và Metarhizium anisopliae
3.4.3.1. Xác định môi trường thích hợp nhân sinh khối nấm
+ Với nấm Peacilomyces javanicus
Thí nghiệm được tiến hành với 4 công thức môi trường nuôi cấy (MT) khác nhau với gồm:
1/MT1: Bột ngô mảnh 80 gram + bã đậu phụ 20 gram.
2/MT2: Cám gạo 50 gram + bột ngô mảnh 30 gram + bã bia khô 20 gram. 3/MT3: Cám gạo 60 gram + bột ngô mảnh 30 gram + bột đậu nành 10 gram. 4/MT4: Gạo hấp chín 100 gram.
+ Với nấm Metarhizium anisopliae
Thí nghiệm được tiến hành với 3 công thức môi trường nuôi cấy (MT) khác nhau, gồm:
1/MT1: Cám gạo 50 gram + bột ngô mảnh 40 gram + bột đậu nành 10 gram. 2/MT2: Gạo hấp chín 100 gram.
3/MT3: Cám gạo 60 gram + bột ngô mảnh 30 gram + bã bia 10 gram. Mỗi công thức tiến hành 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là 1 bình tam giác có chứa 100 gram môi trường và 70ml nước. Môi trường được trộn theo các tỷ lệ trên, chứa trong bình tam giác và hấp trong 1210C, áp suất 1 atm trong 30 phút. Sau đó để nguội, rồi cấy mỗi bình tam giác 1 ống giống nấm và để trong điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm.
Sau 10 ngày nuôi cấy thì tiến hành xác định số lượng bào tử bằng phương pháp pha loãng sinh khối và đếm trực tiếp số lượng bào tử trên kính hiển vi thông qua buồng đếm hồng cầu [39].
Phương pháp pha loãng, đếm số lượng bào tử theo phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi trong buồng đếm hồng cầu:
Lấy 1 gram sinh khối hòa trong 9 ml nước cất và lắc đều được nồng độ pha loãng 10-1. Lấy 1 ml dung dịch đã pha loãng hoà trong 9 ml nước cất được nồng độ pha loãng 10-2, Tiếp tục làm như vậy cho đến khi nồng độ pha loãng là 10-3. Nhỏ 1 giọt dung dịch vào buồng đếm hồng cầu, đậy lamen. Đặt buồng đếm hồng cầu vào kính hiển vi quang học, đếm số lượng bào tử trong mỗi ô. Cấu tạo của buồng đếm hồng cầu gồm hai loại: Một loại có 25 ô lớn,
mỗi ô có 16 ô nhỏ, còn một loại có 16 ô lớn, mỗi ô lớn có 25 ô nhỏ. Cả hai loại đều có tổng cộng là 400 ô nhỏ. Chúng tôi sử dụng loại 1, tức là loại có 25 ô lớn, mỗi ô có 16 ô nhỏ. Lượng bào tử trong 1gram sinh khối nấm được tính theo công thức:
A = a x 400 x 10 n
x 10.000 B x b
Trong đó: A là số bào tử / gram sinh khối nấm. a là tổng số bào tử của các ô.
B là số ô lớn của buồng đếm. b là số ô nhỏ trong mỗi ô lớn. n là số lần pha loãng.
3.4.3.2. Xác định nhiệt độ thích hợp để nhân sinh khối chế phẩm
+ Với nấm Peacilomyces javanicus
Thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp được bố trí với 3 công thức tương ứng với 3 ngưỡng nhiệt độ:
CT1: Để ở 200 C - 230C CT2: Để ở 250 C - 270C CT3: Để ở 300 C - 330C
Sử dụng môi trường nuôi cấy gạo hấp chín. Mỗi công thức tiến hành nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại là một bình tam giác chứa 100 gram môi trường. Môi trường được hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút (áp suất 1atm), sau đó để nguội rồi cấy giống vào bình tam giác và đặt ở các mức nhiệt độ khác nhau. Sau 10 ngày nuôi cấy, kiểm tra số lượng bào tử ở các công thức bằng phương pháp pha loãng đếm số lượng bào tử trên buồng đếm hồng cầu.
+ Với nấm Metarhizium anisopliae
Thí nghiệm được tiến hành với 3 công thức tương ứng với 3 mức nhiệt độ khác nhau trong phòng thí nghiệm. Cụ thể là:
CT1: Để ở 200 C - 230C CT2: Để ở 250 C - 270C CT3: Để ở 300 C - 330C
Sử dụng môi trường nuôi cấy gạo hấp chín. Mỗi công thức tiến hành nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại là một bình tam giác chứa 100 gram môi trường. Môi trường được hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút (áp suất 1atm),
sau đó để nguội và cấy giống vào bình tam giác rồi đặt ở các mức nhiệt độ khác nhau. Sau 10 ngày nuôi cấy, kiểm tra số lượng bào tử ở các công thức bằng phương pháp pha loãng đếm số lượng bào tử trên buồng đếm hồng cầu.
