3.10.1. Phản hấp phụ bằng HCl IN:
Tiến hành hấp phụ kháng sinh lên cột trao đổi ion đã được hoạt hóa. Dịch lọc trước và sau qua cột được thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch trên VK kiểm định s. ỷlexnerỉ. Trước khi chạy cột hoạt tính dịch lọc là 20,25mm và sau khi chạy cột là 0 mm, chứng tỏ kháng sinh đã được hấp phụ hết lên cột. Kết quả các phân đoạn phản hấp phụ được trình bày ở bảng 14.
Bảng 14: Kết quả phản hấp phụ bằng H CIIN Phân s. flexneri 5[m m ] s l=í>10 0 0 11 11,45 0,07 12=^31 0 0 32 10,5 0,14 33 9,76 0,12
Nhận xét: Kháng sinh hầu như không bị phản hấp phụ bởi HCl IN.
3.10.2. Phản hấp phụ bằng NaOH 0,75 N:
Tiến hành hấp phụ kháng sinh lên cột trao đổi ion đã được hoạt hóa. Dịch lọc trước và sau qua cột được thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch trên VK kiểm định s. /lexneri. Trước khi chạy cột hoạt tính dịch lọc là 20,45mm và sau khi chạy cột là 0 mm, chứng tỏ kháng sinh đã được hấp phụ hết lên cột. Kết quả các phân đoạn phản hấp phụ được trình bày ở bảng 15.
Bảng 15: Kết quả phản hấp phụ bằng NaOH 0,75N ' \ , V S V Phân đ o ạ r i ' ^ ^ ^ s. ýlexneri D[mm] s 1 11,18 0,68 2 11,02 0,53
36 .... 12,47 1,34' ' “ 4 12,03 0,35 5 12,57 0,14 6 12,91 0,47 7 15,7 0,09 8 19,02 0,11 9 19,54 0,15 10 18,78 0,36 11 17,84 0,24 12 18,16 0,19 13 18,00 0,22 14 16,5 0,13 15 15,54 0,27 16 14,24 0,56 17 12,06 0,38 18 11,51 0,53 19 10,63 0,68 20=>32 0 0
Nhận xét: Các phân đoạn có hoạt tính kháng sinh ta đem gộp lại để đem cất chân không. Thể tích các phân đoạn thu được là 200ml đem đi cất chân không. Sau khi cất chân không lượng kháng sinh thu được là 0,39g kháng sinh thô.
3.11. Kết quả sắc ký lóp mỏng:
Tiến hành chấm dịch gộp các phân đoạn chính sau chạy cột trao đổi ion lên bản mỏng sắc ký đã hoạt hoá và thực hiện chạy sắc ký với 2 hệ dung môi độc lập;
- Hệ dung môi 1: Dichloromethan: Methanol: NH4OH 25% (1:2:1) - Hệ dung môi 2: Chloroform: Methanol: NH4OH 25% (1:2:1)
Nhận xét:
37
- Với hệ dung môi 1; Tạo vết hình quả bầu có Rf = 0,77. Ta chọn hệ dung môi 1 là hệ chạy sắc ký cột.
3.12. K ết quả chạy sắc ký cột:
Đã lấy 0, Ig kháng sinh thô chạy sắc ký cột trên Silicagel, sử dụng hệ dung môi 1. Kết quả được trình bày ở bảng 16
Bảng 16: Kết quả hoạt tính các phân đoạn sau khi chạy sắc ký cột
Phân đoạn B. cereus s. flexneri
Z)[mm] s D[mm] s 1 14,65 0,12 14,51 0,26 2 ^ 4 0 0 0 0 5 17,13 0,18 17,22 0,09 6=^13 0 0 0 0 Nhận xét: - Kháng sinh có ít nhất 2 thành phần có hoạt tính.
- Các phân đoạn 1 và 5 ta tiến hành chấm sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi 1, kết quả (hiện hình bàng phương pháp VSV) được trình bày ở bảng 17:
Bảng 17: Kết quả thử sắc ký lớp mỏng sau chạy sắc ký cột:
Phân đoan Hệ 1 R f Phân đoạn 1 - Phân đoạn 5 0,82 Nhân xét:
- vết kháng sinh trên không phát quang dưới ánh sáng tử ngoại và cũng không cho phản ứng màu với thuốc thử Ninhydrin đã sử dụng.
