Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 180 245

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ MINH TÂM NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 180.245 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ MINH TÂM NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 180.245 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện : Bộ môn Vi sinh – sinh học HÀ NỘI – 2013 Lời cảm ơn Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Cao Văn Thu – người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, các cán bộ , kỹ thuật viên đang giảng dạy, công tác tại bộ môn Vi sinh – Sinh học, bộ môn Công nghiệp dược, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, khoa Hóa trường Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện hóa học – Viện khoa học và công nghệ Việt Nam, thư viện Khoa học kỹ thuật đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm khóa luận. Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, cùng toàn thể các thầy, cô giáo, cán bộ công nhân viên trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu tại trường. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Do những hạn chế về thời gian, phương tiện và trình độ của bản thân, chắc chắn khóa luận này còn có nhiều thiếu sót, tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô và các bạn để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội ngày18 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Ngô Thị Minh Tâm MỤC LỤC BỘ Y TẾ 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 1 NGÔ THỊ MINH TÂM 1 NGHIÊN CỨU LÊN MEN 1 TỔNG HỢP KHÁNG SINH 1 TỪ STREPTOMYCES 180.245 1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ 1 HÀ NỘI – 2013 1 BỘ Y TẾ 2 TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 2 NGÔ THỊ MINH TÂM 2 NGHIÊN CỨU LÊN MEN 2 TỔNG HỢP KHÁNG SINH 2 TỪ STREPTOMYCES 180.245 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ 2 HÀ NỘI – 2013 2 Lời cảm ơn 3 I. TỔNG QUAN 2 1.1 Đại cương về kháng sinh 2 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 2 1.1.2 Phân loại kháng sinh 2 1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 3 1.1.4 Các ứng dụng của kháng sinh 3 1.1.5 Giới thiệu về tính kháng kháng sinh 4 1.2 Đại cương về xạ khuẩn 4 1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn: 5 1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces 6 1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh 7 1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 8 1.4.1 Mục đích 8 1.4.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên 8 1.4.3 Đột biến cải tạo giống 9 1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn [9,14 ] 9 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 10 1.5.1 Khái niệm lên men ái khí 10 1.5.2 Các phương pháp lên men 11 1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 11 1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 12 1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh 12 1.6.2 Các phương pháp chiết tách [1, 3, 9] 12 1.7 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 13 1.7.1 Phổ tử ngoại - khả kiến 13 1.7.2 Phổ hồng ngoại 13 1.7.3 Khối phổ MS 13 1.8 Sử dụng tương tác giữa các loài để sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp trong xạ khuẩn 14 1.9 Hoạt tính kháng khuẩn invitro của xạ khuẩn biển chống lại Staphylococcus aureus đa kháng thuốc 14 1.10 Sàng lọc, phân lập, phân loại và lên men sản xuất kháng sinh từ Streptomyces xinghaiensis có hoạt tính chống lại các chủng kháng linezolid 15 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 15 2.1.1 Nguyên vật liệu 15 2.1.2 Máy móc thiết bị 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.2.1 Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 180.245 19 2.2.2 Chọn lọc, cải tạo giống 20 2.2.3 Lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu 20 2.2.4 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 20 2.3 Phương pháp thực nghiệm 20 2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 20 2.3.2 Phân loại xạ khuẩn theo ISP 20 2.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 21 2.3.4 Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 22 2.3.5 Sàng lọc ngẫu nhiên 22 2.3.6 Đột biến 23 2.3.7 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 24 2.3.8 Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men 25 2.3.9 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 25 2.3.10 Xác định độ bền của dịch chiết kháng sinh với ánh sáng 26 2.3.11 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 26 2.2.12 Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 27 2.3.13 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 27 2.3.14 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được 27 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 28 3.1 Xác định tên khoa học của Streptomyces 180.245 28 3.2 Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 28 3.3 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 29 3.4 Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1 30 3.5 Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2 31 Tiếp tục đem chủng 8.27 đột biến bằng ánh