3.4.4. Đánh giá hiệu quả gây chết sâu ở nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae ở các liều lượng khác nhau.
Các chủng nấm Paeccilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae có độc tính cao đã tuyển chọn được nhân sinh khối trên môi trường gạo hấp khử trùng. Sau 10 ngày lấy nguồn sinh khối nấm đánh giá hiệu quả gây chết SXBT với các liều lượng khác nhau.
Thí nghiệm được bố trí trong phòng thí nghiệm và nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật với các công thức (CT), tương ứng với các liều lượng phun khác nhau.
3.4.4.1. Thí nghiệm tiến hành trong phòng
+ Với nấm Peacilomyces javanicus Công thức 1: 1,0 x 108 bào tử/ml Công thức 2: 1,5 x 108 bào tử/ml Công thức 3: 2,0 x 108 bào tử/ml Công thức 4: Đối chứng phun nước lã
Bố trí sâu tuổi 2 - 3, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, một lần nhắc lại 10 sâu/hộp. Pha, phun chế phẩm theo phương pháp lây nhiễm nhân tạo của Viện Bảo vệ thực vật: Bắp cải sạch và khô được đặt trong hộp có lót giấy thấm ở dưới. Thả 10 sâu tuổi 2 - 3/1 hộp/lần nhắc. Để sâu ổn định trên thức ăn rồi tiền hành phun chế phẩm ướt trên mặt lá và cơ thể sâu.
Hàng ngày thay thức ăn mới cho sâu. Hiệu lực gây chết sâu của chế phẩm được tính theo công thức Abbott.
+ Với nấm Metarhizium anisopliae
Cũng làm tương tự như trên với 4 công thức. CT1: 0,5 x 108 bào tử/ml
CT2: 0,75 x 108 bào tử/ml CT3: 1,0 x 108 bào tử/ml CT4: Đối chứng phun nước lã
3.4.4.2. Thí nghiệm ngoài nhà lưới
+ Với nấm Paecylomyces javanicus
Thí nghiệm được bố trí trong điều kiện nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật với 4 công thức (CT), tương ứng với các liều lượng phun khác nhau.
Công thức 1: 1,0 x 108 bào tử/ ml Công thức 2: 1,5 x 108 bào tử/ ml Công thức 3: 2,0 x 108 bào tử/ml Công thức 4: Đối chứng phun nước lã
Phương pháp pha, phun chế phẩm để được nồng độ 2,0 x 108 bào tử/ml (áp dụng phương pháp của phòng nghiên cứu Nấm và Côn trùng, Viện Bảo vệ thực vật):
Mật độ bắp cải trồng 30000 cây/1ha. Lượng nước tương ứng là 600 lít. Cân 10 gram chế phẩm nấm P. javanicus hòa với 90 ml nước, bổ sung chất bám dính Tween - 80 0,1%. Dùng đũa khuấy đều để bào tử tách hết ra khỏi cơ chất. Sau đó lọc dung dịch chế phẩm qua lớp vải màn và cho vào bình phun tay. Trước khi phun tiến hành phun thử vào bình định mức để xác định số lần phun đạt 20 ml trên cây. Pha chế phẩm tương tự với các nồng độ còn lại.
Bắp cải được trồng trong chậu và được đặt trong lồng. Tiến hành thả SXBT vào cây bắp cải để đến khi sâu ổn định trên cây thì tiến hành phun 20 ml dịch nấm đã pha với các nồng độ khác nhau lên mỗi cây. Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần thử nghiệm 10 sâu tuổi 2 - 3 trên 1 cây bắp cải.
Theo dõi mật độ SXBT sau 5, 7, 10 ngày phun. Hiệu lực gây chết sâu xanh bướm trắng của chế phẩm được tính theo công thức Abbott.
+ Với nấm Metarhizium anisopliae
Thí nghiệm được bố trí trong điều kiện nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật với 4 công thức (CT), tương ứng với các liều lượng phun khác nhau.
CT1: 0,5 x 108 bt/ml CT2: 0,75 x 108 bt/ml CT3: 1,0 x 108 bt/ml
CT4: Đối chứng phun nước lã
Mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại thử nghiệm 10 cá thể sâu tuổi 2 - 3 trên 1 cây bắp cải.
Phương pháp pha, phun chế phẩm để được nồng độ 1,0 x 108 bào tử/ml:
Tương tự như phương pháp pha, phun chế phẩm nấm P. javanicus với liều lượng khác nhau trong nhà lưới.
Theo dõi mật độ sâu trước và sau phun 5, 7, 10 ngày. Tính hiệu lực gây chết sâu theo công thức Abbott.
