xạ khuẩn sinh ra. Chi Streptomyceslà chi có số lượng lớn các xạ khuẩn có khả năng tạo ra những kháng sinh quan trọng có cấu trúc phức tạp và đa dạng về đặc điểm kháng khuẩn. Một số loài trong chi này còn có khả năng sinh tổng hợp các chất chống ung thư, điều trị HIVAIDS.... Sau thời gian nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu lên men tổng họp kháng sinh từ Streptomyces 160.13” với các mục tiêu sau: Bước đầu lựa chọn môi trường phù hợp cho quá trình nuôi cấy, lên men. Nâng cao hiệu suất sinh tổng họrp kháng sinh của chủng Streptomyces 160.13 bằng đột biến cải tạo giống kết hợp với sàng lọc. Nghiên cứu sơ bộ về tách chiết và tinh chế. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và sinh lý nhằm phân loại, xác định tên khoa học của chủng Streptomyces 160.13theo khóa phân loại ISP.
BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠÍ HỌC Dược HÀ NỘI ĐINH THANH HUYÊN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 160.13 KHÓA LUẶN TÓT NGHIỆP DƯỢC sĩ ĐẠI HỌC KHÓA 20Õ5-20I0' Ngưòi hưóng dẫn : ThS Lê Thị Thu Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Vi Sinh- Sinh Học Trương Đại Học Dược Hà Nội HÀ NOl-2010 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến cô giáo ThS Lê Thị Thu Hương, người đã trực tiếp hướng dẫn ân cần chỉ bảo giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô ban giám hiệu nhà trường, các thầy cô, cán bộ kỹ thuật viên trong bộ môn Vi Sinh - Sinh Học, bộ môn Công Nghiệp Dược, cùng các phòng ban đã nhiệt tinh giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực nghiệm. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên tôi trong suốt thời gian qua. Do thời gian và khả năng bản thân có hạn, nên trong khoá luận này không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong được sự chỉ bảo của thầy cô và sự góp ý của các bạn. Xin chân thành cảm ơn. Hà Nội ngày 17 tháng 5 năm 2010 Sinh Viên Đinh Thanh Huyền LỜI CẢM ƠN CHÚ GIẢI CHỮ VIÉT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 • CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN 2 1.1: Đại cương về kháng sinh 2 1.1.1; Lịch sử phát triển của kháng sinh 2 1.1.2: Định nghĩa kháng sinh 2 1.1.3: Cơ chế tác dụng của kháng sinh . 2 1.1.4: Sơ đồ tổng quát qui trình sản xuất kháng sinh 3 1.1.5: Phân loại kháng sinh 3 1.2; Đại cương về xạ khuẩn 4 1.2.1.Xạ khuẩn 4 1.2.2. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 4 1.3. Cải tạo giống vi sinh vật 6 1.3.1. Mục đích 6 1.3.2. Các phương pháp cải tạo giống v s v 6 1.4. Lên men sinh tổng họp kháng sinh 7 1.4.1. Lên men bề mặt 7 1.4.2. Lên men chìm 8 1.5. Chiết tách và tinh chế sản phẩm 9 1.5.1. Chiết xuất 9 1.5.2. Tinh chế sản phẩm 10 1.6. Phổ hồng ngoại (IR), Phổ tử ngoại (UV) 11 MỤC LỤC 1.7. Hạn chế trong sản xuất Doxorubicin từ Síreptomyces peucetius 11 1.8. Nhận dạng và xác định đặc tính của một Streptomyces sp. được phân lập biểu hiện hoạt lực chống lại Staphylococcus aureus kháng methỉcillỉn 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯOÍNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 13 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 13 2.1.1. Chủng xạ khuẩn 13 2.1.2. Giống v s v kiểm định 13 2.1.3. Các môi trường sử dụng 13 2.1.4. Các vật liệu và thiết bị được sử dụng 16 2.2. Nội dung nghiên cứu 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1. Phương pháp gây, giữ giống trong ống thạch nghiêng 17 2.3.2. Đánh giá hoạt tứủi kháng sinh bằng phưong pháp khuy ếch tán 17 2.3.3. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 18 2.3.4. PhưoTig pháp cải tạo và chọn giống 19 2.3.5. Phương pháp lên men gián đoạn 20 2.3.6. Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu c ơ 21 2.3.7. Phương pháp sắc kí lóp mỏng 21 2.3.8. Phương pháp cất quay 22 2.3.9. Phưong pháp xác định ảnh hưỏng của pH đến độ bền vững của kháng sinh: 22 2.3.10. Phương pháp thử khả năng bền nhiệt của kháng sinh 22 2.3.11. Phưcmg pháp tách kháng sinh bằng cột trao đổi ion 22 2.3.12. Phương pháp sắc kí cột 23 2.3.13. Phương pháp phân loại Streptomyces theo ISP 24 CHƯƠNG 3: THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1. Kết quả lựa chọn môi trường nuôi cấy thích họp 26 3.2. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 160.13 27 3.3. Kết quả đột biến bằng ánh sáng u v lần 1 28 3.4. Kết quả đột biến lần 2 30 3.5. Kết quả chọn môi trưòng lên men tốt nhất 32 3.6. Kết quả lên men môi trường MT5dd với các biến chủng tốt nhất 32 3.7. Đánh giá ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh 33 3.8. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt túứi kháng sinh 34 3.9. Kết quả chiết kháng sinh bàng các dung môi hữu cơ 34 3.10. Kết quả chiết kháng sinh bằng phương pháp cột trao đổi ion 35 3.11. Kết quả sắc ký lớp mỏng 36 3.12. Kết quả chạy sắc ký cột 37 3.13. Kết quả phân loại theo ISP của xạ khuẩn Streptomyces 160.13 . 38 3.14. Kết quả đo phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại và nhiệt độ nóng chảy 39 KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 40 Kết luận 40 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN PHỤ LỤC CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic. D [mm] Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn. ISP International Streptomyces Project. MT Môi trường. MTdd Môi trưòng dung dịch, s Độ lệch thực nghiệm chuẩn đã hiệu chỉnh. KS Kháng sinh, vsv Vi sinh vật. Cl, C2 Giống cấp 1, cấp 2. NST Nhiễm sắc thể. vđ Vừa đủ. VK Vi khuẩn, u v Utra Violet (tử ngoại). V Thể tích. Dm Dung môi. IR Infrared (hồng ngoại). Gr (-) Gram âm. Gr (+) Gram dương. SKLM Sắc ký lórp mỏng. SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên. ĐB Đột biến. Bảng 1 : Chủng vi sinh vật kiểm định Bảng 2: Các môi trường kiểm định Bảng 3: Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/lOOml) Bảng 4: Các dung môi sử dụng Bảng 5; Hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 160.13 trên các môi trường Bảng 6 : Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên Bảng 7: Kết quả đột biến bằng ánh sáng u v lần 1 Bảng 8 : Kết quả đột biến lần 2 Bảng 9: Kết quả chọn môi trường lên men tốt nhất Bảng 10: Kết quả lên men chìm với các biến chủng tốt nhất Bảng 11 ; Kết quả thử độ bền pH sau 24h Bảng 12; Kết quả thử độ bền pH sau 5 ngày Bảng 13: Kết quả khảo sát độ bền nhiệt của kháng sinh Bảng 14; Kết quả phản hấp phụ bằng Hci IN Bảng 15: Kết quả phản hấp phụ bằng NaOH 0,75N Bảng 16: Kết quả hoạt tính các phân đoạn sau khi chạy sắc ký cột Bảng 17: Kết quả thử sắc ký lớp mỏng sau chạy sắc ký cột Bảng 18; Các đặc điểm của Streptomyces 160.13 và Streptomyces avellaneus DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1; Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh Hình 2: Đặc điểm phát triển của vsv trong môi trường lỏng. Hình p 1: Chuỗi bào tử Hình P2: Bề mặt bào tử Hình P3: Hoạt tính kháng sinh của các chủng đột biến lần 2 Hìrth P4; Hoạt tữứi kháng sinh cửa các phân đoạn 1, 5 sau khi chạy sắc ký cột Hình P5; Ket quả phổ tử ngoại của kháng sinh do Streptomyces 160.13 sinh tổng họp Hình P6 ; Kết quả phổ hồng ngoại của kháng sinh do Streptomyces 160.13 sinh tổng hợp ĐẶT VẤN ĐỀ Nền kinh tế thế giới đang có những bước phát triển đáng kể, đi cùng với nó là sự tiến bộ vượt bậc của khoa học kỹ thuật và trong đó phải kể đến sự phát triển của công nghệ sản xuất kháng sinh. Nhiều chất kháng sinh được tạo thành bằng con đường tổng họp hoặc bán tổng hợp nhưng việc tìm ra các chất kháng sinh mới có nguồn gốc vi sinh vật