sáng UV (λ=254nm), khoảng cách 60 cm, thời gian 5 phút. Tỷ lệ sống sót là 0,22%. Mang 33 biến chủng thu được thử HTKS bằng phương pháp khối thạch. Kết quả chính như sau : 31 3.6 Kết quả đột biến hóa học 31 3.7 Kết quả chọn môi trường lên men chìm 32 3.8 Kết quả chọn chủng lên men 33 3.9 Kết quả thử độ bền pH và độ bền nhiệt 33 3.10 Kết quả chọn dung môi và pH chiết 34 3.11 Kết quả thử độ bền của dịch chiết kháng sinh trong DM với ánh sáng 35 3.12 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 35 3.13 Kết quả sắc ký cột lần 1 35 3.14 Kết quả sắc kí lớp mỏng chọn hệ dung môi lần 2 : 36 3.15 Kết quả sắc kí cột lần 2 37 3.16 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết 37 3.16.1 Nhiệt độ nóng chảy 180,5ºC. 37 3.16.3 Phổ hồng ngoại 38 3.16.4 Phổ khối : 38 VI. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 KẾT LUẬN 40 KIẾN NGHỊ : 41 Bảng phụ lục 1 : Một số kháng sinh do Streptomyces tạo ra 45 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ISP International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế) B.subtilis Bacillus subtilis P. mirabilis Proteus mirabilis S.olivoverticillatus Streptomyces olivoverticillatus MDRSA Multi drug resistance Staphylococus aureus HTKS Hoạt tính kháng sinh MIC Minimum inhibitory concerntration ( nồng độ ức chế tối thiểu ) MT Môi trường MTidt Môi trường i dịch thể DM Dung môi ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic VSV Vi sinh vật MC Mẫu chứng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên UV1 Đột biến UV lần 1 UV2 Đột biến UV lần 2 HH Đột biến hóa học vđ vừa đủ đvC đơn vị carbon DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định 15 Bảng 2: Các dung môi sử dụng 17 Bảng 3: Các đặc điểm của Streptomyces 180.245 vàS. olivoverticillatus theo ISP 28 Bảng 4: HTKS của Streptomyces 180.245 trên MT1,MT2, MT3, MT7 30 Bảng 5: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 30 Bảng 6: Kết quả thử HTKS đột biến UV lần 1 30 Bảng 7: Kết quả thử HTKS đột biến UV lần 2 31 Bảng 8: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học 31 Bảng 9: Kết quả chọn môi trường lên men chìm 32 Bảng 10: Kết quả chọn chủng lên men 32 Bảng 11: Kết quả thử độ bền pH 33 Bảng 12: Kết quả thử độ bền nhiệt 33 Bảng 13: Kết quả chọn dung môi và pH chiết 34 Bảng 14: Kết quả thử độ bền của dịch chiết với ánh sáng phòng 34 Bảng 15: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký lần 1 35 Bảng 16: Kết quả chạy sắc ký cột lần 1 35 Bảng 17: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký lần 2 36 Bảng 18: Kết quả chạy sắc ký lần 2 36 Bảng phụ lục 1 : Một số kháng sinh do Streptomyces tạo ra Bảng phụ lục 2 : Thành phần các hệ dung môi sử dụng DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của một số họ kháng sinh chính 3 Hình 2: Khuẩn lạc xạ khuẩn 5 Hình 3: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn 5 Hình 4: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn 6 Hình 5: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh 7 Hình 6: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn 10 Hình 7:Phổ UV - VIS 37 Hình 8: Dự đoán thành phần phân tử dựa vào phổ khối 38 Hình 9: Dự đoán cấu trúc phân tử dựa theo kết qủa MS ( trích ) 38 Hình phụ lục 1 : Hình ảnh hiển vi chuỗi bào tử Hình phụ lục 2: Hình ảnh hiển vi bề mặt bào tử Hình phụ lục 3 : Nuôi cấy xạ khuẩn bề mặt Hình phụ lục 4 : Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch Hình phụ lục 5 : Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc Hình phụ lục 6 : Thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch Hình phụ lục 7 : Hiện hình VSV vết sắc kí lớp mỏng Hình phụ lục 8: Sắc kí cột tinh chế kháng sinh Hình phụ lục 9: Một số cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Hình phụ lục 10: Phổ IR Hình phụ lục 11 : Phổ khối 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Sự phát triển về vi sinh vật học , với bước ngoặt lịch sử là phát minh về penicilin đã mở ra kỷ nguyên mới trong y học: khai sinh ra ngành công nghệ sản xuất kháng sinh và ứng dụng kháng sinh vào điều trị cho con ngườ i. Từ khi ra đời đến nay, kháng sinh luôn thể hiện được vai trò quan trọng trong y học, trở thành công cụ đắc lực trong phòng và chữa bệnh. Vì vậy, nhu cầu có các kháng sinh có hiệu quả cao, ít bị kháng và độc tính thấp là tất yếu đối với nền y tế của các quốc gia trong đó có Việt Nam chúng ta – một nước đang phát triển có tỉ lệ bệnh nhiễm trùng cũng như tỉ lệ kháng kháng sinh cao. Môi trường khí hậu đa dạng ở nước ta là điều kiện thuận lợi cho nhiều loại vi sinh vật phát triển, trong số đó là xạ khuẩn. Rất nhiều xạ khuẩn, đặc biệt là xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh và nhiều hoạt chất có giá trị trong y học khác. Với thực trạng nước ta hiện nay, hầu hết kháng sinh trên thị trường là nhập khẩu (dạng thành phẩm hoặc bán thành phẩm ), ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh chưa phát triển, đây là một hướng nghiên cứu nhằm tìm ra các thuốc mới, kháng sinh mới đưa vào sản xuất và điều trị. Do đó, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “ Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 180.245 ” làm khóa luận tốt nghiệp với các mục tiêu sau : - Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 180.245, - Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh, - Xác định các điều kiện tối thích để lên men, chiết tách kháng sinh, - Sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được . [...]