Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nấm có ích Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae trong phòng trừ sâu xanh bướm trắng (Peieris rapae) hại rau họ hoa thập tự.

BẠCH THỊ ĐIỆP Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHẾ PHẨM NẤM CÓ ÍCH PAECILOMYCES JAVANICUS VÀ METARHIZIUM ANISOPLIAE TRONG PHÒNG TRỪ SÂU XANH BƯỚM TRẮNG PEIERIS RAPAE HẠI RAU HỌ HOA TH

BẠCH THỊ ĐIỆP

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHẾ PHẨM NẤM CÓ ÍCH

PAECILOMYCES JAVANICUS VÀ METARHIZIUM ANISOPLIAE

TRONG PHÒNG TRỪ SÂU XANH BƯỚM TRẮNG (PEIERIS

RAPAE) HẠI RAU HỌ HOA THẬP TỰ”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

BẠCH THỊ ĐIỆP

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHẾ PHẨM NẤM CÓ ÍCH

PAECILOMYCES JAVANICUS VÀ METARHIZIUM ANISOPLIAE

TRONG PHÒNG TRỪ SÂU XANH BƯỚM TRẮNG (PEIERIS

RAPAE) HẠI RAU HỌ HOA THẬP TỰ”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Ngành : Công nghệ sinh học

Giáo viên hướng dẫn : 1 PGS.TS Phạm Thị Vượng

Thái Nguyên, 2014

thành khóa luận tốt nghiệp: “Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nấm có ích Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae trong phòng trừ sâu xanh bướm trắng (Peieris rapae) hại rau họ hoa thập tự” Trong quá trình

học tập và nghiên cứu, em đã nhận được sự dạy bảo tận tình của các thầy cô, đồng thời cũng nhận được sự giúp đỡ và động viên của gia đình, bạn bè

Trước hết, em xin gửi lời chân thành cảm ơn tới tất cả các quý thầy cô trong khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học nông lâm Thái Nguyên Cảm ơn Viện Bảo vệ thực vật đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu đề tài luận văn này

Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô PGS TS Phạm Thị Vượng, người đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho em và hơn cả là tấm gương

về lòng say mê nghiên cứu khoa học Xin gửi lời cảm ơn tới thầy TS Phạm Văn Duy, giảng viên khoa CNSH - CNTP đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn em hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn Th.s Nguyễn Thị Chúc Quỳnh cùng toàn thể anh, chị trong nhóm nghiên cứu Nấm côn trùng, Trung tâm Đấu tranh sinh học đã truyền đạt cho em tính chính xác, nghiêm túc trong nghiên cứu khoa học cũng như tinh thần trách nhiệm với những công việc mình làm Cuối cùng

em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu nặng tới những người thân trong gia đình, bố,

mẹ, anh chị em đã động viên, giúp đỡ em cả về vật chất lẫn tinh thần trong quá trình học tập

Hà Nội, ngày 7 tháng 6 năm 2014

Sinh viên

Bạch Thị Điệp

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Cơ sở khoa học việc sử dụng chế phẩm nấm có ích trong phòng trừ sâu hại 4

2.2 Tình hình phát sinh, gây hại của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae) 5

2.3 Sơ lược về Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae 7

2.3.1 Sơ lược về Paecilomyces javanicus 7

2.3.2 Sơ lược về Metarhizium anisopliae 9

2.4 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học từ nấm để phòng trừ sâu hại 12

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về sử dụng chế phẩm nấm có ích 13

2.5.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 13

2.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 14

Phần 3 ĐỐI TƯƠNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu 17

3.1.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 17

3.1.2 Thiết bị thí nghiệm 17

3.1.3 Hóa chất 17

3.1.4 Môi trường nuôi cấy 17

3.1.5 Phạm vi nghiên cứu 18

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 18

3.3 Nội dung nghiên cứu 18

3.4 Phương pháp nghiên cứu 18

3.4.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng của nấm Paecilomyces javanicus

và Metarhizium anisopliae 21

3.4.4 Đánh giá hiệu quả gây chết sâu ở nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae ở các liều lượng khác nhau 23

3.5 Các chỉ tiêu theo dõi 25

3.5 Tính toán và xử lý số liệu 25

Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Đánh giá khả năng ký sinh sâu hại của một số nguồn nấm đã thu thập được tại Viện Bảo vệ thực vật 26

4.2 Đánh giá tuyển chọn chủng nấm Metarhizium anisopliae và Peacylomyces javanicus có độc tính cao sau khi đã phân lập lại và làm thuần 29

4.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng của nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae 35

4.3.1 Xác định môi trường tối ưu nhân sinh khối nấm Paecilomyces javanicus 35

4.3.2 Xác định nhiệt độ thích hợp để nhân sinh khối chế phẩm 39

4.4 Nghiên cứu liều lượng diệt sâu thích hợp với nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae trong phòng thí nghiệm và nhà lưới 41 4.4.1 Thí nghiệm trong phòng 42

4.4.2 Thí nghiệm ngoài nhà lưới 45

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

Các ký hiệu, chữ viết tắt Diễn giải

A% Ẩm độ tương đối của không khí

bt Bào tử VBVTV Viện Bảo vệ thực vật

Bảng 4.1 Kết quả đánh giá khả năng diệt sâu của một số nguồn nấm đã

thu thập được tại Viện Bảo vệ thực vật 26 Bảng 4.2 Tỷ lệ ký sinh trở lại gây chết SXBT của một số nguồn nấm đã

thu thập được tại Viện Bảo vệ thực vật 28

Bảng 4.3 Đặc điểm hình thái cơ bản của P javanicus và M anisopliae ký

sinh trên sâu hại 30

Bảng 4.4 Hiệu lực phòng trừ SXBT của các chủng nấm Peacilomyces

javanicus đã tuyển chọn 33 Bảng 4.5 Hiệu lực phòng trừ SXBT của các chủng nấm Metarhizium

anisopliae đã tuyển chọn 34 Bảng 4.6 Số lượng bào tử nấm P javanicus sau 10 ngày nhân sinh khối

trên các loại môi trường nhân sinh khối khác nhau 36

Bảng 4.7 Số lượng bào tử nấm M anisopliae sau 10 ngày nhân sinh khối

trên các loại môi trường nhân sinh khối khác nhau 37

Bảng 4.8 Số lượng bào tử nấm P javanicus sau 10 ngày nuôi cấy ở các

mức nhiệt độ không khí khác nhau 39

Bảng 4.9 Số lượng bào tử nấm M anisopliae sau 10 ngày nuôi cấy ở các

mức nhiệt độ không khí khác nhau 40

Bảng 4.10 Hiệu quả diệt sâu của chế phẩm nấm P javanicus

(Pae-SXBT1) với các liều lượng khác nhau 42

Bảng 4.11 Hiệu quả diệt sâu của chế phẩm nấm M anisopliae

(Ma-SXBT1) với các liều lượng khác nhau 43

Bảng 4.12 Hiệu quả diệt sâu của chế phẩm nấm P javanicus với các liều

lượng khác nhau 45

Bảng 4.13 Hiệu quả diệt sâu của chế phẩm nấm M anisopliae với các liều

lượng khác nhau 46

Hình 2.1 Bắp cải bị sâu xanh bướm trắng gây hại 6

Hình 2.2 Khuẩn lạc Paecilomyces spp (A) và bào tử nấm P javanicus

(B) (nguồn https://www.biotect.or.th) 8

Hình 2.3 Khuẩn lạc Metarhizium anisopliae (A) và bào tử nấm

Metarhizium anisopliae (B) (nguồn http://www.naro.affrc.go.jp) 10

Hình 4.1 Khả năng diệt sâu của một số nguồn nấm thu thập được tại Viện

Bảo vệ thực vật 27 Hình 4.2 Tỷ lệ ký sinh trở lại trên SXBT của một số nguồn nấm thu thập

