Chuẩn bị môi trưÒTig phân lập (MT2), tiệt trùng ở 120®C/30 phút rồi đặt thạch nghiêng. Khi môi trường nguội, dùng que cấy vô trùng cấy zigzac các bào tử
Streptomyces 160.13 lên bề mặt thạch nghiêng. Để ở 28*^c trong 6 ngày cho xạ khuẩn phát triển, sau đó đem cất trong tủ lạnh (2-4‘^C). Định kỳ cấy truyền sau 3-6 tháng.
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuyếch tán
Nguyên tắc; Mau thử được đưa lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy v s v kiểm định, kháng sinh từ mẫu thử khuyếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của v s v kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
Tiến hành:
♦ Chuẩn bị môi trưòng cấy v s v kiểm định, v s v kiểm định được cấy vào môi trường canh thang (đối với vi khuẩn), môi trưòng Sabouraud lỏng (đối với nấm men) hoặc đưa vào dung dịch Tween 80 hay dung dịch xà phòng 0,1% (đối với nấm mốc). Nuôi cấy tạo hỗn dịch v s v kiểm định có nồng độ từ 10^-10* tế bào/ml bằng
18
cách ủ trong tủ ấm ở 37'^c trong 18-24h (đối với vi khuẩn), ở 30**c trong 24- 48h (đối với vi nấm). Đưa hỗn dịch này vào môi trường thạch thường (đối với vi khuẩn), vào môi trưòmg Sabouraud đặc (đối với vi nấm) ở 40-50®C sau khi đã hấp tiệt trùng
ở I20V/30 phút với tỷ lệ Vgiống /Vthạch thường = 5/200, lắc đều để v s v kiểm
định phân tán đều vào môi trường, đổ vào hộp Petri với thể tích 20ml/hộp.
♦ Đưa mẫu thử vào hộp Petri có chứa môi trưÒTig v s v kiểm định; Có 3 cách thử - Phương pháp đặt khối thạch: Mau thử là các khối thạch (bề mặt (|)=6mm) chứa v s v cần thử lên bề mặt môi trường v s v kiểm định.
- Phương pháp đục giếng thạch; Đục các giếng trên môi trường v s v kiểm định ((j) =6mm), sau đó cho 0,05ml mẫu thử dạng dung dịch vào mỗi giếng thạch.
- Phương pháp đặt khoanh giấy lọc: Các khoanh giấy lọc ((|) = 6mm) đã sấy khô được tẩm 3-5 lần dung dịch thử, sấy khô ở 45®c, sau đó đặt các khoanh giấy này lên bề mặt môi trường v s v kiểm định.
♦ Nuôi cấy: Các hộp Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°c trong 18-24h (đối với vi khuẩn) ở 30^c trong 24- 48h (đối với vi nấm).
♦ Đánh giá kết quả; Dựa vào đường kính vòng vô khuẩn (vô nấm) và được đánh giá theo công thức:
n n , __
D = ---- s= 1 -=1---
n \ n - \
D: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn (vô nấm). D ,: Đường kính vòng vô khuẩn (vô nấm) thứ i .
s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh, n : Số thí nhiệm làm song song.
2.3.3. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp
Nguyên tắc; Chủng xạ khuẩn Streptomyces 160.13 nuôi cấy trên môi trường
xác định trong thời gian và nhiệt độ thích hợp sau đó thử hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn với chín loại v s v kiểm định và môi trường nào xạ khuẩn có hoạt tính cao nhất được chọn làm môi trường nuôi cấy xạ khuẩn cho những nghiên cứu tiếp theo.
19
Tiến hành:
♦ Cân pha bảy môi trường, hấp tiệt trùng các môi trường ở 120°C/30 phút. Rồi đổ môi trường ra các đĩa Petri vô trùng (20ml/ đ ĩa ).
♦ Cấy zigzac chủng Streptomyces 160.13 lên bề mặt các môi trưÒTig, ủ ở 28**c
trong 6 ngày. Sau đó đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phưong pháp đặt khối thạch và tiến hành đánh giá.