vẫn luôn được thế giới quan tâm. Trong số các kháng sinh mà con người đã phát hiện và công bố thì có tới 60% là do xạ khuẩn sinh ra. Chi Streptomyces là chi có số lượng lớn các xạ khuẩn có khả năng tạo ra những kháng sinh quan trọng có cấu trúc phức tạp và đa dạng về đặc điểm kháng khuẩn. Một số loài trong chi này còn có khả năng sinh tổng hợp các chất chống ung thư, điều trị HIV/AIDS Sau thời gian nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu lên men tổng họp kháng sinh từ Streptomyces 160.13'” với các mục tiêu sau: - Bước đầu lựa chọn môi trường phù hợp cho quá trình nuôi cấy, lên men. - Nâng cao hiệu suất sinh tổng họrp kháng sinh của chủng Streptomyces 160.13 bằng đột biến cải tạo giống kết hợp với sàng lọc. - Nghiên cứu sơ bộ về tách chiết và tinh chế. - Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và sinh lý nhằm phân loại, xác định tên khoa học của chủng Streptomyces 160.13 theo khóa phân loại ISP. CHƯƠNG 1 TỎNG QUAN 1.1: Đại cương về kháng sinh 1.1.1: Lịch sử phát triển của kháng sinh [10] Năm 1928 nhà vi khuẩn học người Anh - Alexander Flemming đã tình cờ phát hiện chủng nấm có khả năng tạo ra chất ức chế các vi khuẩn. Flemming đã phân lập chủng nấm này và đặt tên là Penicillum notatum. Năm 1938, hai nhà khoa học Howara Walter Florey và Ernst Boris Chaen chiết được hoạt chat diệt khuẩn từ môi trường nuôi cấy Penỉcillum notatum và hoạt chất đó được đặt tên là Penicilin. Đến năm 1941 Penicilin được lên men trên qui mô công nghiệp để phục vụ điều trị cho thương binh trong chiến tranh. Năm 1944 thì Waksman phát hiện ra Streptomycin. Đến nay, hàng chục nghìn chất kháng sinh được tìm ra nhưng chỉ có khoảng 150 loại là được sử dụng rộng rãi (do phần lớn: độc, có tác dụng phụ, phổ kháng khuẩn hẹp, giá thành sản xuất cao, ). 1.1.2: Định nghĩa kháng sinh [2] Kháng sinh là những chất có nguồn gốc vi sinh vật, được bán tổng họp hoặc tổng hợp hóa học. Với liều thấp có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh. 1.1.3: Cơ chế tác dụng của kháng sinh [4] Mỗi kháng sinh đều có đích tác dụng nhất định trong tế bào vi sinh vật mẫn cảm, tuy nhiên có thể khái quát thành 6 nhóm tác dụng đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: + Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào: P-Lactam, Vancomycin, + Tác dụng lên màng tế bào chất: Amphotericin, Valinomycin, + Tác dụng vào ADN: Actinomycin, Rifamycin, + Tác dụng vào việc tổng hợp protein: Aminoglycosid, Macrolid, + Tác dụng vào quá trình trao đổi chất hô hấp: Antimycin, + Tác dụng vào quá trình trao đổi chất folat: Sulfamid, [...]... dung nghiên cứu + Nghiên cứu MT nuôi cấy và MT lên men tốt nhất cho chủng xạ khuẩn Streptomyces 160. 13 + Nghiên cứu các phương pháp cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 160. 13 + Nghiên cứu các phương pháp tách chiết, tinh chế kháng sinh + Tiến hành phân loại chủng xạ khuẩn Streptomyces 160. 13 theo khóa phân loại ISP + Sơ bộ xác định một số nhóm chức của kháng. .. biến gây chết từ 75-90%, tuy nhiên trong công nghiệp người ta có thể đột biến gây chết tới 99% 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh [1], [5], [7], [9], [10] Lên men là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong điều kiện môi trường tối ưu để sản xuất ra các sản phẩm trao đổi chất trong dịch lên men Có hai kiểu lên men chính hay sử dụng là: lên men bề mặt và lên men chìm 1.4.1 Lên men bề mặt Lên men bề mặt là... 14,98 11,52 16,32 13, 88 12,56 0,46 0,24 0,15 0,11 0,52 0,06 0,32 Kiểm định s aureus s B subtilis s lutea p mirabilis s typhi B pumiỉus B cereus E colỉ s flexneri s 0, 54 27 Nhận xét: - Streptomyces 160. 13 sinh tổng hợp kháng sinh trên cả 7 MT nuôi cấy - Streptomyces 160. 