được tại Viện Bảo vệ thực vật 28

Hình 4.3 Sâu nhiễm nấm M anisopliae chuyển màu vàng xuất hiện vết

đen (A) và bào tử có màu xanh lục (B) 31

Hình 4.4 SXBT gây hại trên rau (A) và sâu bị nhiễm nấm P javanicus (B) 31 Hình 4.5 Khuẩn lạc P javanicus sau 3 ngày (A), 5 ngày (B) và 7 ngày (C) 31 Hình 4.6 Khuẩn lạc của nấm M anisopliae đã phân lập, làm thuần sau 3

ngày (A) và 7 ngày (B) 32

Hình 4.7 Bào tử của nấm Paecilomyces javanicus 32 Hình 4.8 Bào tử nấm Metarhizium anisopliae 32 Hình 4.9 Hiệu lực gây chết sâu của chủng nấm Paecilomyces javanicus

đã tuyển chọn 33

Hình 4.10 Hiệu lực gây chết sâu của các chủng nấm Metarhizium

anisopliae đã tuyển chọn 35 Hình 4.11 Sinh khối nấm P javanicus sau 10 ngày trên môi trường khác nhau 36 Hình 4.12 Sinh khối nấm M anisopliae sau 10 ngày trên 3 loại môi

trường khác nhau 38

Hình 4.13 Nhiệt độ thích hợp nhân sinh khối nấm P javanicus 39 Hình 4.14 Nhiệt độ thích hợp cho nhân sinh khối nấm M anisopliae 41 Hình 4.15 Liều lượng diệt sâu xanh bướm trắng của nấm P javanicus sau

các ngày phun 42

Hình 4.16 Liều lượng diệt sâu xanh bướm trắng của nấm M anisopliae

sau các ngày phun 44

Hình 4.17 Liều lượng diệt sâu SXBT của nấm P javanicus sau các ngày phun 45 Hình 4.18 Liều lượng diệt sâu thích hợp của nấm M anisopliae sau các

ngày phun 47

Phần 1 MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm gần đây, sản xuất nông nghiệp Việt Nam đang chuyển đổi theo hướng sản xuất hàng hóa, nhằm tạo ra khối lượng sản phẩm lớn, chất lượng cao, an toàn thực phẩm phục vụ tiêu dùng, cung cấp đủ nguyên liệu cho công nghiệp chế biến và xuất khẩu Cây rau đã và đang trở thành cây trồng quan trọng trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp Những cây

rau họ hoa thập tự (Crucirea) là nhóm thực phẩm quan trọng, chiếm 50% tổng

sản lượng rau Rau thập tự có thời gian sinh trưởng ngắn, nhóm rau này có thân lá mềm yếu và chứa nhiều chất dinh dưỡng [15]

Kết hợp với điều kiện khí hậu nóng ẩm, rau họ hoa thập tự ở nước ta bị nhiều loài sâu phá hại như sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh bướm trắng, muội, bọ

nhảy… Trong đó, sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae) là đối tượng gây hại

nguy hiểm nhất trên rau họ hoa thập tự nói chung và bắp cải nói riêng ở khắp các vùng trồng rau, đặc biệt là ở phía Bắc, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng rau [12] Sâu xanh bướm trắng gây hại mạnh nhất từ tháng 10 năm trước đến tháng 5 năm sau và nặng nhất trong tháng hai trên bắp cải cuộn Với đặc tính vòng đời ngắn, sinh sản nhiều, đặc biệt là tính kháng thuốc phát triển rất nhanh dẫn đến vấn đề dịch hại đã, đang nảy sinh nhanh chóng trên diện rộng, nhất là ở các vùng sản xuất rau tập trung, gây thiệt hại lớn về năng suất, chất lượng, kinh tế cho người nông dân Công tác phòng trừ sâu hại gặp nhiều khó khăn Để phòng trừ chúng, người nông dân đã thường xuyên sử dụng các loại thuốc hóa học bảo vệ thực vật trên đồng ruộng [9]

Hàng năm, có tới hàng ngàn trường hợp bị ngộ độc và nhiều trường hợp tử vong Ngoài ra, việc lạm dụng thuốc hóa học còn làm giảm số lượng thiên địch, sinh vật có ích giảm 70 - 100%, sâu hại kháng thuốc 20 - 1000 lần

so với bình thường, dẫn đến mất cân bằng sinh thái [12]

Việc lạm dụng thuốc hóa học trong bảo vệ thực vật của người dân đã và đang gây ra những hậu quả nghiêm trọng cho môi trường và sức khỏe con người… Không những vậy, nhiều loại thuốc hóa học đã bị cấm sử dụng vẫn được nông dân sử dụng tràn lan trên đồng ruộng Song song việc đối mặt với

tác hại của sâu bệnh trên đồng ruộng thì nông dân còn phải chịu tác động không nhỏ của sự ô nhiễm đất, nước, không khí Cùng với việc các loại rau ăn hàng ngày tồn dư lượng thuốc hóa học cao gấp nhiều lần cho phép đã dẫn đến nhiều hậu quả nghiêm trọng với sức khỏe con người

Xây dựng những vùng rau sản xuất an toàn đã và đang là yêu cầu cấp bách đối với thực tiễn sản xuất nông nghiệp Trong những hướng phòng trừ sâu bệnh hại rau thì việc áp dụng biện pháp sinh học là cơ sở để hình thành nên các vùng sản xuất rau an toàn Do đó, biện pháp phòng trừ sinh học cần được ưu tiên sử dụng nhằm quản lý dịch hại bền vững, giảm thiểu số lượng sử dụng cũng như tác hại của thuốc bảo vệ thực vật Rất nhiều chế phẩm sinh học đã và đang sử dụng trong phòng trừ sâu hại phổ biến trên các vùng trồng rau như: MPV, NPV, B.t, Delfin… Trong đó, hướng sử dụng chế phẩm nấm

có ích là hiệu quả, an toàn với môi trường và đáp ứng được nhu cầu cấp thiết

Vấn đề nghiên cứu sử dụng nấm có ích Peacilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae để sản xuất chế phẩm sinh học trừ sâu hại rau họ hoa

thập tự đã có nhiều thành công và có ý nghĩa to lớn về kinh tế… Việc thu thập, phân lập và thử nghiệm các dòng nấm có khả năng diệt sâu xanh bướm trắng là yêu cầu cấp thiết Những năm gần đây, Viện Bảo vệ thực vật đã tuyển

chọn được nhiều chủng nấm Hai loài Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae đã nghiên cứu, ứng dụng trên rầy nâu hại lúa, sâu tơ,

sâu khoang… nhưng chưa có nhiều nghiên cứu trên đối tượng sâu xanh

bướm trắng Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu

sử dụng chế phẩm nấm có ích Peacilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae trong phòng trừ sâu xanh bướm trắng (Peieris rapae) hại rau

họ hoa thập tự”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Tuyển chọn chủng nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae có hoạt lực cao diệt sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae) từ nguồn

nấm đã thu thập được tại Viện Bảo vệ thực vật Nghiên cứu sử dụng hai loài

nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae để sản xuất chế phẩm

sinh học phòng trừ sâu xanh bướm trắng (SXBT) hại rau họ hoa thập tự

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

- Xác định một số đặc điểm sinh học, sinh thái chính của loài nấm

Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae làm cơ sở trong việc tạo chế phẩm sinh học trong phòng trừ SXBT (Pieris rapae) hại rau họ hoa thập tự

- Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dữ liệu khoa học cần thiết góp phần làm cơ sở cho việc xây dựng biện pháp sinh học phòng trừ SXBT có hiệu quả

- Đề tài là cơ sở khoa học, định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo trong phòng trừ SXBT ngoài đồng ruộng

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Nghiên cứu sử dụng chế phẩm Paecilomyces javanicus, Metarhizium

anisopliae trong phòng trừ SXBT, giảm sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, góp

phần bảo vệ môi trường sinh thái

- Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế kỹ thuật của biện pháp phòng trừ sinh học trong hệ thống quản lý tổng hợp sâu hại rau họ hoa thập tự (IPM), bảo vệ môi trường, thiên địch trên đồng ruộng, tạo sản

phẩm rau an toàn cho người tiêu dùng, chế biến và xuất khẩu

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cơ sở khoa học việc sử dụng chế phẩm nấm có ích trong phòng trừ sâu hại