2.3.4. Phương pháp cải tạo và chọn giống a) PhưoTig pháp chọn lọc ngẫu nhiên:
♦ Cân pha môi trường đã chọn, tiệt trùng ở 120*^C/30 phút. Đổ môi trường ra các đĩa Petri vô trùng (20ml/đĩa) và để nguội. Pha hỗn dịch bào tử: lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 160.13 cho vào ống nghiệm chứa lOml nước cất vô trùng lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn họrp bào tử có nồng độ pha loãng 10'* (định ước). Sau đó pha loãng tiếp đến nồng độ 10'^ bằng nước cất vô trùng.
♦ Cấy bào tử: Dùng Pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng từ đến 10'^, nhỏ lên bề mặt thạch của môi trường đã chọn trong đĩa Petri. Dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch. Tiến hành trên 3 đĩa Petri cho mỗi nồng độ pha loãng, cho các đĩa vào ủ ấm 28*^c trong 6 ngày để khuẩn lạc phát triển. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
♦ Phép chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển tốt, mọc riêng rẽ sau 6 ngày, cấy zigzac lên bề mặt môi trưÒTig đã chọn trong đĩa Petri. Cho các đĩa vào ủ ấm 28®c trong 6 ngày, lấy ra thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch. Chọn 3-5 dạng chủng tốt nhất để nghiên cứu tiếp.
b) Phương pháp đột biến cải tạo giống bằng ánh sáng u v .
♦ Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 160.13 cho vào ống nghiệm chứa lOml nước cất vô trùng, lắc cho phân tử tan đều, thu được hỗn dịch có độ pha loãng 10’^ (định ước). Dùng Pipet vô trùng hút Iml hỗn dịch này pha loãng đến nồng độ 10'^ làm mẫu chứng, 9ml độ pha loãng 10'^ còn lại cho vào đĩa Petri vô trùng mang đi đột biển.
20
♦ Chiếu ánh sáng ƯV; 9ml hỗn dịch trên được chiếu ánh sáng ư v ở bước sóng 254nm, khoảng cách chiếu 60cm, thời gian chiếu 5 phút. Sau đột biến để mẫu trong tối 2h rồi dùng Pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ như trên.
♦ Cấy bào tử sau đột biến: Dùng Pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml mẫu chứng có độ pha loãng 10'^ và 0,1 ml hỗn dịch bào tử đã đột biến ở các nồng độ 10"'*, 10'^ cho vào các đĩa Petri có chứa môi trường, sau đó dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa song song. Các đĩa Petri được ủ ở 28*^c trong 6 ngày, khuẩn lạc xuất hiện thì lấy ra đếm và xác định
% sống sót theo công thức;
N
% độ sông sót =
Nmi SỐ khuẩn lạc sau đột biến No: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng
♦ Tiến hành sàng lọc các khuẩn lạc sau đột biến tương tự như phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên.
♦ Làm song song mẫu chứng.
% biến đổi hoạt tính kháng sinh được xác định theo công thức: % biến đổi hoạt tính =
Do
D. : Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau đột biến. ; Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn của mẫu chứng.
Dựa vào kết quả thu được chọn ra những biến chủng có % biến đổi hoạt tính dưong cao nhất để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo, bao gồrh đột biến tiếp thế hệ thứ 2 rồi lên men sinh tổng hợp kháng sinh.
2.3.5. Phương pháp lên men gián đoạn
Nguyên tắc: Chủng xạ khuẩn được nuôi trong môi trường dịch thể thích hợp trong máy lắc với tốc độ 140v/ phút, sau thời gian 5 ngày chủng được lấy ra lọc qua giấy lọc. Đánh giá kết quả bằng phương pháp giếng thạch.