- Phân đoạn 5 đem cô lấy cắn. cắn được kết tinh lại trong hỗn họp dung môi, lọc, sấy dưới 50*^c thu được kháng sinh tinh khiết có m = 0,01g
38
3.13. K et quả phân loại theo ISP của xạ khuẩn Streptom yces 160.13
Chủng xạ khuẩn Streptomyces 160.13 được nuôi cấy trên các môi trường ISP, kết quả được trình bày ở bảng 18. Hình ảnh chuỗi bào tử và bề mặt bào tử
Streptomyces 160.13 được trình bày ở phần phụ lục.
Bảng 18: Các đặc điểm của Streptomyces 160.13 và Streptomyces avellaneus.
Các đặc đỉêm phân loại Streptomyces 160.13 Streptomyces avellanem
Màu khuân ty ký sinh Xám (Gy) Gy
Săc tô melanoid 0 0
Màu khuân ty cơ chât 0 0
Săc tô hoà tan 0 0
Chuôi bào tử RF RF
Bê mặt bào tử Tron nhăn (Sm) Sm
Arabinoza + — D-xyloza — — Inositol — - D-Manitol — - D-Fructoza + + Sacaroza + + Raffmoza — - Rhamnoza — - Nhận xét:
Theo phưong pháp phân loại ISP thì Streptomyces 160.13 có 13/14 đặc điểm (92,87%) giống với Streptomyces avellaneus. Có thể cơ bản kết luận Streptomyces 160.13 là Streptomyces avellaneus.
39
3.14. K ết quả đo phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV) và nhiệt độ nóng chảy
♦ Kết quả đo phổ hồng ngoại (IR)
Phân tích các bước sóng hấp phụ cực đại:
* 3415 cm' đặc trưng cho liên kết NH mạch chính * 3139 em'* đặc trimg cho liên kết 0-H / Ancol, Phenol * 1643 cm'* đặc trưng cho liên kết CONH2
* 1402 cm"’ đặc trưng cho liên kết -CH2- ở nhánh * 1190 c m '\l 113 em'* đặc trưng cho liên kết C -0 / Ete * 614 em '’ đặc trưng cho liên kết C-Cl
Dựa vào kết quả phổ IR cho ta nhiều dự kiến về các nhóm chức có thể có trong cấu trúc của kháng sinh tinh khiết sắc ký.
♦ Kết quả đo phổ tử ngoại (UV): Phổ tử ngoại cho đỉnh hấp phụ ở 195nm. ♦ Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy: tnc= 235,7®c.
40
KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ
Kết luận:
Sau thời gian tiến hành thực nghiệm, chúng tôi đã hoàn thành được các mục tiêu đề ra và thu được các kết quả sau;
* Phân loại theo ISP, Streptomyces 160.13 có 13/14 đặc điểm (92,87%) giống với Streptomyces avellaneus.
* Khi nuôi cấy bề mặt, Streptomyces 160.13 sinh tổng họp kháng sinh tốt nhất trên MT5, khi lên men chìm MT5 dd là môi trưòng tốt nhất.
* Chủng Streptomyces 160.13 được sàng lọc ngẫu nhiên và đột biến cải tạo giống đã chọn được một số biến chủng có hoạt tính tăng lên rõ rệt so với chủng ban đầu, đó là các dạng chủng 3, 7, 20 sau sàng lọc ngẫu nhiên; biến chủng 5, 14, 16 sau đột biến lần 1; biến chủng 2, 4, 22 sau đột biến lần 2.
* Kháng sinh do chủng Streptomyces 160.13 sinh tổng hợp có một số đặc điểm: kháng sinh được chiết bằng cột chứa nhựa Amberlite IRC 50. Dung dịch NaOH 0,75N có khả năng phản hấp phụ KS trên cột trao đổi ion.
* Kháng sinh có thể tách và tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là Silicagel 60 F245, Merck.