Trong sinh quần nông nghiệp có nhiều tác nhân sinh học là nhân tố điều hòa tự nhiên, duy trì cân bằng sinh thái của quần thể sinh vật trên đồng ruộng [6] Trong số các tác nhân sinh học gây chết sâu hại cây trồng, nấm ký sinh côn trùng chiếm một vị trí đặc biệt quan trọng Bằng quá trình đấu tranh sinh học, các nấm diệt sâu trong thiên nhiên đã làm được nhiệm vụ điều hoà

và tiêu diệt một lượng lớn các côn trùng gây hại [16]

Nước ta là một nước khí hậu nhiệt đới gió mùa, với khí hậu nóng ẩm quanh năm, độ ẩm cao nên rất thuận lợi có sự phát sinh và lây nhiễm của nấm bệnh Thành phần nấm ký sinh trên các sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng và phong phú

Trong đó, có hai loài nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae

Nấm Spicaria javanica (tên cũ của nấm Paecilomyces javanicus) lần

đầu tiên được tác giả Friederichs và Bally - Meded phát hiện, ghi nhận vào năm 1923 trên sâu non bộ cánh vẩy Đến năm 1957, tác giả A.H.S Brown và

G Smith, đưa vào hệ thống chi Paecilomyces và đặt tên là Paecilomyces javanicus Sau đó tên của nấm đã được thay đổi 3 lần vào các năm: 1959 với tên khoa học là Spicaria formosensis (tác giả Sowoda người Đài Loan), 1993

là Cordyceps scarabaeicola (tác giả Liang Z Q, Trung Quốc) và vào năm

2005 là Isaria javanicus (Samson và Hywel) Tuy nhiên, danh pháp Paecilomyces javanicus vẫn là tên nấm được dùng thông dụng và phổ biến

nhất hiện nay [25; 30; 37]

Nấm Paecilomyces javanicus đã được ứng dụng để phòng trừ nhiều loại

côn trùng bộ cánh vảy (Lepidoptera) và bộ hai cánh (Diptera) hại cây trồng như

sâu tơ Plutella xyllostella, sâu khoang (Spodoptera litura), sâu ăn lá (Trilocha varians) và một số loại côn trùng thuộc bộ hai cánh [20; 27; 37]

Nấm Metarhizium anisopliae là loài phổ biến, chúng phân bố và có phổ

ký chủ rất rộng Vào năm 1879, tác giả Metchnikov đã phân lập được loài

nấm trên từ bọ cánh cứng Anisopliae austrinia và ông đặt tên là Entomophtora anisopliae và khuyến cáo nên sử dụng nấm này để phòng trừ

các loại côn trùng hại cây trồng Năm 1883, tác giả Sorokin đổi lại nấm này

thành tên Metarhizium anisopliae Sorokin Vì nấm có màu lục hoặc xanh lục

nên người ta thường gọi là nấm lục cương hay nấm xanh Năm 1976, nhà

khoa học Tulloc đã phân loại nấm và rút ra kết luận trong chi Metarhizium chỉ

có hai loài nấm đó là Metarhizium anisopliae và Metarhizium flavoviride, trong đó loài Metarhizium anisopliae chiếm khoảng 70% Sau đó, tác giả đặt lại tên cho loài nấm gây bệnh côn trùng Metarhizium anisopliae là nấm Mertarhizium album và Mertarhizium brunneum Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã sản xuất thành công thuốc nấm Metarhizium anisopliae với số

lượng lớn và đã sử dụng rộng rãi để phòng trừ nhiều loại côn trùng hại cây trồng đạt hiệu quả cao [13]

Vấn đề sử dụng nấm có ích trong phòng trừ sinh học được quan tâm nghiên cứu Người đi tiên phong trong lĩnh vực này chính là nhà khoa học người Nga Ilya Ilich Mechnikov (1884) Ông cùng người học trò của mình là nhà côn trùng học Isac Krasirsik đã tiến hành sản xuất bào tử nấm

Metarhizium anisopliae thuần khiết, trộn với đất bột để rải ra đồng ruộng diệt sâu non và trưởng thành bọ đầu dại hại củ cải đường (Bothinoderes punctiventris) và đã đạt được hiệu quả gây chết đến 55 - 80% sau 10 - 14 ngày Tiếp đó, rất nhiều công trình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng nấm có

ích phòng trừ sâu hại cây trồng

Do có sự phân bố rộng rãi với phổ ký chủ rộng, nấm M anisopliae và

P javanicus đã được ứng dụng hiệu quả trong phòng trừ sinh học đối với côn

trùng có hại [30; 34]

2.2 Tình hình phát sinh, gây hại của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae)

Sâu xanh bướm trắng có tên khoa học là Pieris rapae, thuộc họ Pieridae,

bộ Lepidoptera gây hại chủ yếu trên rau họ hoa thập tự, đặc biệt trên bắp cải

[26] Đối với ruộng rau mới trồng, sâu thường chui vào phần ngọn cây để phá hại làm các lá khi lớn bị cong queo, thủng lỗ chỗ Với bắp cải đã cuốn, sâu non đục sâu vào trong bắp và thải phân loang lổ, làm giảm chất lượng, mẫu mã sản phẩm Sâu xanh bướm trắng phát sinh gây hại quanh năm, trong đó có 2 đợt gây

hại chính trên rau xuân (tháng 3 - tháng 6) và rau đông (tháng 10 - tháng 11) [38]

Nghiên cứu về tình hình gây hại của các đối tượng sâu hại trên rau đã được nhiều quốc gia trên thế giới quan tâm Ở Việt Nam, kết quả điều tra 3 năm 1995 - 1997 ở vùng Đồng Bằng Sông Hồng của Lê văn Trịnh đã xác định được 31 loài côn trùng gây hại trên rau thập tự, trong đó 3 đối tượng quan trọng nhất là: sâu tơ, sâu khoang và sâu xanh bướm trắng Sâu xanh bướm trắng tập trung gây hại chủ yếu trên bắp cải, su hào, súp lơ [15]

Theo số liệu thống kê, nông dân vùng ngoại thành thành phố Hồ Chí Minh phải phun thuốc bảo vệ thực vật 20 - 30 lần trong một vụ bắp cải [10] Còn ở vùng ngoại thành Hà Nội nông dân phun trung bình từ 9,7 đến 15,1 lần thuốc/vụ rau với lượng phun cao gấp 1,7 đến 2,4 lần so với khuyến cáo Hơn nữa, người nông dân phải sử dụng hỗn hợp 2 - 3 loại thuốc với hy vọng thuốc mới có phổ tác động rộng, trừ được nhiều loại sâu bệnh, nâng cao hiệu quả của thuốc Có đến 80% nông dân các vùng trồng rau sử dụng hỗn hợp hai loại thuốc với nhau và 6,6 - 12,2% hỗn hợp trên 3 loại thuốc [9] Nhưng do những hạn chế về hiểu biết nên hỗn hợp thuốc không có tác dụng hỗ trợ nhau mà ngược lại làm giảm tác dụng và là nguyên nhân gây nên tính kháng thuốc của sâu, ngộ độc thực phẩm và ô nhiễm môi trường [5; 9]

Hình 2.1 Bắp cải bị sâu xanh bướm trắng gây hại

(nguồn https://www.udkhcnbinhduong.vn)

2.3 Sơ lược về Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae

2.3.1 Sơ lược về Paecilomyces javanicus

2.3.1.1 Vị trí phân loại của Paecilomyces javanicus

Theo Samson (1974), Paecilomyces có vị trí phân loại dựa vào cấu trúc

cơ quan sinh sản hữu tính thì chi nấm Paecilomyces thuộc giới (Kingdom) Fungi, ngành (Phylum) nấm túi Ascomycota, ngành phụ Pezizomycotina, lớp (Class) Eurotiomycetes, bộ (Order) Eurotiales, họ (Family) Trichocomaceae, chi (Genus), Paecilomyces, loài (Species) Paecilomyces sp [30]

2.3.1.2 Đặc điểm, độc tố và cơ chế lây nhiễm, gây bệnh của nấm Paecilomyces javanicus trên cơ thể côn trùng