3.5. Các chỉ tiêu theo dõi
- Đếm số lượng bào tử của hai chủng nấm, so sánh và xác định loại môi trường nào nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae sinh lượng bào tử lớn nhất đối với thí nghiệm xác định môi trường thích hợp nhất để nhân sinh khối nấm.
- Với thí nghiệm đánh giá hiệu lực gây chết sâu của một số chủng nấm
Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae trong điều kiện trong phòng thí nghiệm và nhà lưới: Theo dõi số sâu chết có sự hiện diện của nấm, ghi chép nhiệt độ, ẩm độ trong phòng thí nghiệm và thay thức ăn mới hàng ngày.
3.5. Tính toán và xử lý số liệu
- Các số liệu theo dõi được tính toán và xử lí theo chương trình Microsoft Office Excel, Statistix 8.2.
Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Đánh giá khả năng ký sinh sâu hại của một số nguồn nấm đã thu thập được tại Viện Bảo vệ thực vật. thập được tại Viện Bảo vệ thực vật.
Các nấm có ích trong thiên nhiên có khả năng diệt côn trùng gây hại trên cây trồng nhờ vào quá trình đấu tranh sinh học. Ba chủng nấm
Metarhizium anisopliae, Peacilomyces javanicus và Beauveria bassiana thu
thập được của Viện Bảo vệ thực vật đã có nhiều nghiên cứu trên các đối tượng sâu khoang, sâu tơ hại rau… nhưng chưa nghiên cứu trên sâu xanh bướm trắng (SXBT). Do đó, đề tài đã tiến hành sử dụng ba chủng nấm trên lây nhiễm trên sâu xanh bướm trắng để đánh giá khả năng diệt SXBT hại rau họ hoa thập tự và tỷ lệ ký sinh trở lại gây chết sâu. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.1 và 4.2 dưới đây:
Bảng 4.1. Kết quảđánh giá khả năng diệt sâu của một số nguồn nấm
đã thu thập được tại Viện Bảo vệ thực vật Chủng nấm Số sâu TB trướ c phun (con)
Số sâu sống trung bình các ngày sau phun
T0C A% 5NSP 7NSP 10NSP Số sâu sống (con) Hiệ u lực (%) Số sâu sống (con) Hiệ u lực (%) Số sâu sống (con) Hiệ u lực (%) M. anisopliae 10 8,0 b 20,0 4,7b 51,7 3,3b 64,3 24, 3 85, 6 P. javanicus 10 8,7ab 13,3 5,3b 44,8 4,0b 57,1 B. bassiana 10 9,0ab 10,0 5,7b 41,4 4,7b 50,0 ĐC 10 10,0a - 9,7a - 9,3a - CV% 2,7 3,4 3,6 LSD 0,05 1,9 1,5 1,5
Ghi chú: a, b là chỉ số thể hiện sự sai khác khi so sánh, xử lí số liệu thống kê bằng phần mềm Statistix 8.2. Trong đó, theo cột dọc, các công thức có chỉ số giống nhau thể hiện sự sai khác không có ý nghĩa thống kê ở mức 95%. Những công thức có chỉ số khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức 95%.
Hình 4.1. Khả năng diệt sâu của một số nguồn nấm thu thập được tại Viện Bảo vệ thực vật.
Kết quả đánh giá khả năng diệt sâu của một số nguồn nấm đã thu thập được tại Viện Bảo vệ thực vật trên đối tượng SXBT (bảng 4.1) cho thấy: Hiệu lực trừ SXBT của 3 loài nấm là có ý nghĩa so với đối chứng. Như vậy, cả 3 loài nấm đều có khả năng trừ SXBT trong phòng thí nghiệm. Trong đó,
Metarhizium anisopliae có hiệu lực trừ sâu cao nhất đạt 51,7% sau 7 ngày lây
nhiễm và đạt 64,3% sau 10 ngày lây nhiễm. Nấm Paecilomyces javanicus cho hiệu quả diệt sâu đứng thứ hai đạt 57,1% sau 10 ngày lây nhiễm. Nấm
Beauveria bassiana cho hiệu quả diệt sâu thấp nhất, chỉ đạt 50% sau 10 ngày.
Mặc dù, sự sai khác về hiệu lực trừ SXBT của ba loài nấm này không có ý nghĩa thống kê ở mức 95% nhưng qua quá trình theo dõi thí nghiệm, nhận thấy hai nấm M. anisopliae và P. javanicus có triển vọng trong việc trừ SXBT hại rau họ hoa thập tự.