21
Tiến hành:
♦ Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 160.13 sau khi nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng đủ 6 ngày được cấy vô trùng sang bình nón 250ml chứa lOOml MT5dd bằng lOml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc ở 28 ± 0,1^C với tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h.
♦ Lên men: Sau 48h nhân giống, giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa lOOml môi trường lỏng thích họp với tỷ lệ VgiốngrVmôi trưòtig = 1:10. Các bình lên men được lắc ở 28 ± 0,1*^C với tốc độ 140 vòng/phút/120h. Sau 120h lấy ra lọc dịch lên men, tiến hành thử hoạt tính kháng sinh của dịch ỉọc bằng phương pháp giếng thạch và đánh giá kết quả.
2.3.6. Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ
Dịch lọc được chỉnh về pH thích hợp rồi sử dụng dung môi hữu cơ để chiết. Chiết bằng các dung môi Chloroform, Ethyl acetat, N- Butanol, Diclomethan,
N-Buthyl acetat ở các pH 3; 5; 7; 9; 11. Tỉ lệ Vdung môi:Vdịch lọc = 1:5. Lắc đều và để hai giờ cho tách lớp. Sau đó thử hoạt tính kháng sinh trong dịch chiết (pha hữu cơ) và pha nước bằng phưong pháp khoanh giấy lọc. Căn cứ vào kết quả thu được, chọn được dung môi chiết tối ưu và pH chiết tối ưu.
2.3.7. Phương pháp sắc kí lóp mỏng
♦ Bản mỏng sắc ký có kích thước thích hợp được hoạt hoá ở lio'^c trong 30 phút. Pha hệ dung môi theo đúng tỷ lệ, cho vào các bình chạy sắc kí cho bão hoà hơi dung môi. Chấm dịch chiết có chứa hoạt chất cần sắc kí lên bản mỏng đã hoạt hoá, cách mép dưới l,5cm. Chấm dịch chiết từ 5- 15 lần. sấy khô bản mỏng ở 50*^c rồi cho vào bình chạy sắc kí có dung môi đã bão hoà.
Khi dung môi chạy đến 3/4 bản mỏng lấy ra đánh dấu vết dung môi chạy được. ♦ Xác định vết bằng phương pháp;
+ Soi đèn tử ngoại u v có A, = 254nm.
+ Phương pháp hiện màu hoá học; Phun dung dịch Ninhydrin lên bản mỏng sắc kí rồi sấy khô ở 50*^c để phát hiện vết. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
22
+ Phương pháp hiện hình VSV: Đặt bản mỏng sắc kí vào hộp Petri vô trùng, đổ môi trường chứa v s v kiểm định lên, ủ ở trong 24h. vết kháng sinh được xác định bằng sự xuất hiện của vòng vô khuẩn.
D..
TínhRf: R f=
Dy: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm của vết. Ddm: Khoảng cách dung môi chạy.
2.3.8. Phương pháp cất quay
Mục đích: Thu bột kháng sinh thô (hoặc tinh) từ dịch chiết dung môi hữu cơ (hoặc dịch tinh chế), để tiến hành các thử nghiệm tiếp theo.
Tiến hành: cất quay dịch chiết dung môi hữu cơ (hoặc dịch tinh chế) trong điều kiện áp suất giảm và nhiệt độ dưới 80°c. sấy khô cắn dưới 50*^0, cân chính xác và ghi kết quả và cất giữ bột kháng sinh thô thu được trong tủ lạnh.
2.3.9. Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh:
Dịch lọc lên men được phân đều vào 5 ống nghiệm, mỗi ống lOml, chỉnh pH các ống về pH khác nhau (3; 5; 7; 9; 11) để vào tủ lạnh. Sau 24h lấy trong mỗi ống nghiệm 5 ml dịch đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phưong pháp giếng thạch, lượng dịch còn lại trong ống nghiệm tiếp tục để vào tủ lạnh sau 5 ngày lấy ra để thử hoạt tính kháng sinh. Đánh giá từ đó lựa chọn pH tối ưu cho quá trình cất giữ và chiết xuất kháng sinh từ dịch lọc.