Đặc điểm hình thái

Kết quả nghiên cứu của tác giả Samson R A (1974, 2004) [29; 30] cho

thấy, nấm Paecilomyces javanicus phát triển tương đối tốt trên môi trường

Malt - Agar Đường kính khuẩn lạc đạt trên 3 cm sau 14 ngày nuôi cấy ở

250C Bề mặt khuẩn lạc có dạng bột ghồ ghề đến bông xốp, ban đầu có màu trắng sau chuyển màu kem rồi chuyển màu tím xám Sợi nấm mịn, ngăn vách, trong suốt, đường kính 0,5 - 2,2 µm Cành bào tử mọc trực tiếp từ sợi nấm dinh dưỡng hoặc sợi nấm khí sinh với chiều dài lên đến 50 µm Trên cành bào

tử hình thành các điểm sinh thể bình, tại mỗi điểm có khoảng 2 - 3 thể bình

Thể bình có kích thước 8 - 14 x 2 - 2,8 µm Thể bình có hình dạng thuôn nhọn tại đỉnh, đầu thuôn nhọn nhỏ tới 0,7 - 1,4 µm Bào tử đính đa số hình trụ, đôi khi hình thoi, mịn, trong suốt, kích thước 3,2 - 5,6 × 1,6 - 2,8 µm Trên côn trùng, nấm thường có dạng bột trắng tím và hình thành nhiều cành bào tử phân sinh Cành bào tử phân sinh thường tăng về chiều cao, với thể bình gần như hình cầu Các bào tử khi nuôi cấy trên môi trường agar có thể sinh bào tử nhỏ, hình thoi với kích thước từ 3 - 3,5 x 1,2 - 1,7 µm [29; 30]

Khuẩn lạc P javanicus trên môi trường MEA (Malt Extract Agar) phát

triển chậm, đường kính khoảng 30 mm trong 14 ngày ở 250C Bào tử trần thường

có hình trụ điển hình, trong suốt và có kích thước 5 - 7,4 x 1,4 - 1,7 µm [2]

Hình 2.2 Khuẩn lạc Paecilomyces spp (A) và bào tử nấm P javanicus (B)

(nguồn https://www.biotect.or.th)

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Trong quá trình phát triển, nấm Paecilomyces spp nói chung cần nhiều

dưỡng chất, nếu thiếu chất dinh dưỡng sẽ làm hạn chế khả năng gây bệnh của nấm đối với côn trùng Nhiệt độ và ẩm độ ảnh hưởng đến quá trình hình thành

và phát triển của bào tử nấm Paecilomyces spp [29]

Theo Tạp chí Bảo vệ thực vật, Lê Thị Kim Oanh (2002), nấm

Paecilomyces javanicus thích hợp ở nhiệt độ 280C và ẩm độ trong phạm vi 80

- 90% Độ ẩm cao có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, độ

ẩm thấp lại có lợi cho sự duy trì sự sống của nấm Bào tử phân sinh của nấm

Paecilomyces spp có khả năng sống lâu trong điều kiện độ ẩm từ 0 - 34% hơn

là ẩm độ 75% Nấm côn trùng nói chung rất cần ánh sáng cho sự phát triển và

nấm Peacilomyces spp cũng không ngoại lệ Vì vậy, ánh sáng là nhân tố không thể thiếu trong sự hình thành bào tử nấm Peacilomyces spp [9]

Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của Paecilomyces javanicus

Nấm Paecilomyces sp có một cơ chế lây nhiễm duy nhất là tấn công

vào xoang máu thông qua lớp biểu bì hoặc có thể thông qua đường miệng côn trùng Côn trùng chết là sự kết hợp từ các yếu tố như tổn thương mô cơ do sự xâm chiếm, suy giảm nguồn dinh dưỡng và nhiễm độc tố do nấm tiết ra khi ở trong cơ thể côn trùng Quá trình bám vào cơ thể côn trùng là một quá trình thụ động với sự giúp đỡ của gió và nước [20]

Bào tử nấm được phát tán trong tự nhiên, rơi trên thân côn trùng và dính chặt vào da côn trùng theo cơ chế bám dính không chuyên biệt thông qua tính kỵ nước của vách tế bào bào tử Lớp kỵ nước này xuất hiện đặc biệt ở giai đoạn bào tử Độ bám dính của các bào tử trên bề mặt biểu bì là nhờ lớp

kỵ nước Lectins, một loại cacbohydrate glycoprotein được phát hiện trên bào

tử, giúp cho việc bám vào bề mặt biểu bì của bào tử Sau 24 giờ, gặp điều kiện thuận lợi bào tử nảy mầm và mọc thành sợi nấm đâm qua vỏ kitin và các

lỗ thông hơi của côn trùng Trong quá trình đó, sợi nấm tiết ra phức hệ enzym phân huỷ protein, lipit, kitin của côn trùng Các enzyme đó là exoproteases, endoproteases, esterases, lipase, chitinases và chitobiases Trong đó, chitinases và endoprotease là hai emzym giữ vai trò quan trọng nhất [31] Sau

đó, sợi nấm phát triển ngay trong cơ thể côn trùng cho đến khi xuất hiện tế bào nấm đầu tiên Ở giai đoạn này, lympho của côn trùng chứa đầy sợi nấm, các hồng cầu bị phá vỡ, dinh dưỡng bị đình trệ Đồng thời, độc tố nấm tác động vào hệ thần kinh và làm tê liệt hoạt động của côn trùng Các ngoại độc

tố với bản chất hóa học là destruxin A (C29H47O7N5) và destruxin B (C30H51O7N5) và Boverixin (C45H57O9N3), gây hiện tượng tê liệt thần kinh, phá huỷ quá trình hô hấp, làm cho côn trùng có những thay đổi về bệnh lý và chết Sau khi côn trùng chết, nấm vẫn tiếp tục sinh trưởng phát triển trên xác của vật chủ, vì đây là nguồn cơ chất giàu hữu cơ [36]

2.3.2 Sơ lược về Metarhizium anisopliae

2.3.2.1 Vị trí phân loại của Metarhizium anisopliae

Xếp theo hệ thống phân loại nấm của G.C Anisworth, 1966, 1970,

1971 thì loài nấm Metarhizium anisopliae thuộc giới nấm Fungi hay Mycota, ngành nấm thật Eumycota, ngành phụ Mastigomyedina, ngành phụ lớp nấm bất toàn Deuteromycetes, chi Metarhizium, loài Metarhizium anisopliae [13] 2.3.2.2 Đặc điểm, độc tố, cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của nấm Metarhizium anisopliae

Đặc điểm hình thái của Metarhizium anisopliae

Sợi nấm phát triển trên bề mặt côn trùng có màu từ trắng đến hồng, cuống sinh bào tử ngắn mọc tỏa tròn trên đám sợi dày đặc Bào tử trần hình que có kích thước 3,5 x 6,4 x 7,2 µm, màu từ lục xám đến ôliu - lục, bào tử

xếp thành chuỗi khá chặt chẽ và nhìn bằng mắt thường có thể thấy bào tử được tạo ra trên bề mặt côn trùng một lớp phấn khá rõ màu xanh lục Sợi nấm khi phát triển bên trong côn trùng có chiều rộng 3 - 4 µm, dài khoảng 20 µm, chia thành nhiều tế bào ngắn, trong tế bào có thể thấy rõ nhiều giọt mỡ [33]

Nấm Metarhizium anisopliae có khuẩn lạc màu xanh, đôi khi có màu

tối hoặc màu hồng vỏ quế, chúng phát triển chậm trên môi trường không có peptone, ví dụ như PDA, Czapek - Dox và thích hợp trên môi trường có peptone như Sabouraud, nấm phát triển tốt trong điều kiện 250C, ẩm độ 80% sau 7 - 10 ngày nuôi cấy đường kính khuẩn lạc đạt 4 - 6 cm [33]

Hình 2.3 Khuẩn lạc Metarhizium anisopliae (A) và bào tử nấm Metarhizium anisopliae (B) (nguồn http://www.naro.affrc.go.jp)