Bảng 4.2. Tỷ lệ ký sinh trở lại gây chết SXBT của một số nguồn nấm đã thu thập được tại Viện Bảo vệ thực vật Chủng nấm Số sâu thử nghiệm TB (con) Số sâu có nấm ký sinh sau 10 ngày (con) Tỷ lệ ký sinh trở lại (%) T 0 C A% M. anisopliae 10 5,3a 80,0 24,3 85,6 P. javanicus 10 4,7ab 77,8 B. bassiana 10 4,0b 75,0 ĐC 10 0c - CV% 3,71 LSD 0,05 1,1
Ghi chú: a, b, c là chỉ số thể hiện sự sai khác khi xử lí số liệu thống kê bằng phần mềm Statistix 8.2. Trong đó, theo cột dọc, các công thức có chỉ số giống nhau thể hiện sự sai khác không có ý nghĩa thống kê ở mức 95%. Những công thức có chỉ số khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức 95%.
T0C: Nhiệt độ trung bình, A%: Độẩm không khí trung bình.
Hình 4.2. Tỷ lệ ký sinh trở lại trên SXBT của một số nguồn nấm thu thập
Kết quả đánh giá khả năng ký sinh trở lại trên SXBT của ba loài nấm (bảng 4.2) trong phòng thí nghiệm Viện Bảo vệ thực vật cho thấy: Tỷ lệ ký sinh gây chết trở lại của loài M. anisopliae sau 10 ngày là 80,0% so với P.
javanicus là 77,8% và B. basiana có tỷ lệ ký sinh trở lại thấp nhất chỉ đạt 75,0% (nhiệt độ 24,3 và ẩm độ 85,6). Sự sai khác về tỷ lệ ký sinh trở lại của nấm M. anisopliae là có ý nghĩa so với nấm B. bassiana và đối chứng. Như vậy, từ bảng 4.1 và 4.2, có thể nhận thấy: Nấm M. anisopliae và P. javanicus có hiệu lực trừ SXBT và tỷ lệ kí sinh trở lại SXBT cao trong phòng thí nghiệm. Điều này hé mở khả năng sử dụng chúng trong phòng trừ SXBT hại rau họ hoa thập tự trên đồng ruộng. Đề tài lựa chọn, tiến hành phân lập và tuyển chọn dòng có độc tính cao từ hai loài nấm M. anisopliae và P.
javanicus để tăng khả năng phòng trừ SXBT hại rau họ hoa thập tự.
4.2. Đánh giá tuyển chọn chủng nấm Metarhizium anisopliae và Peacylomyces javanicus có độc tính cao sau khi đã phân lập lại và làm thuần. javanicus có độc tính cao sau khi đã phân lập lại và làm thuần.
Từ kết quả đánh giá khả năng diệt sâu và tỷ lệ kí sinh trở lại của ba chủng nấm ở thí nghiệm trên. Tôi tiến hành phân lập, tuyển chọn được 4 chủng thuần là Pae-SXBT1, Pae-SXBT2 (thuộc loài P. javanicus) và Ma- SXBT1, Ma-SXBT2 (thuộc loài M. anisopliae). Bốn chủng này tiếp tục được nghiên cứu đặc điểm hình thái và hiệu lực phòng trừ SXBT hại rau họ hoa thập tự để tuyển chọn dòng có độc tính cao. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái được thể hiện ở bảng 4.3 và hiệu lực phòng trừ SXBT trong điều kiện nhà lưới được thể hiện ở bảng 4.4 và 4.5 dưới đây:
Bảng 4.3. Đặc điểm hình thái cơ bản của P. javanicus và M. anisopliae ký
sinh trên sâu hại
Loài nấm Đặc điểm sâu chết Đặc điểm ký sinh của nấm trên SXBT Khuẩn lạc Hình dạng cành bào tử Hình dạng bào tử P. javanicus Đầu tiên sâu ngừng vận động 2 - 3 ngày hoặc một tuần… Cơ thể chuyển màu hồng, sau 1 - 2 ngày thì thấy xuất hiện hệ sợi bông xốp trên cơ thể sâu, hệ sợi màu trắng sau chuyển màu tím xám. Trên SXBT, hệ sợi nấm bông xốp, tạo cục xoáy bện với nhau. Ban đầu trắng đục, sau chuyển màu tím xám. - Khuẩn lạc trên PDA ban đầu màu trắng đục, sau màu trắng tía đến tím nhạt sau 7 ngày, cuối cùng chuyển tím xám sau 9 ngày nuôi. - Mặt sau khuẩn lạc màu kem sữa. - Cuống sinh bào tử từ sợi nấm dinh dưỡng có chiều 40 - 60 µm, một số cuống hình thành từ sợi khí sinh với kích thước bằng ½ cuống sinh ra từ sợi nấm sinh dưỡng. - Trên cuống sinh bào tử trần hình thành điểm sinh thể bình, mỗi điễm có 1 - 3 thể bình, kích thước 2,5 - 3 x 7,5 - 9 µm, thể bình có