13 phát triển tốt và cho hoạt tính kháng sinh mạnh trên MT2, MT3, MT5 Trong đó MT5 là môi trưòng sinh tổng họp kháng sinh tốt nhất nên... cân bằng, 4;pha suy vong x; sinh khối khô vsv, t: thời gian lên men Trong công nghiệp, quá trình lên men kết thúc phụ thuộc vào việc sinh tổng hợp hoạt chất dừng lại ở pha nào trong chu kì sinh trưởng của v s v hoặc việc sinh tổng hợp chậm lại, nếu tiếp tục lên men sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế ♦ Lên men có bổ sung Nồng độ ban đầu cao của một số chất (Glucose, các hợp chất nitơ ) ức chế việc tạo... đó để nâng cao hiệu suất lên men, khi bắt đầu lên men các thành phần đó được đưa vào với nồng độ thấp và được bổ sung vào hệ thống trong quá trình lên men ♦ Lên men bán liên tục Khi v s v phát triển trong bình đạt đến một nồng độ sinh khối cần thiết thì lấy bớt dịch lên men rồi bổ xung thêm lượng môi trường mới bằng chính thể tích dịch lên men đã lấy đi Việc rút bớt dịch lên men và bổ xung thêm môi... Phương pháp này chỉ áp dụng cho nghiên cứu cải tạo giống trong phòng thí nghiệm 1.4.2 Lên men chìm Khi lên men chìm, v sv được nuôi cấy ở môi trường dịch thể, phát triển trong không gian 3 chiều của môi trường Tỷ lệ giống trong môi trường lên men là 1-10% Quy mô giống phụ thuộc vào quy mô lên men Quá trình lên men có thể thay đổi điều kiện ban đầu của môi trường lên men Do đó cần theo dõi và điều chỉnh... Doxorubicin (DXR) được sản xuất bởi Streptomyces peucetius ATCC 27952 biểu hiện khả năng ức chế các khối u, chống lại các dòng tế bào gây ung thư khác nhau Một thời gian dài trôi qua kể từ khi quá trình sinh tổng hợp DXR lần đầu tiên được tổng kết Dựa trên những nghiên cứu về sinh tổng họp và phân tích sản phẩm, các nhân tố khác nhau tác động tới sự sản xuất kháng sinh từ chủng S.peucetius ATCC 27952 đã... - Trong 9 chủng v sv kiểm định thì kháng sinh do Streptomyces 160. 13 tạo ra có hoạt tính mạnh và rõ nhất trên 2 chủng VK Bacillus cereus và Shigella flexneri Vì vậy trong các nghiên cứu tiếp theo chọn 2 chủng này làm 2 chủng vi sinh vật kiểm định đại diện 3.2 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptom yces 160. 13 Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 160. 13 trên MT5 Kết quả được trình bày... thích hợp Đánh giá hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 160. 13 khi nuôi cấy trên trên 7 môi trường khác nhau Kết quả được trình bày ở bảng 5: Bảng 5: Hoạt tính kháng sinh của Síreptomyces 160. 13 trên các môi trưòng vsv Tham sô MTl MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 ^[mm] 10,22 11,82 11,16 8,56 13, 18 10,64 9,04 1,12 0.32 0,41 0,62 0,21 0,78 ~ [mm] D 11,56 15,04 14,72 8,20 16,20 12,92 11,12 s 0,54 0,36 0,65 0,3 0 ,13. .. cải tạo, chọn giống bằng các biện pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp với các phưong pháp: chọn lọc lai tạo, gây đột biến trong chất liệu di truyền của tế bào hoặc trong hệ thống điều hòa trao đổi chất Qua đó đạt được các mục đích: tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh, cải tạo các đặc tính lên men, sinh tổng hợp được các sản phẩm mới, 1.3.2 Các phương pháp cải tạo giống . HUYÊN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 160. 13 KHÓA LUẶN TÓT NGHIỆP DƯỢC sĩ ĐẠI HỌC KHÓA 20Õ5-20I0' Ngưòi hưóng dẫn : ThS Lê Thị Thu Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Vi Sinh- . tổng họp kháng sinh từ Streptomyces 160. 13& apos;” với các mục tiêu sau: - Bước đầu lựa chọn môi trường phù hợp cho quá trình nuôi cấy, lên men. - Nâng cao hiệu suất sinh tổng họrp kháng sinh của. trao đổi chất trong dịch lên men. Có hai kiểu lên men chính hay sử dụng là: lên men bề mặt và lên men chìm. 1.4.1. Lên men bề mặt. Lên men bề mặt là thực hiện nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt môi