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của M anisopliae

Metarhizium anisopliae không sinh trưởng tốt trên nền cơ chất không

có kitin, chúng sống được ở nhiệt độ thấp 80C, nơi tích lũy nhiều CO2 và thiếu

O2có biên độ về độ ẩm rộng, có thể sống đến 445 ngày Ở nhiệt độ dưới 100C

và trên 450C nấm thường không hình thành bào tử Nhiệt độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử nấm từ 25- 300C và bào tử chết khi ở 49 - 550C, nhiệt độ

nấm Metarhizium anisopliae phát triển tốt nhất là 250C Độ pH có thể dao

động khoảng 3,3 - 8,5 và pH thích hợp cho nấm phát triển là 6 Nấm M anisopliae có khả năng phân giải tinh bột, xenluloza và kitin của côn trùng gây

hại cây trồng Nấm có thể đồng hóa được nhiều nguồn thức ăn cacbon khác nhau và chúng phát triển tốt trên môi trường chứa glucogen và lipit Để tạo bào

tử, nấm M anisopliae đòi hỏi độ ẩm không khí khá cao trên 80% [14]

Độc tố của nấm Metarhizium anisopliae

Gồm một số ngoại độc tố Destruxin A, B, C, D, E, các ngoại độc tố là sản phẩm thứ cấp, vòng peptit, L - leucine, anhydride, L - prolyn - L - valine anhydride và Desmethyl Destruxin B

Độc tố Destruxin A có công thức nguyên là C29H47O7N5, có điểm sôi là

1880C Độc tố Destruxin A có bản chất hóa học là D - 2 hydroxy - 4 - pentenoy - L - prolyl - L - isoleucyl - N - methyl - L- valyl - N - methyl - L - alanyl - β - alanyl lacton Đây là những Depxipeptit vòng

Độc tố Destruxin B có công thức nguyên là C30H51O7N5, có điểm sôi là

2340C, có bản chất hóa học là D - α - hydroxy - γ - methylvaleryl - L - prolyl - L - isoleucyl - N - methyl - L - valyl - N - methyl - L - alanyl - β - alanyl lacton

Destruxin A và B thường gây ra triệu chứng tê liệt thần kinh trên một số sâu non của côn trùng hại cây trồng Hai độc tố này chỉ độc đối với côn trùng hại cây trồng khi chúng ăn phải mà không độc khi xâm nhập qua da [28]

Độc tố Destruxin E có tác động như một chất ức chế miễn dịch ngăn cản phản ứng phòng vệ tế bào và thể dịch của một số côn trùng hại bộ hai cánh Diptera

và độc tố này có hiệu quả hơn loại A và B Destruxin E có tác dụng như một chất kháng sinh

Nấm lục cương M anisopliae có thể tạo ra các enzyme phân hủy

protein độc và các chất ức chế phản ứng kháng men protease trong tế bào máu của côn trùng Ngoài ra, còn tạo ra Chytochalasin có tác dụng ngăn cản sự kéo dài sợi actin (protein cấu thành sợi lông côn trùng) [14]

Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của M anisopliae

Metarhizium anisopliae, tên khoa học cũ là Entomophthora anisopliae,

là một loại nấm mọc tự nhiên trong đất trên toàn thế giới và gây bệnh ở loài

côn trùng bằng cách ký sinh Trong tự nhiên, khi bào tử nấm M anisopliae rơi

vào cơ thể côn trùng, gặp điều kiện thời tiết thích hợp Những bào tử vô tính (gọi là conidia) của nấm tiếp xúc với cơ thể của ký chủ côn trùng 24 giờ thì sẽ nảy mầm tạo ống mầm xuyên qua vỏ kitin côn trùng, sau đó phân nhánh tạo nên mạng sợi nấm chằng chịt bên trong cơ thể côn trùng Côn trùng phải huy

động các tế bào bạch huyết để chống đỡ nhưng nấm M anisopliae tiết ra các

độc tố Destruxin A, B… có chứa protease và một số chất khác, chúng phá hủy

tế bào bạch huyết, cuối cùng gây chết côn trùng Nếu độ ẩm môi trường xung quanh đủ cao, mốc trắng sau đó sẽ phát triển trên xác côn trùng và tạo nên màu

xanh lá cây do bào tử được sản xuất Nấm M anisopliae rất cần các điều kiện

nhiệt độ, ánh sáng… thích hợp cho quá trình bệnh lý và sự hình thành, phát

triển của các loại độc tố [13]

2.4 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học từ nấm để phòng trừ sâu hại

Hiện nay, có 2 công nghệ chính được sử dụng rộng rãi để nhân sinh khối nấm đó là công nghệ lên men chìm và công nghệ lên men xốp Mỗi công nghệ có những lợi thế khác nhau tùy vào quy mô sản xuất, điều kiện trang thiết bị, nguồn nguyên liệu sẵn có và sản phẩm cần đạt

Công nghệ lên men chìm có thể sản xuất chế phẩm ở quy mô lớn, tuy nhiên đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại Đồng thời với một quy trình tự động khép kín nên dễ dàng chuyển sang sản xuất trong nhà máy sản xuất chế phẩm sinh học với quy mô lớn nhưng nhược điểm là chỉ thu được chế phẩm ở dạng bào tử chồi (Plastospore) có cấu trúc không bền vững nên có thời gian sống ngắn

Công nghệ lên men xốp thu nhận được chế phẩm nấm dạng đính bào tử (Conidiospore), ổn định và bền vững hơn dạng bào tử chồi (Plastospore), vì vậy công nghệ này đã được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong phòng trừ sâu hại cây trồng Trong quy trình nhân sinh khối nấm thì việc lựa chọn và tạo được một thành phần dinh dưỡng thích hợp có ý nghĩa quan trọng: làm tăng độc tính diệt sâu của nấm và tăng số lượng bào tử nấm [12]

Nhóm tác giả Ma J và CS., (2007) [27] cũng đã thử nghiệm một số

môi trường lên men xốp để nhân sinh khối nấm P javanicus, đó là các môi

trường gạo, ngô có bổ xung pepton Kết quả thử nghiệm cho thấy, nấm phát triển tốt trên cả hai môi trường gạo và ngô có bổ xung pepton 0,2%, lượng bào tử đạt tương ứng 8,72 x 1012 bt/kg và 8,35 x 1012 bt/kg cao hơn rất nhiều

so với công thức không bổ xung pepton Kết quả thử nghiệm lên men chìm nhân sinh khối sợi nấm, trong 2 loại môi trường là Potato Dextrose Agar (PDA) bổ xung 0,5% pepton và môi trường Czapek - Dox bổ xung 0,5%

pepton thì môi trường PDA cho lượng sinh khối nấm cao hơn đạt 461,5 mg sợi nấm/50ml môi trường, trong điều kiện nhiệt độ 25 - 260C sau 8 ngày [27]

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về sử dụng chế phẩm nấm

có ích

2.5.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trong những năm gần đây, các công trình nghiên cứu ứng dụng nấm

Paecilomyces và Metarhizium rất phong phú và trải rộng khắp thế giới Trên thế giới đã ghi nhận được 146 loài nấm thuộc chi Paecilomyces Tại Trung

Quốc, tác giả Liang Z Q.(2005), đã thu thập và ghi nhận được 32 loài nấm

thuộc chi Paecilomyces Trong các loài nấm thuộc chi Paecilomyces thì loài

Paecilomyces javanicus, P fumosoroseus, P farinosus đã được sử dụng để

kiểm soát nhiều loại sâu hại cây trồng khác nhau như lúa, ngô, rau, hoa và cây cảnh trồng trong nhà kính và vườn ươm [25]

Các tác giả ở Mỹ, Bắc Mỹ và châu Mỹ la - tinh là người phải kể đến đầu tiên trong việc nghiên cứu về nấm có ích Ramosca trường Đại học