... hóa học để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc 2.2.3 Lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu - Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất - Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất - Tìm DM hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất - Tìm... khuẩn trên MT thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 2 oC và định kỳ 3 – 6 tháng cấy lại 1 lần 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.5.1 Khái niệm lên men ái khí Lên men ái khí là các quá trình phân giải, chuyển hóa hydratcarbon trong điều kiện ái khí Hiểu theo nghĩa rộng, lên men ái khí bao gồm tất cả những quá trình lên men chuyển hóa các nguồn carbon sinh tổng hợp các sản phẩm... cho việc sinh tổng hợp kháng sinh, sau đó lựa chọn chủng cho dịch lên men có HTKS tốt nhất 2.3.8 Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men - Mục đích: Xác định khả năng chịu nhiệt của kháng sinh và mức độ ảnh hưởng của các pH khác nhau lên độ bền vững của kháng sinh Từ đó có những chú ý trong quá trình làm thực nghiệm, bảo quản, xử lý và tinh chế kháng sinh - Tiến hành Lọc sản phẩm lên men chìm... trên thiết bị nhân giống Bình lên men tạo kháng sinh Dịch lên men Sinh khối Dịch lọc Sinh khối thô Dịch chiết kháng sinh 8 Hình 5: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh [13] 1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 1.4.1 Mục đích Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên (bùn, đất, nước, mô thực vật…) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp[14] Do đó, để thu... khuẩn: chủng Streptomyces 180. 245 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội phân lập từ vỏ khoai lang  Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh học cung cấp : Theo khảo sát khi phân lập, kháng sinh do Streptomyces 180. 245 sinh tổng hợp có tác dụng trên cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương, 19 Chọn 2 chủng VSV kiểm định trên đó HTKS thể hiện rõ để tiến hành các nghiên cứu tiếp... kiểu chủ yếu [17]: - Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào, - Tác dụng lên màng nguyên sinh chất, - Tác dụng lên sự tổng hợp AND, - Tác dụng lên sự tổng hợp protein, - Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp, - Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian Hình 1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính 1.1.4 Các ứng dụng của kháng sinh 4 Ngoài lĩnh vực y học, kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong... 48h 25 + Lên men: Sau 48h nhân giống, tiến hành lên men trên 3 MTdt khác nhau để chọn MT lên men tốt nhất Giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa các MT dt với tỷ lệ Vgiống:Vmôi trường = 1:10 Các bình lên men được lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h Để chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: giống cấp 1 trên MT2dt được lên men trên... trong đó có lên men sản xuất các kháng sinh, một số vitamin…, là những sản phẩm có ứng dụng quan trọng trong Y Dược học [16] Tất cả các quá trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh là các quá trình lên men ái khí Kháng sinh là sản phẩm trao đổi bâc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúc quá trình sinh trưởng của VSV, thường vào gần hoặc vào chính pha cân bằng [11,16] 11 Hình 6 : Đường cong sinh trưởng... thu bột kháng sinh vào ống nghiệm sạch Sau đó, bột kháng sinh được kết tinh lại bằng hỗn hợp DM: hòa tan bột kháng sinh vào lượng tối thiểu ethylacetat, sau đó thêm n-hexan với lượng gấp 3-5 lần lượng ethylacetat vào dung dịch kháng sinh trên, lắc, tạo mầm, cho kháng sinh kết tinh - Lọc, sấy khô ở 50°C để thu kháng sinh tinh khiết 2.3.14 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được Kháng sinh tinh... mác,… 2.2 Nội dung nghiên cứu Các nội dung nghiên cứu cụ thể như sau: 2.2.1 Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 180. 245 20 - Xác định các đặc điểm phân loại ISP của Streptomyces 180. 245 - So sánh với đặc điểm phân loại ISP của một số chủng Steptomyces để xác định tên khoa học của Streptomyces 180. 245 2.2.2 Chọn lọc, cải tạo giống - Lựa chọn MT nuôi cấy tốt nhất cho Streptomyces 180. 245 - Tiến hành sàng . MINH TÂM 2 NGHIÊN CỨU LÊN MEN 2 TỔNG HỢP KHÁNG SINH 2 TỪ STREPTOMYCES 180. 245 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ 2 HÀ NỘI – 2013 2 Lời cảm ơn 3 I. TỔNG QUAN 2 1.1 Đại cương về kháng sinh 2 1.1.1. thiết bị nhân giống Bình lên men tạo kháng sinh Dịch lên men Dịch lọc Sinh khối Sinh khối thô Dịch chiết kháng sinh 8 Hình 5: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh [13] 1.4 Tuyển. 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 10 1.5.1 Khái niệm lên men ái khí 10 1.5.2 Các phương pháp lên men 11 1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 11 1.6 Chiết tách và tinh chế kháng