* Kháng sinh có một số nhóm chức đặc thù.
Kiến nghị:
- Tiếp tục cải tạo giống để thu được chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt hơn.
- Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men để nâng cao hiệu suất lên men.
- Tiếp tục hoàn thiện quy trình tách chiết, tinh chế để tiến hành tách được các thành phần kháng sinh tinh khiết khác.
- Tiến hành đo phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân...nhằm xác định cấu trúc hoá học và các tính chất lý hoá của kháng sinh.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bộ môn Công nghiệp Dược (2006), Kỹ thuật sản xuất Dược phẩm, Đại học Dược Hà Nội, tập 2, trang
2. Bộ môn Dược lý (2006), Dược lý học, Trường Đại Học Dược Hà Nội, tập 2, trang 112-130.
3. Bộ môn Hóa phân tích (2002), Hóa phân tích, Trường Đại Học Dược Hà Nội, tập 2, trang 25~28; trang 43-98.
4. Bộ môn Vi sinh- Sinh học (2007), Vỉ sinh vật học, Trường Đại Học Dược Hà Nội, trang 3-30; trang 37-47; trang 73-89.
5. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, NXB Khoa học và kỹ thuật, trang 9-23.
6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học,
NXB Giáo Dục, trang 38-41.
7. Từ Minh Koóng (2004), Cơ sở công nghệ sinh học và sản xuất dược phẩm, NXB Y học, trang 42-54.
8. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (2003), Cơ sở di truyền học, NXB Giáo Dục, trang 40-49.
9. Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, NXB Khoa học và kỹ thuật, trang 40- 52.
' 10. Cao Văn Thu (2000), Bài giảng về kháng sinh và vitamin, Hà Nội, trang 1-5; trang 21-25; trang 42-68.
Tiếng Anh
11. E.B Shirling, D. Gottlied (1966), Method fo r characterozation o f Streptomyces species, Int, J, s yst, Bacteriol, vol.16, p 313-340.
12. Sailesh Malla, Narayan Prasad Niraula, Bijay Singh, Kwangkyoung Liou, Jae Kyung Sohng (November, 2009^, “Limitations in doxorubicin production from
13. Sarah J. Higginbotham, Cormac D. Murphy (December, 2008),
“Identification and characterisation of a Streptomyces 5/?.isolate exhibiting activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus”. Microbiological Research,
PHU LUC 1 6 0 - 1 3 - 0 0 4 P r i n t M a g : 5 3 3 0 x @ 5 1 m m 2 : 3 6 : 5 4 p 1 2 / 2 5 / 0 9 T E M M o d © : I m a g i n g 2 m x c r o n s H V = 8 0 . 0 k V D i r e c t M a g : 2 5 0 0 x E M L a b - N I H E
Hinh PI: Chuoi bao tir
1 6 0 - 1 3 . 0 0 6 P r i n t M a g : 1 5 6 0 0 x @ 5 1 m m 2 : 3 9 : 3 5 p 1 2 / 2 5 / 0 9 T E M M o d e : I m a g i n g 5 0 0 n m H V = 8 0 . 0 k V D i r e c t M a g : 8 0 0 0 x E M L a b - N I H E Hinh P2: m lt bao tvr
Hình P3; Hoạt tính kháng sinh của các chủng đột biến lần 2 ( Vi khuấn kiểm định s. ýlexneri)
Hình P4: Hoạt tính kháng sinh của các phân đoạR 1,5 sau khi chạy sắc ký cột ( Vi khuẩn kiểm định s. ýlexneri)
2..S00 Ị - í t —I < 1.163 -0.174 180.00 Measurement Properties Wavelength Range (nm ); Scan Speed: 1-90,00 to 800.00 Fast 490.00 nm. soo.oo
No. p/v W avelength Abs. Description
1 195 00 2 186
BO MON HOA VAT LIEU-KHOA HOA-TRƯONG DHKHTN
Ten may: GX-PerkinElmer-USA Resolution: 4cm -1
Date; 5/6/2010
Nguoi do: Phan Thi Tuyet Mai DT:01684097382 Mail; maiplm@yahoo.com
r ^