Kansas đã thí nghiệm nhân tạo gây dịch bệnh cho muỗi Culex quiquefaciates bằng vi khuẩn Bacillus thuringensis và nấm M anisopliae [26] Li và CS đã

sử dụng 6 chủng bao gồm: 1 chủng Beauveria bassiana, 2 chủng của Beauveria sp (N22 và T27), 3 chủng của M anisopliae (Tonga, 10B và MM773) để thử khả năng diệt loài mối nhà Coptotermes fomosanus [24]

Ở Mỹ, các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu và sử dụng nấm

Paecilomyces spp., M anisopliae và B bassiana trong việc phòng trừ nhiều

loại sâu hại, bao gồm sâu hại khoai tây, bông, lúa mì, đậu đỗ và ngô [7]

Ở Canada, đã nghiên cứu ứng dụng nấm Paecilomyces farinosus để

phòng trừ châu chấu hại lúa [23] và loài rệp hại vừng [32] và đã nghiên cứu

ứng dụng nấm M anisopliae để phòng trừ sâu ăn lá khoai tây, ngô (Agriotes obscurus) Hiệu quả diệt trừ loài sâu này đạt trên 90% trong điều kiện phòng

thí nghiệm [33]

Còn tại châu Mỹ la - tinh, các tác giả Bzasil đã có nhiều công trình

nghiên cứu với xu hướng sử dụng nấm Metarhizium và Beauveria để phòng

trừ côn trùng trong đất [28; 19; 24] Hiện nay, tại Bzazil các chế phẩm nấm ký sinh đã được ứng dụng tới vài triệu héc ta cây trồng

Ở châu Âu, các nước như Nga, Đức, Anh, Italy, Sec, Balan và Rumani

hầu như chỉ tập trung nghiên cứu và ứng dụng nấm Metarhizium anisopliae

để diệt côn trùng Tại Đức ứng dụng trong việc diệt mối đất, sâu vòi voi hại nho, tại Nga chế phẩm Boverin phòng trừ thành công bọ cánh cứng Colorado Beetle Nhiều nước trên thế giới như Úc, Brazil, Pháp, Colompioa, Venezuela,

… đã sản xuất thành công chế phẩm sinh học từ nấm M anisopliae, với tên

thương mại như Cobican, Bioplast, Metarquino, Biogreen, … [32]

Ở châu Á, các công trình nghiên cứu sử dụng nấm diệt côn trùng trên lúa và các cây trồng khác nhau ở Nhật Bản, Triều Tiên, Ấn Độ, Đài Loan Các tác giả ở

Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản đã sử dụng nấm Paecilomyces farinosus, Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae để phòng trừ sâu róm thông Dendrolimus punctate [18; 35], sâu đục thân (Li), châu chấu hại lúa Locusta migratoria [3] Tại Malaysia, đã nghiên cứu nấm Metarhizium anisopliae để

phòng trừ mối đất đạt hiệu quả 64,57% sau 14 ngày Philippines, đã nghiên cứu

sử dụng nấm Metarhizium anisopliae để diệt rầy nâu hại lúa, hiệu lực đạt 60%

sau 10 ngày [3]

Hiện nay, trên thế giới đã sản xuất sử dụng thành công nhiều loại chế

phẩm sinh học có nguồn gốc từ nấm Paecilomyces spp để phòng trừ nhiều loại sâu hại cây trồng quan trọng như sâu tơ (Plutella xyllostella) [36], sâu khoang (Spodoptera litura) hại rau thập tự [27; 20] và các loài bọ phấn (Bemisia tabaci, Bemisia argentifolii) hại cây trồng [34; 21] Các chế phẩm nấm Paecilomyces spp còn phòng trừ rất hiệu quả đối với rầy nâu (Nilaparvata lugens) hại lúa [22], rệp hại lúa mì (Diuraphis noxia) và các loại nhện Tetranychus urticae, Panonychus ulmi, hại cây ăn quả

2.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu sản xuất ứng dụng nấm

có ích để phòng trừ một số loại sâu hại quan trọng như rầy nâu hại lúa, sâu hại rau, cây ăn quả và cây công nghiệp [1]

Hướng ứng dụng nấm ký sinh công trùng để phòng trừ sâu hại cây trồng được đề cập đến trong những năm 70 của thế kỷ trước, nhưng trong 15 năm trở lại đây mới có nhiều công trình nghiên cứu được công bố về lĩnh vực này Các công trình nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng tại nước ta chủ yếu tập trung vào công tác thu thập chủng, phân lập các chủng giống bản địa và

phát triển sinh khối tạo chế phẩm sinh học phòng trừ các loại sâu mà bị chính chủng nấm đó ký sinh Từ năm 1996 đến nay, Trung tâm Đấu tranh sinh học - Viện Bảo vệ thực vật đã thu thập, phân lập, tạo thuần và tuyển chọn được 28

chủng (10 chủng Beauveria và 18 chủng Metahizium) trên các loại sâu hại

khác nhau tại các tỉnh phía Bắc và phía Nam Trong số đó, đã chọn được 4 chủng có hoạt lực diệt côn trùng rất cao và hiện đang sử dụng để sản xuất chế

phẩm là 2 chủng Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae ở phía Bắc, 2 chủng Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae ở phía Nam Đã sản xuất được 2.355kg Beauveria và 3.275kg Metarhizium sử dụng trừ sâu keo da

láng, sâu khoang ăn lá đậu tương và sâu xanh đục quả đậu xanh Hiệu quả của

Bauveria với sâu xanh là 68,2% - 72,3%, còn Metarhizium đạt 69,2 - 75,1% [7]

Viện Bảo vệ thực vật đã nghiên cứu và sử dụng nấm Metarhizium anisopliae để phòng trừ sâu hại cây trồng [17] Bào tử nấm Metarhizium có

khả năng gây chết trên 50% (LT50) cá thể các loại sâu bộ cánh vảy như sâu

xanh da láng Spodoptera exigua, sâu xanh Heliothis armigera với lượng là

105 bt/ml sau 48 giờ [3] Việt Nam cũng đã có sản phẩm với tên thương mại là

Mat chế từ nấm xanh Metarhizium anisopliae trừ bọ cánh cứng hại dừa và

Boverit trừ sâu róm thông và các loại sâu hại cây trồng khác [3]

Trên sâu hại rau, kết quả thí nghiệm trên cây cải bông ở Trà Lóc, Bình

Thủy, Cần Thơ cho thấy hai dòng nấm xanh M anisopliae chủng OM1 - R và

chủng OM3 - STO có hiệu lực trừ sâu tơ đạt tương ứng 75,3%; 67,4% và 76,1% Thí nghiệm trên cây cải xanh tại xã Thới Hạnh, huyện Cờ Đỏ, Cần

Thơ cho thấy hai chủng nấm M anisopliae và B bassiana có hiệu lực trừ sâu

rất cao tương ứng 97,8% và 96,1% Tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long,

chế phẩm Ometar từ chủng M anisopliae đã được ứng dụng rộng rãi để trừ

rầy nâu, bọ xít hại lúa, sâu hại rau thu được một số kết quả khả quan Ngoài

ra, hai chế phẩm Ometar và Biovip (từ nấm B bassiana) cũng có khả năng

phòng trừ rầy mềm hại khổ qua (60,4%), phấn trắng, sâu xanh sọc hại dưa leo (83,5% và 61,6%) [8] Kết quả nghiên cứu tại Kiến Xương, Thái Bình cho thấy

dòng nấm M anisopliae có hiệu lực trừ rầy lưng trắng đạt 74,7% và 76,1% với rầy nâu Hiệu lực trừ rầy nâu của P javanicus đạt 81,52% sau 17 ngày phun

trong nhà lưới và đạt 57,24% trên đồng ruộng 10 ngày sau phun [17]

Về công nghệ sản xuất, các cơ sở nghiên cứu ở trong nước đã ứng dụng

và phát triển các công nghệ đã có trên thế giới, trong đó chủ yếu là công nghệ

lên men xốp Đồng thời đã cải tiến một số khâu trong quy trình sản xuất cho

phù hợp với điều kiện của nước ta Đối với nấm M anisopliae và P javanicus

các tác giả đã sử dụng với nguyên liệu là tấm gạo, luộc rồi sấy khô, hỗn hợp với dịch CaCO3 0,5% để nhân lượng lớn sinh khối với lượng bào tử 3,2 x 109

bt/g Đối với nấm Paecilomyces spp Trung tâm Đấu tranh sinh học - Viện

Bảo vệ thực vật trong một vài năm trở lại đây đã quan tâm nghiên cứu một số chủng có tiềm năng trong phòng trừ sinh học đối với một số loại sâu miệng chích hút [17]