2.3.10. Phương pháp thử khả năng bền nhiệt của kháng sinh
Dịch lọc lên men phân đều vào 3 ống nghiệm mỗi ống lOml, ống 1 giữ ở nhiệt độ thường, ống 2 đun sôi 10 phút, ống 3 đun cách thuỷ 30 phút, sau đó đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phưoTig pháp giếng thạch và đánh giá kết quả.
2.3.11. Phương pháp tách kháng sinh bằng cột trao đổi ion
Chiết kháng sinh bằng cột chứa nhựa Amberlite IRC 50
♦ Hoạt hóa nhựa: Cho hạt nhựa vào cột, dùng nước vô ion rửa qua cột, rồi dùng HCl IN với thể tích gấp 3 lần thể tích hạt Amberlite IRC 50 chạy qua cột.
23
Dùng nước vô ion rửa để chỉnh về pH 6,5-7. Sau đó ta dùng NaOH IN với thể tích gấp 3 lần thể tích hạt Amberlite IRC 50 cho chạy qua cột. Dùng nước vô ion chỉnh về pH 7,5-8.
♦ Hấp phụ kháng sinh lên cột: Dịch lọc được chỉnh về pH 7,5-8 rồi đưa lên cột đã được hoạt hóa để hấp phụ kháng sinh lên cột. Tốc độ chạy cột sao cho thời gian tiếp xúc ttx= 6,0 phút. Kiểm tra tính bão hòa của cột (lấy mẫu dịch lọc trước qua cột và sau qua cột rồi đem thử hoạt tính kháng sinh).
Sau khi cột bão hòa (dịch sau qua cột chứa 90% hoạt chất của dịch lọc trước qua cột hoặc kết thúc hấp phụ) ta dùng nước vô ion rửa cột 3 lần cho sạch hết vết dịch lọc rồi đưa cột phản hấp phụ.
♦ Phản hấp phụ bằng các dung dịch khác nhau thu được các phân đoạn kháng sinh. Cứ lOml ta lấy 1 phân đoạn, số phân đoạn cần lấy tùy thuộc vào lượng dịch chứa kháng sinh chạy qua cột. Các phân đoạn thu được ta tiến hành thử bằng phương pháp giếng thạch.
2.3.12. Phương pháp sắc kí cột
♦ Chuẩn bị cột chạy sắc kí: Dùng cột sắc kí có đường kính 1 cm dài 50cm, chiều cao lóp chất nhồi 15cm. Chất nhồi được sử dụng 8g Silicagel 60 F254 Merck
cỡ hạt 0,06-0,2mm được hoạt hoá ở 110*^c trong 30 phút, sau đó được trộn với hệ dung môi chạy đưa lên cột, cho dung môi chạy qua khoảng Ih để ổn định cột.
♦ Cho mẫu cần tách hoà tan với một lượng tối thiểu dung môi vừa đủ tan hết rồi trộn với lưọĩig nhỏ Silicagel đã hoạt hoá khoảng 2 gam để bay hơi hết dung môi rồi cho lên cột đã được chạy ốn định.
♦ Chạy sắc kí: Pha hệ dung môi theo đúng tỷ lệ đã định, sau đó cho chạy qua cột khi mẫu đã được đưa lên cột, tốc độ chạy 0,5ml/ph. Dịch đã qua chạy sắc kí cột được hứng vào các ống nghiệm sạch mỗi ống 5ml và thử hoạt tính.
♦ Lựa chọn hệ dung môi: Chọn hệ hiện hình nhiều vết trong sắc kí lóp mỏng chạy trước, rồi hệ cho R f cao nhất với 1 vết hiện hình cho chạy cột cuối cùng.
24
♦ Các phân đoạn có hoạt tính kháng sinh sẽ được sắc kí lóp mỏng với một số hệ dung môi để xác định thành phần. Các phân đoạn có thành phần giống nhau được gộp lại đem cất quay.
2.3.13. Phương pháp phân loại Streptomyces theo ISP
♦ Phương pháp xác định màu của khuẩn lạc, màu của khuẩn ty cơ chất khi trưởng thành, đánh giá khả năng tạo sắc tố hoà tan: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Pha các môi trường ISPl; ISP2; ISP3; ISP4; ISP5 tiệt trùng ở 118°c/30phút, phân đều vào các ống nghiệm vô trùng (5ml/ống) để thạch nghiêng, cấy chủng giống Streptomyces 160.13 đã đủ 6 ngày tuổi lên bề mặt các môi tarờng ISP để cho xạ khuẩn phát triển ở 28'^c rồi quan sát ở 7; 14; 21 ngày.
- Các khuẩn ty khí sinh có thể gặp: Màu trắng (W); xám (Gy); đỏ (R); vàng (Y); xanh lá cây (Gn); xanh da trời (B); tím (V); nếu màu không xác định (X); màu rơi vào 2 khoảng thì ghi ký hiệu cả 2 màu.
- Khuẩn ty cơ chất nếu có màu thì ghi kí hiệu là 1 nếu không có màu kí hiệu là 0. - Sắc tố hoà tan ngoài màu sắc tố melanoid: Nếu có sự biến đổi màu trong 15 phút khi thay đổi pH (bằng cách nhỏ dung dịch HCl 0,05N và NaOH 0,05N) tức là chủng có khả năng tạo sắc tố hoà tan kí hiệu là 1, ngược lại ký hiệu là 0.
♦ Phương pháp xác định sắc tố melanoid
Tiến hành cấy zigzac chủng Streptomyces 160.13 lên bề mặt thạch nghiêng các môi trường ISP6, ISP7 đã tiệt trùng ở 118V/30phút. Để xạ khuẩn phát triển ở 28^C, đem quan sát ở ngày thứ 2 và ngày thứ 4. Nếu có sắc tố melanoid thì môi trưcmg sẽ chuyển sang màu sẫm hoặc màu đen, kí hiệu là 1, nếu môi trưòng không chuyển màu kí hiệu là 0, nếu nghi ngờ kí hiệu là V.
♦ Phương pháp xác định hình dạng bào tử và bề mặt bào tử:
- Chủng Streptomyces 160.13 được nuôi cấy sau 10-15 ngày quan sát và chụp hình dạng chuỗi bào tìr và bề mặt bào tử bằng kính hiển vi điện tử.
- Dạng chuỗi bào tử có thể gặp: Thẳng (R); thẳng hơi cong (Rp); móc câu (RA); xoắn lò xo (S). Bề mặt bào tử có thể có các dạng sau: phẳng nhẵn (Sm); sần sùi (wa); có gai (sp); có tóc (ha)
25
♦ Phương pháp xác định khả năng tiêu thụ nguồn carbon:
- Các đĩa Petri chứa môi trường ISP9 được thêm đường với tỷ lệ sao cho thu được các nguồn đường 1%, để nguội rồi cấy zigzac chủng Streptomyces 160.13 đã đủ ngày tuổi lên bề mặt môi trưòng. Song song làm các đĩa Petri chứng âm (chỉ có ISP9 mà không có đường), đĩa Petri chứng dương là các đĩa Petri chứa đường glucose. Để cho xạ khuẩn phát triển ở 2 8 V và đánh giá ở ngày thứ 12,14,16.
- Nếu ở nguồn đường nào mà chủng Streptomyces 160.13 phát triển mạnh hon đĩa chứng âm và bằng đĩa chứng dương thì ký hiệu (+) tức là chủng có sử dụng nguồn đường này. Còn nếu chủng không phát triển hoặc phát triển yếu hon so với đĩa chứng âm thì ký hiệu (-) vì chủng không sử dụng nguồn đường này. Nếu nghi ngờ thì ký hiệu là (±).