Phần 3 ĐỐI TƯƠNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

- Hai loài nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae từ

nguồn nấm Viện Bảo vệ thực vật

- Sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae) hại bắp cải thu thập tại nhà lưới

Viện Bảo vệ thực vật và được nhân nuôi trong phòng thí nghiệm

- Agar (Hạ Long, Việt Nam), Tween - 80 (Xilong, Trung Quốc)

- Đường glucose, sacharose … và một số hóa chất khác (Merck, Đức)

3.1.4 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường PDA (Potato Dextroza Agar) sử dụng phân lập nấm:

3.1.5 Phạm vi nghiên cứu

Các nghiên cứu được tiến hành trong phòng thí nghiệm và nhà lưới Trung tâm Đấu tranh sinh học, Viện Bảo vệ thực vật

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

- Địa điểm: Viện Bảo vệ thực vật

Phường Đức Thắng, Quận Bắc Từ Liêm, Hà Nội

- Thời gian: 1/3/2014 - 7/6/2014

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá khả năng gây chết sâu xanh bướm trắng hại rau họ hoa thập

tự của hai loài nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae từ

nguồn nấm Viện Bảo vệ thực vật

- Phân lập lại, làm thuần và tuyển chọn loài nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae có độc tính cao từ mẫu SXBT có nấm kí

sinh của thí nghiệm đánh giá ban đầu

- Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng của nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae đã tuyển chọn

- Nghiên cứu liều lượng thích hợp gây chết SXBT của loài nấm

Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae sau khi đã nhân sinh khối

trong phòng thí nghiệm

- Nghiên cứu liều lượng thích hợp gây chết SXBT của loài nấm

Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae sau khi đã nhân sinh khối

trong điều kiện nhà lưới

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Đánh giá khả năng ký sinh gây chết SXBT hại rau của một số nguồn nấm đã được phân lập tại Viện bảo vệ thực vật

Thí nghiệm đánh giá khả năng ký sinh gây chết SXBT hại rau của các dòng nấm ký sinh trong điều kiện phòng thí nghiệm được bố trí 4 công thức, mỗi công thức tương ứng với một dòng nấm đã phân lập được:

CT1: Nấm xanh lục: Metarhizium anisopliae

CT2: Nấm tím xám: Paecilomyces javanicus

CT3: Nấm trắng vôi: Beauveria bassiana

CT4: Đối chứng phun nước lã

Mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 cá thể sâu xanh bướm trắng tuổi 2 - 3 (10 sâu/ hộp/ lần nhắc) Phương pháp: Bắp cải sạch và khô được đặt trong hộp có lót giấy thấm ở dưới Thả 10 sâu tuổi 2 - 3/1 hộp/lần nhắc Để sâu ổn định trên thức ăn rồi tiến hành phun dịch nấm ướt trên mặt lá

và cơ thể sâu Pha, phun dịch nấm và lây nhiễm trên sâu xanh bướm trắng được tiến hành theo phương pháp gây nhiễm nhân tạo của phòng nghiên cứu Nấm và Côn trùng, Viện Bảo vệ thực vật

Nguồn sâu được nuôi tại phòng thí nghiệm VBVTV Hàng ngày thay thức ăn mới và đếm số sâu chết

Hiệu lực gây chết sâu được tính theo công thức Abbott, phương pháp tính toán hiệu quả thuốc diệt côn trùng của tác giả J Econ Entomol [40]

M% = Ca - Ta x 100

Ca

Trong đó: M: Tỷ lệ (%) chết

Ca: Số sâu sống ở công thức đối chứng sau thí nghiệm

Ta: Số sâu sống ở công thức thí nghiệm sau thí nghiệm

3.4.2 Phân lập lại, làm thuần và tuyển chọn dòng có độc lực cao

Phân lập lại, làm thuần

Phân lập lại, làm thuần nấm ký sinh trên SXBT hại rau họ hoa thập tự theo phương pháp nghiên cứu vi sinh thường áp dụng tại Việt nam [4; 12]

Tiến hành lấy nguồn nấm trên mẫu sâu nhiễm nấm cấy trên môi trường PDA có bổ sung kháng sinh Steptomyces

Bước 1: Nấu môi trường PDA với thành phần 200g khoai tây, 20g

Agar và 5g đường Dextrose trong 1000ml nước (khoai tây thái lát đun sôi ở

1000C trong thời gian 20 phút và lọc lấy dịch chiết sau đó cho agar và đường vào) Khử trùng môi trường PDA ở nhiệt độ 1210C (áp suất 1 atm) trong thời gian 30 phút, sau đó để nguội khoảng 45 - 50oC và bổ sung kháng sinh streptomycin 0,1% Đổ môi trường ra đĩa petri (đã được sấy khử trùng ở

250oC trong 2,5 giờ) và để nguội

Bước 2: Cấy phân lập mẫu nấm: Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn

lửa đèn cồn, sau đó làm nguội và chấm nhẹ vào điểm có bào tử đặc trưng của các nguồn nấm ký sinh trên cơ thể sâu Sau đó cấy ria lên bề mặt môi trường

Để đĩa môi trường đã cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm 5 - 7 ngày, thấy khuẩn lạc đặc trưng của nấm xuất hiện thì tiến hành cấy tách ra các đĩa môi trường khác nhau để làm thuần chủng bằng phương pháp tách đơn bào tử

Phương pháp tách đơn bào tử tạo dòng thuần nấm Paecilomyces javanicus

và Metarhizium anisopliae

Tạo dòng nấm thuần bằng phương pháp tách đơn bào tử trên đĩa thạch

WA Bằng cách dùng que cấy thuỷ tinh chấm nhẹ vào bề mặt khuẩn lạc có chứa bào tử, rồi cấy vào đĩa thạch môi trường WA Sau đó, dùng trang thuỷ tinh trang đều ra bề mặt đĩa thạch và để đĩa thạch đó trong điều kiện phòng thí nghiệm Sau khoảng 12 - 24 giờ tiến hành soi đĩa nấm đó bằng kính lúp để bàn để quan sát bào tử nấm nảy mầm Khi thấy bào tử nảy mầm, dùng que cấy

có đầu nhọn hình lưỡi mác cắt riêng phần thạch chứa bào tử đó cấy sang đĩa môi trường khác, sau đó để đĩa có chứa đơn bào tử đó trong điều kiện phòng

thí nghiệm

Đánh giá tuyển chọn các chủng Paecilomyces javanicus và Metarhizium

anisopliae có độc tính cao đối với sâu hại

Các chủng nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae sau khi phân lập được thì tiến hành nuôi cấy trên môi trường ống giống PDA làm nguồn thực liệu ban đầu

Phương pháp pha dung dịch nấm để thí nghiệm được tiến hành như sau: Dùng 3ml nước cất cộng thêm 0,01% dung môi hoà tan (Agral) đổ vào

ống giống nấm Lắc ống giống, sao cho bào tử phân bố đều trong nước Lấy 1ml dung dịch trên đếm số lượng bào tử trong 1ml với phương pháp pha loãng theo cơ số 10 (pha loãng 3 lần) Tiến hành đếm số bào tử trên buồng đếm hồng cầu

Thí nghiệm nhà lưới được bố trí với các công thức lây nhiễm tương

ứng với mỗi chủng nấm Paecilomyces javanicus và M anisopliae đã phân

lập Các công thức thí nghiệm (tương ứng với các chủng nấm đã phân lập được) đều phun cùng một nồng độ 5 108

bào tử/ml và được bổ sung 0,1% Tween - 80 tăng khả năng bám dính Mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc là một cây bắp cải thả 10 con sâu tuổi 2 - 3 và đối chứng phun nước lã

Hàng ngày, đếm số lượng sâu chết ở từng lần nhắc lại của mỗi công thức

Hiệu lực gây chết sâu tính theo công thức Abbott

3.4.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng của nấm Paecilomyces javanicus

và Metarhizium anisopliae

3.4.3.1 Xác định môi trường thích hợp nhân sinh khối nấm

+ Với nấm Peacilomyces javanicus

Thí nghiệm được tiến hành với 4 công thức môi trường nuôi cấy (MT) khác nhau với gồm:

1/MT1: Bột ngô mảnh 80 gram + bã đậu phụ 20 gram

2/MT2: Cám gạo 50 gram + bột ngô mảnh 30 gram + bã bia khô 20 gram 3/MT3: Cám gạo 60 gram + bột ngô mảnh 30 gram + bột đậu nành 10 gram 4/MT4: Gạo hấp chín 100 gram

+ Với nấm Metarhizium anisopliae

Thí nghiệm được tiến hành với 3 công thức môi trường nuôi cấy (MT) khác nhau, gồm:

1/MT1: Cám gạo 50 gram + bột ngô mảnh 40 gram + bột đậu nành 10 gram 2/MT2: Gạo hấp chín 100 gram

3/MT3: Cám gạo 60 gram + bột ngô mảnh 30 gram + bã bia 10 gram Mỗi công thức tiến hành 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là 1 bình tam giác có chứa 100 gram môi trường và 70ml nước Môi trường được trộn theo các tỷ lệ trên, chứa trong bình tam giác và hấp trong 1210C, áp suất 1 atm trong 30 phút Sau đó để nguội, rồi cấy mỗi bình tam giác 1 ống giống nấm và

để trong điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm

Sau 10 ngày nuôi cấy thì tiến hành xác định số lượng bào tử bằng phương pháp pha loãng sinh khối và đếm trực tiếp số lượng bào tử trên kính hiển vi thông qua buồng đếm hồng cầu [39]

Phương pháp pha loãng, đếm số lượng bào tử theo phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi trong buồng đếm hồng cầu:

Lấy 1 gram sinh khối hòa trong 9 ml nước cất và lắc đều được nồng độ pha loãng 10-1 Lấy 1 ml dung dịch đã pha loãng hoà trong 9 ml nước cất được nồng độ pha loãng 10-2

, Tiếp tục làm như vậy cho đến khi nồng độ pha loãng là 10-3 Nhỏ 1 giọt dung dịch vào buồng đếm hồng cầu, đậy lamen Đặt buồng đếm hồng cầu vào kính hiển vi quang học, đếm số lượng bào tử trong mỗi ô Cấu tạo của buồng đếm hồng cầu gồm hai loại: Một loại có 25 ô lớn,

mỗi ô có 16 ô nhỏ, còn một loại có 16 ô lớn, mỗi ô lớn có 25 ô nhỏ Cả hai loại đều có tổng cộng là 400 ô nhỏ Chúng tôi sử dụng loại 1, tức là loại có 25

ô lớn, mỗi ô có 16 ô nhỏ Lượng bào tử trong 1gram sinh khối nấm được tính theo công thức:

A = a x 400 x 10

n

x 10.000

B x b Trong đó: A là số bào tử / gram sinh khối nấm

a là tổng số bào tử của các ô

B là số ô lớn của buồng đếm

b là số ô nhỏ trong mỗi ô lớn

n là số lần pha loãng

3.4.3.2 Xác định nhiệt độ thích hợp để nhân sinh khối chế phẩm

+ Với nấm Peacilomyces javanicus

Thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp được bố trí với 3 công thức tương ứng với 3 ngưỡng nhiệt độ:

+ Với nấm Metarhizium anisopliae

Thí nghiệm được tiến hành với 3 công thức tương ứng với 3 mức nhiệt

độ khác nhau trong phòng thí nghiệm Cụ thể là:

sau đó để nguội và cấy giống vào bình tam giác rồi đặt ở các mức nhiệt độ khác nhau Sau 10 ngày nuôi cấy, kiểm tra số lượng bào tử ở các công thức bằng phương pháp pha loãng đếm số lượng bào tử trên buồng đếm hồng cầu

3.4.4 Đánh giá hiệu quả gây chết sâu ở nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae ở các liều lượng khác nhau

Các chủng nấm Paeccilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae có

độc tính cao đã tuyển chọn được nhân sinh khối trên môi trường gạo hấp khử trùng Sau 10 ngày lấy nguồn sinh khối nấm đánh giá hiệu quả gây chết SXBT với các liều lượng khác nhau

Thí nghiệm được bố trí trong phòng thí nghiệm và nhà lưới Viện Bảo vệ

thực vật với các công thức (CT), tương ứng với các liều lượng phun khác nhau

3.4.4.1 Thí nghiệm tiến hành trong phòng

+ Với nấm Peacilomyces javanicus

Công thức 1: 1,0 x 108 bào tử/ml

Công thức 2: 1,5 x 108 bào tử/ml

Công thức 3: 2,0 x 108 bào tử/ml

Công thức 4: Đối chứng phun nước lã

Bố trí sâu tuổi 2 - 3, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, một lần nhắc lại 10 sâu/hộp Pha, phun chế phẩm theo phương pháp lây nhiễm nhân tạo của Viện Bảo vệ thực vật: Bắp cải sạch và khô được đặt trong hộp có lót giấy thấm ở dưới Thả 10 sâu tuổi 2 - 3/1 hộp/lần nhắc Để sâu ổn định trên thức ăn rồi tiền hành phun chế phẩm ướt trên mặt lá và cơ thể sâu

Hàng ngày thay thức ăn mới cho sâu Hiệu lực gây chết sâu của chế phẩm được tính theo công thức Abbott

+ Với nấm Metarhizium anisopliae

Cũng làm tương tự như trên với 4 công thức

3.4.4.2 Thí nghiệm ngoài nhà lưới

+ Với nấm Paecylomyces javanicus

Thí nghiệm được bố trí trong điều kiện nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật với 4 công thức (CT), tương ứng với các liều lượng phun khác nhau

Công thức 1: 1,0 x 108 bào tử/ ml

Công thức 2: 1,5 x 108 bào tử/ ml

Công thức 3: 2,0 x 108 bào tử/ml

Công thức 4: Đối chứng phun nước lã

Phương pháp pha, phun chế phẩm để được nồng độ 2,0 x 10 8 bào tử/ml (áp dụng phương pháp của phòng nghiên cứu Nấm và Côn trùng, Viện Bảo vệ thực vật):

Mật độ bắp cải trồng 30000 cây/1ha Lượng nước tương ứng là 600 lít

Cân 10 gram chế phẩm nấm P javanicus hòa với 90 ml nước, bổ sung

chất bám dính Tween - 80 0,1% Dùng đũa khuấy đều để bào tử tách hết ra khỏi cơ chất Sau đó lọc dung dịch chế phẩm qua lớp vải màn và cho vào bình phun tay Trước khi phun tiến hành phun thử vào bình định mức để xác định số lần phun đạt 20 ml trên cây Pha chế phẩm tương tự với các nồng độ còn lại

Bắp cải được trồng trong chậu và được đặt trong lồng Tiến hành thả SXBT vào cây bắp cải để đến khi sâu ổn định trên cây thì tiến hành phun 20

ml dịch nấm đã pha với các nồng độ khác nhau lên mỗi cây Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần thử nghiệm 10 sâu tuổi 2 - 3 trên 1 cây bắp cải

Theo dõi mật độ SXBT sau 5, 7, 10 ngày phun Hiệu lực gây chết sâu xanh bướm trắng của chế phẩm được tính theo công thức Abbott

+ Với nấm Metarhizium anisopliae

Thí nghiệm được bố trí trong điều kiện nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật với 4 công thức (CT), tương ứng với các liều lượng phun khác nhau

CT1: 0,5 x 108 bt/ml

CT2: 0,75 x 108 bt/ml

CT3: 1,0 x 108 bt/ml

CT4: Đối chứng phun nước lã

Mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại thử nghiệm 10 cá thể sâu tuổi 2 - 3 trên 1 cây bắp cải